Summary
Hemocitos Insectos llevar a cabo muchas funciones importantes, tanto inmunes y no inmunes, en todas las etapas de desarrollo del insecto. Nuestro conocimiento actual de los tipos de hemocitos y la función proviene de estudios en modelos genéticos de insectos. A continuación, se presenta un método para la extracción, cuantificación y visualización de hemocitos de larvas silvestres.
Abstract
Hemocitos de insectos (equivalente a mamíferos células blancas de la sangre) juegan un papel importante en varios procesos fisiológicos durante el ciclo de vida de un insecto 1. En las fases larvarias de insectos pertenecientes al orden de los lepidópteros (polillas y mariposas) y dípteros (moscas verdaderas), hemocitos se forman a partir de la glándula linfática (un órgano hematopoyético especializado) o células embrionarias y se puede llevar hasta la etapa adulta. Hemocitos embrionarias están involucrados en la regulación de la migración celular durante el desarrollo y la quimiotaxis durante la inflamación. También participan en la apoptosis de células y son esenciales para la embriogénesis 2. Hemocitos mediar en el brazo celular de la respuesta inmune innata de insectos que incluye varias funciones, tales como la propagación de células de agregación celular, la formación de nódulos, la fagocitosis y la encapsulación de los invasores extraños 3. Ellos también son responsables de orquestar específicas defensas humorales de insectos durante la infección, como la producción de péptidos antimicrobianos y otras moléculas efectoras 4, 5. Hemocyte morfología y función han sido estudiada principalmente en modelos de insectos genéticas o fisiológicas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, el Aedes aegypti y Anopheles gambiae 8, 9 y el gusano del tabaco, Manduca sexta 10, 11. Sin embargo, existe poca información que existe actualmente sobre la diversidad, la clasificación, morfología y función de hemocitos en especies de insectos no-modelo, en especial los de origen silvestre 12.
Aquí se describe un protocolo sencillo y eficiente para la extracción de hemocitos de larvas silvestres. Utilizamos penúltimo estadio Lithacodes fasciola (amarillo de hombros polilla slug) (Figura 1) y Euclea delphinii (espinosa babosa roble) orugas (Lepidoptera: Limacodidae) y muestran que los volúmenes suficientes de hemolinfa (sangre de insectos)puede ser aislado y números de hemocitos contados a partir de larvas individuales. Este método puede ser usado para estudiar eficientemente tipos de hemocitos en estas especies, así como en otras orugas de lepidópteros relacionados recolectadas desde el campo, o se puede combinar fácilmente con ensayos inmunológicos destinados a investigar la función de hemocitos después de la infección microbiana o con organismos parásitos 13.
Protocol
1. Preparación de materiales
- Preparar agujas (1-2 micras punta y el cono de 3-4 mm) utilizando tubos de vidrio de borosilicato capilares y un extractor de micropipeta. Ajuste del equipo: Rampa: 561; velocidad: 20; calor: 560; retardo: 1; tirón: 100; presión: 500.
- Preparar la solución de recogida: 60% de medio de Grace (GM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 20% de tampón de anticoagulante (98 mM de NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA y 41 ácido cítrico mM, pH 4,5 ). La solución anterior se prepara fresco en condiciones estériles y se mantuvo en hielo en todo momento.
- Preparar la solución tampón de incubación: 90% de GM suplementado con 10% de FBS. Esta solución también está preparado fresco y se mantuvieron en hielo en todo momento.
- Preparar un total de al menos 15 l × el número de insectos para la colección y las soluciones de incubación.
2. La inyección de orugas con la solución Collection
- Se anestesia ins penúltimasalquitrán de larvas por enfriamiento en hielo durante 20 min antes de la extracción de hemocitos.
- Colocar el extremo romo de una aguja limpia capilar (16-manométrica) en el tubo que está conectado a una jeringa de vidrio de 20 ml (Figura 2). Deje el tubo que contiene la solución de recopilación de abrir en el banco de laboratorio y lentamente llenar el capilar con el tampón. El capilar se llena generalmente de aproximadamente 10-15 l de solución de recogida, dependiendo del tamaño de la oruga (aproximadamente 1 l por solución de 10 mg de la masa corporal total oruga = 0,01% de la masa corporal total). Coloque la aguja en una bola de arcilla que se coloca al lado del microscopio de disección.
- Coloque la oruga en una placa de Petri. El insecto debe ser colocado en un lado de manera que los espiráculos son claramente visibles (figura 3).
