Допамин четко регулируется в ядрах мозга, в которых содержатся клетки тела и дендриты нейронов допамина. Здесь мы опишем вскрытия и образец обработки подход для достижения максимальных результатов, и, следовательно, выводы и понимание, на допамин регулирования в мозге зародышей черной субстанции (SN) и вентральной области покрышки (VTA) у грызунов.
Допамин является активно изучал нейромедиатор в ЦНС. В самом деле, его участие в двигательной активности и вознаграждение поведения, связанного способствовала пять десятилетий исследования в области молекулярной недостатки, связанные с регулированием допамина. Большинство из этих запросов допамина регулирования в мозгу внимание на молекулярные основы ее регулирования в терминале поле регионах нигростриатной и mesoaccumbens пути, стриатуме и прилежащем ядре. Кроме того, такие исследования были сконцентрированы на анализе содержания допамина ткани с нормализацией только сырого веса ткани. Исследование белков, которые регулируют допамина, такие, как тирозин гидроксилазы (TH) белка, TH фосфорилирования, переносчика дофамина (DAT), и везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) белок часто не включают в себя анализ содержания дофамина в тканях и того же образца. Умение анализировать и содержание дофамина ткани и ее регулирующих белков (в том числе пост-траnslational модификации) не только дает присущее власти интерпретации отношений допамина с уровнем белка и функции TH, DAT, или VMAT2, но распространяется также образцы экономики. Это приводит к меньшей стоимости, и тем не менее дает полное представление о молекулярной регуляции допамина практически в любой парадигме выбор следователей.
Мы ориентируемся анализа в мозге. Несмотря на то, СН и ВТА, как правило, игнорируется в большинстве исследований дофамина регулирования, эти ядра легко расчлененный с практикой. Всеобъемлющего считывания содержания допамина ткани и TH, DAT, или VMAT2 может быть проведена. Там в растущей литературы о влиянии функции дофамина в СН и ВТА на поведение, и impingements экзогенных веществ или болезненных процессов в нем 1-5. Кроме того, такие соединения, как факторы роста оказывают глубокое влияние на допамин и дофамин-регулирование белков, в сравнительно большей степени в SN или VTA <sup> 6-8. Таким образом, эта методика представлена в справочных лабораторий, которые хотят расширить свои вопросы о том, как конкретные процедуры модулировать поведение и дофамина регулирования. Здесь, многоступенчатый метод представлен анализ содержания допамина ткани, белка ТД, DAT, или VMAT2 и TH фосфорилирования из черной субстанции и VTA от грызунов мозга. Анализ TH фосфорилирования может принести значительные понимание не только как TH деятельность регулируется, но и сигнальные каскады, пострадавших в somatodendritic ядер в данной парадигме.
Проиллюстрируем вскрытия техника для разделения этих двух ядер и обработки образцов из расчлененных ткани, которая производит профиль выявления молекулярных механизмов регуляции допамина в естественных условиях, характерных для каждого ядра (рис. 1).
Как указано на рисунке 1, описанные выше методы должны дать показания нескольких дофамина и его регулирующие белки TH, DAT, и VMAT2 от одного образца СН или VTA получены либо из крысы или мыши. Опять же, выгоды от проведения этого протокола в том, что следователь может получить оперативно подобр…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этой работы, а также привел 2,10, была представлена, в частности, на исследование предоставляет гранты на MF Сальваторе от Американской федерации по проблемам старения исследований, Эдвард П. Stiles Целевого фонда и фонда биомедицинских исследований Северо-Западной Луизианы, и BS Pruett от Айк Muslow Predoctoral стипендий, ЛГУ Health Sciences Center-Шривпорт.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
|
Copper II Sulfate Solution |
|
3X Sample Buffer |
|
1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
Ponceau |
|
.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.