Summary
Insect hemocyter utför många viktiga funktioner, både immuna och icke-immuna, under alla stadier av insekter utveckling. Vår nuvarande kunskap om hemocyte typer och funktion kommer från studier av insekter genetiska modeller. Här presenterar vi en metod för att extrahera, kvantifiera och visualisera hemocyter från vilda larver.
Abstract
Insect hemocyter (motsvarande däggdjur vita blodkroppar) spelar en viktig roll i flera fysiologiska processer genom en insekt livscykel 1. I larvstadier av insekter som hör till order Lepidoptera (malar och fjärilar) och Diptera (riktiga flugor), är hemocyter bildas av lymfkörtelområde (en specialiserad hematopoetisk orgel) eller embryonala celler och kan genomföras till den vuxna stadiet. Embryonala hemocyter är involverade i cellmigration under utveckling och kemotaxi reglering vid inflammation. De tar också del i cell apoptos och är nödvändiga för embryogenes 2. Hemocyter medierar cellulära armen av insekten medfödda immunsvar som inbegriper flera funktioner, såsom cellspridning, cellaggregering, bildning av noduler, fagocytos och inkapsling av främmande inkräktare 3. De är också ansvariga för att iscensätta specifika insekter humorala försvar vid infektion, till exempel produktion av antimikrobiella peptider och andra effektormolekyler molekyler 4, 5. Hemocyte morfologi och funktion har huvudsakligen studerats i genetiska eller fysiologiska insekter modeller, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster 6, 7, myggor Aedes aegypti och Anopheles gambiae 8, 9 och tobak hornworm, Manduca sexta 10, 11. Det finns dock lite information för närvarande om mångfald, klassificering, morfologi och funktion hemocyter i icke-modell insektsarter, speciellt de som samlats in från det vilda 12.
Här beskriver vi en enkel och effektiv protokoll för att extrahera hemocyter från vilda larver. Vi använder näst sista stadiet Lithacodes Fasciola (gul-shouldered slug mal) (Figur 1) och Euclea delphinii (taggig ek slug) larver (Lepidoptera: Limacodidae) och visar att tillräckliga mängder hemolymfa (insekt blod)kan isoleras och hemocyte nummer räknas från enskilda larver. Denna metod kan användas för att effektivt studera hemocyte typer i dessa arter samt i andra ordningen fjärilar larver skördats från fältet, eller det kan lätt kombineras med immunologiska analyser som syftar till att undersöka hemocyte funktion efter infektion med mikrobiella eller parasitära organismer 13.
Protocol
1. Material Förberedelser
- Förbered nålar (1-2 um spets och 3-4 mm spets) med borosilikatglas kapillärrör och en mikropipett avdragare. Instrumentinställningar: Ramp: 561, Hastighet: 20, värme: 560, delay: 1, pull: 100, tryck: 500.
- Bered samlingen lösningen: 60% av Graces medium (GM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 20% av antikoagulerande buffert (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA och 41 mM citronsyra, pH 4,5 ). Ovanstående lösning framställs färska under sterila betingelser och hölls på is vid alla tidpunkter.
- Bered lösningen inkubationsbufferten: 90% av GM kompletterat med 10% FBS. Denna lösning är också framställs färska och hölls på is vid alla tidpunkter.
- Bered totalt minst 15 ul × antalet insekter för både insamling och lösningarna inkubationstiderna.
2. Injektion av Larver med samlingen Solution
- Söva näst sista programtjära larver genom kylning dem på is under 20 min före hemocyte extraktion.
- Montera den trubbiga änden av en ren kapillär nål (16-gauge) till slangen som är ansluten till en 20 ml glasspruta (figur 2). Låt röret med insamlingen lösningen öppna på labbänken och långsamt fyller kapillären med bufferten. Kapillären vanligen är fylld med ca 10-15 pl insamling lösning, beroende på storleken på larv (ca 1 | il lösning per 10 mg larv totala kroppsmassan = 0,01% av den totala kroppsmassan). Vila nålen på en boll av lera som är placerad intill dissektionsmikroskop.
- Placera larv i en petriskål. Insekten skall placeras på sin sida så att spiracles syns tydligt (figur 3).
- När du tittar på under ett dissektionsmikroskop, håller larv på plats med en pincett och placera nålen nära en av de spiracles där isekt nagelband är generellt mjukare. Tryck försiktigt kapillära nålen mot kroppen av insekten. När nålen har penetrerat nagelband, injicera den totala volymen av lösning in i larv (figur 3). Det är viktigt att undvika att injicera luftbubblor i larv. Larvens kropp kommer att svälla (t ex öka i volym med 20%) efter injektion, men bör inte spricka eller sekret.
- Returnera larv till isen, placera insekten dorsalt för att förhindra att bufferten från att läcka ut från såret (Figur 3).
- Upprepa steg 2,1-2,4 för varje larv för hemolymfa extraktion. I detta skede, att alla insekter att kyla på is under 30 minuter innan du fortsätter.
3. Extraktion av hemocyter
- Placera larv i en petriskål under dissektionsmikroskop.
- Gör en grund (2-3 mm lång) snitt i den bakre regionen av larv användning av en steril scalpe l (figur 3). Se till att inte skada tarmen eller andra inre organ, målet är att punktera nagelband noggrant och samla buffert / hemolymfa blandning som innehåller hemocyter från enskilda insekter.