- Mientras ve bajo un microscopio de disección, mantenga la oruga en su lugar con un par de pinzas y colocar la aguja cerca de uno de los espiráculos, donde el encutícula secta es generalmente más suave. Presione suavemente la aguja capilar contra el cuerpo del insecto. Una vez que la aguja ha penetrado en la cutícula, inyectar el volumen total de solución en la oruga (Figura 3). Es importante evitar la inyección de burbujas de aire en la oruga. El cuerpo de la oruga se hinchará (por ejemplo, aumento de volumen en un 20%) después de la inyección, pero no debe estallar o supurar.
- Volver la oruga a la hielo, posicionando el insecto dorsalmente para prevenir tampón se escape fuera de la herida (Figura 3).
- Repita los pasos 2.1-2.4 para cada oruga utilizados para la extracción de hemolinfa. En esta etapa, permitir que todos los insectos para enfriar en hielo durante 30 min antes de proceder.
3. Extracción de hemocitos
- Coloque la oruga en una placa de Petri bajo el microscopio de disección.
- Hacer un poco profundo (2-3 mm de largo) incisión en la región posterior de la oruga utilizando un scalpe estéril l (Figura 3). Tenga cuidado de no dañar los intestinos u otros órganos internos, el objetivo es perforar la cutícula con cuidado y recoger la mezcla de tampón / hemolinfa de los insectos que contiene hemocitos individuales.
- Apriete la oruga suavemente con unas pinzas flexibles de plástico durante la percepción de la mezcla hemolinfa (aproximadamente 10-20 l) con una punta de pipeta de 10 l, de nuevo teniendo cuidado de no dañar los tejidos internos (Figura 3). La hemolinfa se obtiene de la gotita de exprimido de cuerpo de la oruga. Deseche los restos de la oruga.
- Recoger hemolinfa de cada individuo oruga en distintos etiquetados siliconadas microcentrífuga de 0,5 ml.
- Añadir un volumen igual de la solución de incubación (aproximadamente 10-20 l) a cada muestra de hemolinfa obtenida de un individuo oruga. Mantener muestras de hemolinfa en hielo en todo momento.
- Repetir los pasos 3.1-3.5 para cada oruga usada en el experimento.
- Mezclar la muestra de hemolinfa y la solución de incubación inmediatamente antes de hemocitos de conteo. Este tratamiento permite una separación adecuada de hemocitos y evita la formación de grumos.
- Utilice una punta de pipeta limpia para transferir 10 l de muestra de hemolinfa se mezcla con la solución de incubación en un hemocitómetro.
- El uso de un microscopio compuesto, contar y registrar el número de hemocitos en al menos 15 de los cuadrados grandes (área de punto de partida: 0,04 mm 2, profundidad: 0,1 mm) de la rejilla central del hemocitómetro (Figura 3). Agregue estos valores para obtener una suma total del número de hemocitos en los 15 cuadrados.
- Enjuague el hemocitómetro y su tapa deslizante completamente utilizando una botella de lavado con agua destilada y desionizada y seque con Kimwipes (Kimberly-Clark) entre cada muestra.
- Repita los pasos 4.1-4.4 para cada muestra de hemolinfa.
- Calcular el número medio de hemocitos por ml de hemolinfa volume para cada oruga, como sigue:
Volumen total de cada cuadrado de la cuadrícula de hemocitómetro: (0,04 mm 2 de área) × (0,1 mm de profundidad) = 0,004 mm 3 × 15 cuadrados = 0,06 mm 3 = el volumen total de todos los 15 cuadrados contados.
(Suma del número total de hemocitos en los 15 cuadrados contados / el volumen total de todos los 15 cuadrados contados) x 2 = factor de dilución el número de hemocitos / mm 3 x 1.000 = el número de hemocitos / ml de hemolinfa.
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Representative Results
El protocolo se describe en la presente memoria permite la recogida de un volumen mínimo de 10-20 l de hemolinfa de insectos de orugas individuales. Hemocitos recogidos mediante este método están libres de grumos de células, defectos melanización, restos de tejido u otros contaminantes. Por lo tanto hemocitos se puede observar fácilmente y contados bajo el microscopio, y varios insectos se puede observar dentro de un Hosur pocos. Hemos observado que la mayoría de los hemocitos en nuestras muestras consistieron de plasmatocitos 3 (hemocitos propagación asimétrica) (Figura 4). Actualmente estamos caracterizando los diferentes tipos de hemocitos que se encuentran en estas orugas en detalle (Stoepler et al., Datos no publicados). El método descrito aquí proporciona un medio rápido y preciso para el recuento total de hemocitos números para las orugas individuales obtenidos de experimentos de campo.
