Summary
Insect Blutzellen führen viele wichtige Funktionen, sowohl Immun-und Nicht-immune, in allen Phasen des Insekts Entwicklung. Unsere gegenwärtigen Kenntnisstand hemocyte Typen und Funktion kommt von Studien über Insekten genetischen Modellen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion, Quantifizierung und Visualisierung von Blutzellen von wilden Raupen.
Abstract
Insect Blutzellen (äquivalent zu Säugetieren weißen Blutkörperchen) spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen im gesamten eines Insekts Lebenszyklus 1. In Larvenstadien von Insekten gehören zu den Ordnungen Lepidoptera (Schmetterlinge) und Diptera (true entfernt) werden Blutzellen aus dem Lymphknoten (a spezialisierte hämatopoetische Orgel) oder embryonale Zellen gebildet und kann bis zum erwachsenen Stadium durchgeführt werden. Embryonale Blutzellen in Zellmigration während der Entwicklung und Chemotaxis Regelung bei Entzündungen beteiligt sind. Sie beteiligen sich auch an Zell-Apoptose und sind für Embryogenese 2 unerlässlich. Hämocyten vermitteln den zellulären Arm des Insekts angeborenen Immunantwort, die mehrere Funktionen, wie zum Beispiel Zell-Ausbreitung, Zellaggregation, Bildung von Knötchen, Phagozytose und Einkapselung Eindringlinge 3 umfasst. Sie sind auch verantwortlich für die Koordination bestimmtes Insekt humorale Abwehrmechanismen während der Infektion, wie die produktion von antimikrobiellen Peptiden und anderen Effektormoleküle 4, 5. Hemocyte Morphologie und Funktion wurden vor allem in der genetischen oder physiologischen Insektenmodelle untersucht worden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster 6, 7, die Moskitos Aedes aegypti und Anopheles gambiae 8, 9 und der Tabakschwärmer Manduca sexta 10, 11. Allerdings wenig Informationen existiert derzeit über die Vielfalt, Klassifizierung, Morphologie und Funktion von Blutzellen in nicht-Modell Insektenarten, vor allem diejenigen aus dem wilden 12 gesammelt.
Hier beschreiben wir eine einfache und effiziente Protokoll zum Extrahieren Blutzellen von wilden Raupen. Wir verwenden vorletzten Larvenstadium Lithacodes Fasciola (gelb-geschultert slug Motten) (Abbildung 1) und Euclea delphinii (spiny Eiche slug) Raupen (Lepidoptera: Limacodidae) und zeigen, dass ausreichende Mengen Hämolymphe (Insekten Blut)können isoliert und Hämozyten Zahlen von einzelnen Larven gezählt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um effizient zu studieren Hämozyten Typen in diesen Arten sowie in anderen verwandten Lepidoptera Raupen vom Feld geerntet werden, oder er kann ohne weiteres mit immunologischen Tests zur Hämozyten Funktion nach Infektion mit mikrobiellen oder parasitischen Organismen untersuchen 13 kombiniert werden.
Protocol
Ein. Materialvorbereitung
- Bereiten Nadeln (1-2 um Spitze und 3-4 mm Konus) mit Borosilikatglas Kapillaren und eine Feinpipettenziehvorrichtung. Geräteeinstellungen: Rampe: 561; Geschwindigkeit: 20; Wärme: 560; Verzögerung: 1; Zugkraft: 100; Druck: 500.
- Bereiten Sie die Sammlung Lösung: 60% der Grace-Medium (GM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 20% der Gerinnungshemmer Buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA und 41 mM Zitronensäure, pH 4,5 ergänzt ). Die obige Lösung wird unter sterilen Bedingungen hergestellt frischen und auf Eis gehalten zu allen Zeiten.
- Bereiten Sie die Inkubationspuffer Lösung: 90% der GM ergänzt mit 10% FBS. Diese Lösung wird ebenfalls frisch hergestellt und auf Eis gehalten zu allen Zeiten.
