Summary
Насекомое гемоцитов выполнять многие важные функции, как иммунные и не иммунные, на всех этапах развития насекомых. Наши нынешние знания гемоцитов типов и функции в исследованиях на насекомых генетических моделей. Здесь мы представляем метод для извлечения, количественной оценки и визуализации гемоцитов от диких гусениц.
Abstract
Насекомое гемоцитов (эквивалент млекопитающих белых клеток крови) играет важную роль в ряде физиологических процессов протяжении всего жизненного цикла насекомого 1. В личиночной стадии насекомых, принадлежащих к приказу чешуекрылых (бабочек) и двукрылых (истинные мухи), гемоцитов формируются из лимфатических желез (специализированных кроветворных органов) или эмбриональных клеток и может быть доведена до взрослой стадии. Эмбриональные гемоцитов участвуют в миграции клеток в процессе развития и хемотаксис регулирования при воспалении. Они также принимают участие в апоптоз клеток и необходимы для эмбриогенеза 2. Гемоциты посредником сотовой руку насекомых врожденного иммунного ответа, который включает в себя несколько функций, таких как сотовые распространения, агрегация клеток, образование узелков, фагоцитозу и инкапсуляции иноземных захватчиков 3. Они также несут ответственность за организацию конкретных насекомых гуморальной защиты во время инфекции, такие как PRoduction антимикробных пептидов и других эффекторных молекул 4, 5. Гемоцитов морфологии и функции в основном были изучены генетические или физиологические насекомых моделей, в том числе плодовой мухи, дрозофилы 6, 7, комары Aedes Aegypti и Anopheles gambiae 8, 9 и табачных hornworm, Manduca Sexta 10, 11. Тем не менее, мало информации, в настоящее время существует около разнообразие, классификация, морфология и функция гемоцитов в не-моделью видов насекомых, особенно те, собранных в дикой природе 12.
Здесь мы опишем простой и эффективный протокол для извлечения гемоцитов от диких гусениц. Мы используем предпоследнего возраста Lithacodes фасциола (желто-плечи пули моль) (рис. 1) и Euclea delphinii (колючий дуб пули) гусеницы (Lepidoptera: Limacodidae) и показать, что достаточных объемов гемолимфы (крови насекомых)могут быть выделены и гемоцитов номера отсчитывается от отдельных личинок. Этот метод может быть использован для эффективного изучения типов гемоцитов в этих видов, а также в других смежных гусениц чешуекрылых собрали с поля, или он может быть легко сочетается с иммунологических анализов предназначен для исследования гемоцитов функции после инфекции микроорганизмов или паразитов 13.
Protocol
1. Подготовка материала
- Подготовка иглы (1-2 мкм и чаевые 3-4 конус мм) с использованием боросиликатного стеклянные капилляры и съемник микропипетки. Инструмент настройки: рампа: 561; скорость: 20; тепла: 560; Задержка: 1; тяга: 100; Давление: 500.
- Подготовить коллекцию решения: 60% Средний Грейс (GM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 20% антикоагулянтов буфера (98 мМ NaOH, 186 мм NaCl, 1,7 мМ ЭДТА и 41 мМ лимонной кислоты, рН 4,5 ). Данный раствор готовят свежую в стерильных условиях и держали на льду в любое время.
- Приготовьте раствор инкубационного буфера: 90% GM дополнен с 10% FBS. Это решение также готовится свежий и держали на льду в любое время.
- Подготовка общей сложности не менее 15 мкл × количество насекомых для сбора и инкубации решений.
2. Инъекции Гусеницы с коллекцией решение
- Anesthetize предпоследнем модулисмолы личинок путем охлаждения их на льду в течение 20 мин до гемоцитов добычи.
- Установить тупым концом чистой капиллярной иглой (16-калибра) в НКТ, который подключен к 20 мл стеклянный шприц (рис. 2). Оставьте пробирку, содержащую коллекцию решение открыть на лабораторном столе и медленно заполнить капилляр с буфером. Капиллярная, как правило, заполнены примерно на 10-15 мкл коллекции решение, в зависимости от размера гусеницы (около 1 мкл раствора на 10 мг гусеницы общей массы тела = 0,01% от общей массы тела). Поместите иглу на мяч из глины, которая находится рядом с рассекает микроскопом.
- Поместите гусеницы в чашке Петри. Насекомого должны быть расположены на его стороне, так что дыхальца хорошо видны (рис. 3).