Aunque la densidad de hemocitos pueden variar mucho entre y dentro de las especies de insectos 1 </ Sup>, se encontró que los números de hemocitos de L. fasciola rango orugas de 1,10 × 10 6 a 8,23 x 10 6 células / ml de hemolinfa (media: 3,51 × 10 6, n = 31 orugas), y están en el rango de los valores reportados en otras especies de lepidópteros 14.
Figura 1 Fotografía de un penúltimo estadio Lithacodes fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Oruga. La longitud del cuerpo típico de estas orugas varía de 10-15 mm en penúltima estadios finales. Crédito de la imagen: John T. Lill.
Figura 2. Configuración de inyección de aguja. Una jeringa de vidrio está conectado a una aguja capilar a través de una aguja de extremo romo y un tubo de plástico (paneles 1-4). Un pedazo de arcilla plástica se utiliza para descansar la aguja capilar (5). La oruga se coloca en una placa de Petri para la inyección con la solución de recogida (6).
Figura 3. Método de extracción de hemocitos. (A) El refrigerada oruga se inyecta con la solución de recogida, (b) después de la inyección, el cuerpo de la oruga se hincha ligeramente, y el insecto inyectado se deja reposar en hielo durante 30 min; (c, d) se hace un corte usando un escalpelo limpio, la oruga se comprime usando un par de pinzas de plástico para forzar la hemolinfa fuera del cuerpo a través de la incisión, y los hemocitos se recogen con una pipeta; (e) hemocitos se contaron usando un hemocitómetro.
Figura 4. Pi Microscopíamagen mostrando hemocitos extraídos de Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) orugas (aumento: 20x).
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Discussion
Los métodos para la extracción de hemocitos de los insectos de importancia médica y los insectos lepidópteros modelo han sido previamente informado de 9, 14. Métodos de extracción de hemocitos se adaptan de acuerdo con la especie de insecto, la etapa de desarrollo del insecto y sus características morfológicas. Por ejemplo, el aislamiento hemolinfa de las larvas de Manduca puede ser fácilmente realizada por cortando el cuerno curvado cerca del extremo del abdomen 15. Porque las orugas Slug (Limacodidae) carecen de esta estructura abdominal, se ha desarrollado un protocolo distinto para la extracción de la hemolinfa de pequeño tamaño orugas recogidas en campo. Este método resulta eficaz para el aislamiento de un volumen suficiente de hemolinfa que contienen un gran número de células de hemocitos que pueden ser almacenados o procesados para experimentación adicional. Además, la recogida de hemocitos de los mosquitos adultos incluye un paso de tiempo y que requiere la eliminación cuidadosa de las piernas, alas y la punta del abdomen 16
Tenemos la intención de utilizar este método en futuros estudios para caracterizar morfológicamente tipos de hemocitos celulares de diferentes etapas de desarrollo de los bosques cosechados orugas. Este ensayo también se puede proporcionar el primer paso crítico para aislar hemocitos sanos para examinar en detalle varios aspectos fisiológicos de la respuesta inmune celular de insectos, incluyendo el efecto de varias etapas de desarrollo y las condiciones nutricionales en el número total de hemocitos en orugas o infectados no tratados previamente obtenidos de sus ambientes naturales. Dada la exposición crónica de las larvas de lepidópteros a una serie de diferentes patógenos en la naturaleza, así como la presencia potencialmente continuo de sus simbiontes microbianos, se prevé que estos insectos poseen tipos de hemocitos con propiedades diferentes en comparación con las células inmunes se encuentran en laboratorio criados insectos. Además, este protocolo de extracción de hemocitos también puede aplicarse a estudios con otros grupos de insectos, permitiendo inmunológicos relacionados con ensayos a ser incorporados en los estudios de campo ecológicos, aumentando así nuestra comprensión de los mecanismos de defensa celular en especies de insectos no del modelo de agrícola o ecológico importancia. En conclusión, nuestro método será un recurso valioso para los biólogos, ecólogos de insectos y aquellos interesados en la comprensión de la interacción funcional entre la abundancia de hemocitos y la capacidad de las poblaciones de insectos silvestres para resistir microbiano o parasitic infecciones.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
TMS fue apoyado por la beca Harlan Trust (GWU) durante este estudio. La financiación para la recolección de campo y la cría de L. fasciola y E. delphinii fue proporcionado por la NSF subvención DEB 0642438 a JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
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