- Bereiten Sie eine Gesamtmenge von mindestens 15 ul × die Anzahl der Insekten sowohl für die Sammlung und den Inkubationslösungen.
2. Die Injektion von Raupen mit Collection-Lösung
- Anesthetize vorletzten insTeer Larven durch Abkühlen auf Eis für 20 min vor der Hämozyten Extraktion.
- Passen das stumpfe Ende eines sauberen Kapillarnadel (16-Gauge) in die Rohrleitung, die zu einer 20 ml Glasspritze (Abbildung 2) verbunden ist. Lassen Sie das Röhrchen mit der Sammlung Lösung auf dem Labortisch zu öffnen und langsam füllen die Kapillare mit dem Puffer. Die Kapillare ist in der Regel mit etwa 10 bis 15 ul Sammlung Lösung gefüllt, abhängig von der Größe der Raupe (ungefähr 1 ul Lösung pro 10 mg Raupe gesamten Körpermasse = 0,01% der gesamten Körpermasse). Ruhen die Nadel auf einer Kugel von Ton, die neben dem Präpariermikroskop platziert ist.
- Legen Sie die Raupe in einer Petrischale. Das Insekt sollte auf der Seite positioniert werden, so dass die Luftlöcher gut sichtbar sind (Abb. 3).
- Während sich unter einem Binokular, halten Sie die Raupe im Ort mit einer Pinzette und legen Sie die Nadel in der Nähe eines der Luftlöcher, wo die inSekte Schuppenschicht ist in der Regel weicher. Drücken Sie vorsichtig die Kapillarnadel gegen den Körper des Insekts. Sobald die Nadel das Häutchen durchdrungen hat, einzuspritzen das Gesamtvolumen der Lösung in die Raupe (Abbildung 3). Es ist wichtig zu vermeiden, Einblasen von Luft Blasen in die Raupe. Die Raupe Körper quillt (zB im Volumen um 20%) nach der Injektion sollte aber nicht platzen oder sickern.
- Bringen Sie die Raupe auf dem Eis, die Positionierung des Insekts dorsal Puffer aus undichten aus der Wunde (Abbildung 3) zu verhindern.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,4 für jede Raupe zum Hämolymphe Extraktion verwendet. In dieser Phase können alle Insekten auf Eis für 30 min vor dem Fortfahren kühlen.
3. Extraktion von Blutzellen
- Legen Sie die Raupe in einer Petrischale unter dem Binokular.
- Einen flachen (2-3 mm lang) Schnitt in der hinteren Region der Raupe mit einem sterilen scalpe l (Abbildung 3). Achten Sie darauf, den Darm oder andere interne Organe schädigen; das Ziel ist die Punktion der Nagelhaut sorgfältig und sammeln die Puffer / Hämolymphe Mix mit Blutzellen aus einzelnen Insekten.
- Drücken Sie die Raupe vorsichtig mit flexiblem Kunststoff Pinzette beim Sammeln der Hämolymphe Mix (ca. 10-20 ul) mit einem 10 ul Pipettenspitze wieder dabei nicht um die inneren Geweben (Abbildung 3) verletzen. Hämolymphe von dem Tröpfchen aus der Raupe Körper gepresst gesammelt. Entsorgen der Raupe bleibt.
- Sammle Hämolymphe von jedem einzelnen Raupe in separaten bezeichnet silikonisiert 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Hinzufügen gleichen Volumen der Inkubationslösung (ungefähr 10-20 ul) miteinander Hämolymphe Probe von einem Individuum Raupe gesammelt. Halten Hämolymphe Proben auf Eis zu allen Zeiten.
- Die Schritte für jede 3,1 bis 3,5 Raupe in dem Experiment verwendet.
- Mischen Sie die Hämolymphe Probe und die Inkubationszeit Lösung sofort vor dem Zählen Blutzellen. Diese Behandlung ermöglicht eine ordnungsgemäße Trennung von Blutzellen und verhindert Verklumpen.