- При просмотре под микроскопом рассечение, держа гусеницу в месте с парой щипцов и поместите иглу близко к одному из дыхальца, где всекту кутикулы, как правило, мягче. Аккуратно нажмите на капиллярных игл по отношению к телу насекомого. Как только игла проникла в кутикулу, придать общий объем раствора в гусеницу (рис. 3). Важно, чтобы избежать инъекционного пузырьков воздуха в гусеницу. Тело гусеницы увеличится (например, увеличение объема на 20%) после инъекции, но не должны лопнуть или ила.
- Вернуться гусеница на лед, позиционирование насекомых сверху, чтобы предотвратить утечку буфер из раны (рис. 3).
- Повторите шаги 2.1-2.4 для каждой гусеницы используется для гемолимфы добычи. На данном этапе, чтобы все насекомые, чтобы охладить на льду в течение 30 минут перед началом работы.
3. Добыча Гемоциты
- Поместите гусеницы в чашке Петри под рассекает микроскопом.
- Сделать мелкие (2-3 мм) разрез в задней области гусеница с помощью стерильного scalpe л (рис. 3). Будьте осторожны, чтобы не повредить кишечника или других внутренних органов; целью является пункция кутикулу аккуратно и собрать буфер / гемолимфы смеси, содержащей гемоцитов из отдельных насекомых.
- Сожмите гусеница осторожно с использованием гибких пластиковых щипцов во время сбора гемолимфы смеси (примерно 10-20 мкл) с 10 мкл кончика пипетки, опять же осторожно, чтобы не повредить внутренние ткани (рис. 3). Гемолимфы собирается из капель выжатого из тела гусеницы. Удалите остатки гусеницы.
- Сбор гемолимфы от каждого отдельного гусеницы в отдельном помечены силицированного пробирок 0,5 мл микроцентрифуге.
- Добавить равный объем инкубационный раствор (примерно 10-20 мкл) каждого гемолимфы образец, собранный из отдельных гусеницы. Держите гемолимфы образцы на льду в любое время.
- Повторите шаги 3.1-3.5 для каждой гусеницы использовались в эксперименте.
- Смешать гемолимфы образца и инкубационный раствор непосредственно перед подсчетом гемоцитов. Эта процедура позволяет для правильного разделения гемоцитов и предотвращает слипание.
- Используйте чистую кончика пипетки перенести 10 мкл гемолимфы образца смешивают с инкубационный раствор на гемоцитометра.
- Использование сложного микроскопа, считать и записывать числа гемоцитов по крайней мере 15 больших квадратов (площадью один квадратный: 0,04 мм 2, глубина: 0,1 мм) центральной сетке гемоцитометр (рис. 3). Добавьте эти значения для получения общей суммы числа гемоцитов в 15 квадратов.
- Промойте гемоцитометр и его крышку слайд тщательно с использованием мыть бутылки с дистиллированной и деионизированной водой и вытереть насухо Kimwipes (Kimberly-Clark) между каждым образцом.
- Повторите шаги 4.1-4.4 для каждого гемолимфы образца.
- Вычислить среднее количество гемоцитов на мл гемолимфы Volumе для каждой гусеницей, а именно:
Общий объем каждого квадрата сетки гемоцитометр: (0,04 мм 2 площади) × (0,1 мм глубиной) = 0,004 мм 3 × 15 квадратов = 0,06 мм 3 = в общем объеме учитываются все 15 квадратов.
(Сумма общего числа гемоцитов в 15 квадратов считали / общего объема всех 15 считаются квадраты) х 2 = коэффициент разбавления количество гемоцитов / мм 3 х 1000 = количество гемоцитов / мл гемолимфы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В протоколе описаны здесь позволяет собирать минимальный объем 10-20 мкл гемолимфы насекомых из отдельных гусениц. Гемоциты собранных с помощью этого метода являются бесплатными клеточных слипания, меланизации дефектов тканей мусора и других загрязнений. Поэтому гемоцитов можно легко наблюдать и подсчитывали под микроскопом, и некоторые насекомые могут наблюдаться в течение нескольких Hosūr. Мы заметили, что большинство гемоцитов в наших образцах состоял из плазматоцитов 3 (гемоцитов распространение асимметрично) (рис. 4). В настоящее время мы характеризующих различные типы гемоцитов, найденные в этих гусениц в деталях (Stoepler и соавт., Неопубликованные данные). Описанный здесь метод обеспечивает быстрый и точный способ для подсчета общего гемоцитов номера для индивидуального гусеницы собраны в ходе полевых экспериментов.