- Verwenden Sie ein sauberes Pipettenspitze 10 ul Hämolymphe Probe mit der Inkubation Lösung auf einem Hämocytometer gemischt übertragen.
- Mit einer Verbindung Mikroskop zählen und notieren Sie die Anzahl der Blutzellen in mindestens 15 von den großen Plätzen (Fläche von einem Quadratmeter: 0,04 mm 2, Tiefe: 0,1 mm) des mittleren Raster der Zählkammer (Abbildung 3). Hinzufügen dieser Werte, um eine Gesamtsumme der Anzahl von Hämocyten in den 15 Plätzen zu erhalten.
- Spülen Sie die Zählkammer und Deckglas gründlich mit einer Waschflasche mit destilliertem und entionisiertem Wasser und trocknen mit Kimwipes (Kimberly-Clark) zwischen jeder Probe.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,4 für jeden Hämolymphe Probe.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Blutzellen pro ml Hämolymphe volume für jede Raupe, wie folgt:
Gesamtvolumen jedes Quadrat der Zählkammer Raster: (0,04 mm 2 Fläche) × (0,1 mm Tiefe) = 0,004 mm 3 × 15 Quadrate = 0,06 mm 3 = das Gesamtvolumen aller 15 gezählt Plätzen.
(Summe der Gesamtzahl der in den 15 Hämocyten Quadrate gezählt / das Gesamtvolumen aller 15 gezählt Quadrate) x 2 Verdünnungsfaktor = die Anzahl von Hämocyten / mm 3 x 1000 = die Anzahl von Hämocyten / ml Hämolymphe.
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Representative Results
Das Protokoll beschrieben erlaubt die Erfassung von einem minimalen Volumen von 10-20 ul von Insekten Hämolymphe von einzelnen Raupen. Hämocyten gesammelt unter Verwendung dieses Verfahrens sind frei von Verklumpungen Zelle, Melanisierung Defekte Gewebereste oder anderen Verunreinigungen. Deshalb Hämozyten kann leicht beobachtet und gezählt werden unter dem Mikroskop, und einige Insekten können in wenigen Hosur beobachtet werden. Wir beobachteten, dass die Mehrzahl der in unserer Hämocyten Proben plasmatocytes 3 (Hämocyten Ausbreitung asymmetrisch) (Abbildung 4) bestand. Wir derzeit Charakterisierung der verschiedenen Typen in diesen Hämozyten Raupen im Detail (Stoepler et al., Unveröffentlichte Daten) gefunden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Mittel zum Zählen insgesamt hemocyte Zahlen für einzelne Raupen aus Feldversuchen gesammelt.
Obwohl hemocyte Dichte kann stark variieren zwischen und innerhalb von Insektenarten 1 </ Sup>, fanden wir, dass hemocyte Zahlen für L. Fasciola Raupen Bereich von 1,10 x 10 6 bis 8,23 x 10 6 Zellen / ml von Hämolymphe (Mittelwert: 3,51 × 10 6, n = 31 Raupen) und liegen im Bereich der zuvor berichteten Werten in anderen Spezies 14 Lepidopteren.
Abbildung 1 Foto von einem vorletzten Larvenstadium Lithacodes Fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Raupe. Typische Körperlänge von diesen Raupen reicht von 10-15 mm an der vorletzten zum letzten Larvenstadium. Photo credit: John T. Lill.
Abbildung 2. Injektionsnadel Setup. Ein Glasspritze mit einer Kapillarnadel über ein stumpfes Ende Nadel und Kunststoffrohr verbunden (Paneele 1-4). Ein Stück plastischer Ton verwendet, um die Kapillarnadel (5) ruhen. Die Raupe wird in einer Petrischale für die Injektion mit der Sammlung Lösung (6) platziert.