Хотя гемоцитов плотность может сильно различаться между странами и внутри видов насекомых 1 </ SUP>, мы обнаружили, что гемоцитов номера для L. фасциола гусениц диапазоне от 1,10 × 10 6 - 8,23 × 10 6 клеток / мл гемолимфы (среднее: 3,51 × 10 6, N = 31 гусениц), и находятся в диапазоне сообщалось ранее значения в другие виды чешуекрылых 14.
Рисунок 1 фотографией предпоследнего возраста Lithacodes фасциола (Lepidoptera: Limacodidae). Гусеница. Типичная длина тела этих гусениц колеблется от 10-15 мм в предпоследнем конечным возрастов. Фото: John T. Лилль.
Рисунок 2. Установки инъекционной иглой. Стеклянный шприц связано с капиллярным иглу через тупой иглой конца и пластиковых труб (Панели 1-4). Кусок пластика глина используется, чтобы отдохнуть капиллярных игл (5). Гусеница помещают в чашку Петри для инъекций с коллекцией решение (6).
Рисунок 3. Гемоцитов методом экстракции. (А) охлажденное гусеницы вводят сбор решения, (б) после инъекции, тело гусеницы увеличится незначительно, и вводят насекомых разрешено отдыхать на льду в течение 30 мин; (C, D) разрез производится с помощью чистый скальпель, гусеница сжимается с помощью пары пластиковые щипцы, чтобы заставить гемолимфы из организма через разрез, и гемоцитов собираются с помощью пипетки (е) гемоцитов рассчитывали с использованием гемоцитометра.
Рисунок 4. Микроскопии пиcture показывает извлеченную из гемоцитов Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) гусеницы (увеличение: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы для извлечения гемоцитов из важных медицинских насекомых и чешуекрылых насекомых модель уже сообщалось ранее 9, 14. Гемоцитов методов добычи адаптированы в соответствии с видов насекомых, стадии развития насекомого и его морфологические особенности. Например, гемолимфы изоляции от личинок Manduca может быть легко выполняются Ножницы изогнутые рога в конце брюшной полости 15. Потому что пуля гусениц (Limacodidae) лишены этой брюшной структуру, мы разработали отдельный протокол для гемолимфы добычи от мелких поле собранных гусениц. Этот метод оказывается эффективным для выделения достаточного объема гемолимфы, содержащих большое количество гемоцитов клеток, которые могут храниться и обрабатываться для дальнейших экспериментов. Кроме того, гемоцитов коллекции от взрослых комаров включает трудоемкий этап, который включает тщательное удаление ноги, крылья и кончик живота 16
Мы намерены использовать этот метод в будущем исследования по морфологическим характеризуют гемоцитов типов клеток из различных стадиях развития леса заготовленной гусениц. Этот анализ также может предоставить первый важный шаг для изоляции здоровых гемоцитов детально изучить ряд физиологических аспектов насекомых клеточного иммунного ответа, в том числе влияние различных стадиях развития и условий питания на общее количество гемоcytes в наивным или зараженных гусениц получаются из их естественной среде. Учитывая хроническое воздействие личинок чешуекрылых к целому ряду различных возбудителей в природе, а также потенциально постоянное присутствие своих микробных симбионтов, предполагается, что эти насекомые обладают типов гемоцитов с различными свойствами по сравнению с иммунной клетки, находящиеся в лаборатории выращенных насекомые. Кроме того, этот протокол гемоцитов добычи могут быть применены к исследованиям с другими группами насекомых, что позволяет иммунологических анализов связанных должны быть включены в экологические исследования полей, тем самым увеличивая наше понимание клеточных защитных механизмов, не связанных с моделью видов насекомых сельскохозяйственных или экологической значение. В заключение, наш метод станет ценным ресурсом для насекомых биологов, экологов и тех, кто заинтересован в понимании функционального взаимодействия между гемоцитов изобилие и способность диких популяций насекомых противостоять микробной или parasitiс инфекциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
TMS был поддержан Харлан целевых стипендий (УДВ) в ходе этого исследования. Финансирование коллекции полей и разведении L. фасциола и E. delphinii был предоставлен грант NSF DEB 0642438 на JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F.
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R.
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