Abbildung 3. Hemocyte Extraktionsverfahren. (A) Die gekühlte Raupe ist mit der Sammlung Lösung injiziert, (b) nach der Injektion, der Raupe Körper leicht quellen und das eingespritzte Insekt wird auf Eis für 30 min ruhen, (c, d) ein Schnitt gemacht wird unter Verwendung ein sauberes Skalpell, ist die Raupe gedrückt Verwendung eines Paares von Plastikpinzette die Hämolymphe zwingen aus dem Körper durch den Einschnitt und Hämocyten werden mit einer Pipette aufgesammelt, (e) Hämocyten gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers.
Abbildung 4. Microscopy pild zeigt extrahierten Blutzellen aus Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) Raupen (Vergrößerung: 20x).
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Discussion
Methoden zur Extraktion von Blutzellen aus medizinisch wichtige Insekten und Faltern Modell Insekten wurden bisher 9, 14 berichtet. Hemocyte Extraktionsmethoden sind nach den Insektenarten angepasst, das Entwicklungsstadium der Insekten und ihre morphologischen Merkmale. Beispielsweise kann isoliert von Hämolymphe Manduca Larven leicht durch den gekrümmten Horn snipping nahe dem Ende des Bauches 15 durchgeführt werden. Weil Butzen Raupen (Limacodidae) dieses abdominalen Struktur fehlt, haben wir eine deutliche Protokoll für Hämolymphe Extraktion aus kleinformatigen Feld-gesammelt Raupen entwickelt. Diese Methode erweist sich für die Isolierung ausreichende Hämolymphe Bände mit einer großen Anzahl von hemocyte Zellen, die gelagert oder für weitere Experimente verarbeitet werden können effizient. Darüber hinaus enthält hemocyte Kollektion von erwachsenen Mücken eine zeitaufwendige Schritt, der die sorgfältige Entfernung der Beine, Flügel und die Spitze des Bauches 16 beinhaltet
Wir beabsichtigen, diese Methode in zukünftigen Studien zu nutzen, um morphologisch charakterisieren hemocyte Zelltypen aus verschiedenen Entwicklungsstadien des Waldes geerntet Raupen. Dieser Test kann auch die erste kritische Schritt zur Isolierung gesunden Blutzellen im Detail zu prüfen mehreren physiologischen Aspekte des Insekts zelluläre Immunantwort, einschließlich der Auswirkungen von verschiedenen Entwicklungsstadien und Ernährungs-Bedingungen auf die Gesamtzahl der hemozyten in naiv oder infizierten Raupen von ihrer natürlichen Umgebung erhalten. Angesichts der chronischen Exposition von Schmetterlingslarven auf einen Bereich von unterschiedlichen Erregern in der Natur, sowie die potentiell kontinuierliche Anwesenheit ihrer mikrobiellen Symbionten, wird davon ausgegangen, dass diese Arten von Insekten Hämocyten besitzen unterschiedliche Eigenschaften gegenüber Immunzellen im Labor festgestellt aufgezogenen Insekten. Darüber hinaus kann diese Hämozyten Extraktionsprotokoll auch Studien mit anderen Gruppen von Insekten aufgebracht werden, so dass immunologischen Assays-bezogenen in ökologischer Feldstudien eingearbeitet werden, wodurch sich unser Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen in nicht-Modell Insektenarten landwirtschaftlicher oder ökologischen Bedeutung. Abschließend wird unsere Methode eine wertvolle Ressource, um Insekten Biologen, Ökologen und Interessierte in das Verständnis der funktionellen Wechselspiel zwischen hemocyte Fülle und die Fähigkeit von wilden Insekten-Populationen zu mikrobiellen oder parasiti standhältc Infektionen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
TMS wurde von der Harlan Trust Fellowship (GWU) in dieser Studie unterstützt. Die Finanzierung für Feldauflistung und Zucht L. Fasciola und E. delphinii wurde von NSF DEB 0642438 zu JTL vorgesehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
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