- Kläm larv försiktigt använda flexibla plast pincett samtidigt samla hemolymfa mix (ca 10-20 pl) med en 10 ul pipettspets, återigen noga med att inte skada de inre vävnader (Figur 3). Hemolymfa samlas in från droppen pressas från larv kropp. Kassera caterpillar kvarlevor.
- Samla hemolymfa från varje enskild larv i separata silikoniserade märkta 0,5 ml mikrorör.
- Lägg lika stor volym av inkuberingen lösningen (ungefär 10-20 il) till varje prov hemolymfa uppsamlas från en individ larv. Håll hemolymfa prover på is hela tiden.
- Upprepa steg 3,1-3,5 för varje larv användes i experimentet.
- Blanda hemolymfa provet och inkubationstiden lösningen omedelbart före räknar hemocyter. Denna behandling medger åtskillnad av hemocyter och förhindrar klumpbildning.
- Använd en ren pipettspets att överföra 10 | il av hemolymfa prov blandat med inkuberingen lösningen på en hemocytometer.
- Med hjälp av en sammansatt mikroskop, räkna och registrera antalet hemocyter i minst 15 av de stora torgen (område en kvadrat: 0,04 mm 2, djup: 0,1 mm) av den centrala galler hemocytometer (Figur 3). Lägg till dessa värden för att erhålla en total summa av antalet hemocyter i 15 rutor.
- Skölj hemocytometer och dess lock glider noggrant med en tvättflaska med destillerat och avjoniserat vatten och torka torrt med Kimwipes (Kimberly-Clark) mellan varje prov.
- Upprepa steg 4,1-4,4 för varje hemolymfa prov.
- Beräkna det genomsnittliga antalet hemocyter per ml hemolymfa Volume för varje larv, enligt följande:
Total volym av varje kvadrat av hemocytometer nätet: (0,04 mm 2 area) × (0,1 mm djup) = 0,004 mm 3 × 15 rutor = 0,06 mm 3 = den totala volymen av alla räknade 15 rutor.
(Summan av det totala antalet av hemocyter i 15 rutor räknades / den totala volymen av alla räknade 15 rutor) x 2 spädningsfaktor = antalet hemocyter / mm 3 x 1.000 = antalet hemocyter / ml hemolymfa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs häri medger insamling av en minimal volym av 10-20 pl insekt hemolymfa från enskilda fjärilslarver. Hemocyter samlas med denna metod är fria från celler klumpar, defekter melaninnivå, vävnad skräp eller andra föroreningar. Därför hemocyter kan lätt observeras och räknades under mikroskop, och flera insekter kan observeras inom några Hosur. Vi konstaterade att majoriteten av hemocyter i våra prover bestod av plasmatocytes 3 (hemocyter sprider asymmetriskt) (Figur 4). Vi håller för närvarande kännetecknar de olika hemocyte typer finns i dessa larver i detalj (Stoepler et al. Opublicerade data). Metoden som beskrivs här ger en snabb och exakt för att räkna totala hemocyte nummer för enskilda larver som samlats in från fältförsök.
Även hemocyte densitet kan variera kraftigt mellan och inom insektsarter 1 </ Sup>, fann vi att hemocyte siffror för L. Fasciola larver intervallet från 1,10 x 10 6 till 8,23 x 10 6 celler / ml hemolymfa (medelvärde: 3,51 x 10 6, n = 31 larver), och är i intervallet av tidigare rapporterade värden i andra arter lepidoptera 14.
Figur 1 Fotografi av en näst sista stadiet Lithacodes Fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Larv. Typisk kroppslängd av dessa larver varierar från 10-15 mm i näst sista till slutliga instars. Foto: John T. Lill.
Figur 2. Injektionsnål inställning. Ett glas spruta ansluten till en kapillär nål genom en trubbig ände nål och plastslang (panelerna 1-4). En bit av plastisk lera används för att vila den kapillära nålen (5). Larv placeras i en petriskål för injektion med insamling lösningen (6).
Figur 3. Hemocyte extraktionsmetoden. (A) Det kylda larv injiceras med insamling lösningen, (b) efter injektion, kommer larvens kropp svälla något, och den injicerade insekt får vila på is under 30 minuter, (c, d) ett snitt görs med användning en ren skalpell, är larv pressas med användning av ett par av plast pincett för att tvinga hemolymfa ut ur kroppen genom snittet, och hemocyter samlas med en pipett, (e) hemocyter räknas med användning av en hemocytometer.
Figur 4. Mikroskopi picture visar extraherade hemocyter från Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) larver (förstoring: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder för att extrahera hemocyter från medicinskt viktiga insekter och fjärilsarter insekter modell har tidigare rapporterats 9, 14. Hemocyte extraktionsmetoder anpassas enligt de insektsarter, utvecklingsstadiet av insekten och dess morfologiska särdrag. Till exempel, kan hemolymfa isolering från Manduca larver lätt utföras genom snipping den krökta hornet nära slutet av buken 15. Eftersom slug larver (Limacodidae) saknar denna buken struktur har vi utvecklat en tydlig protokoll för hemolymfa extraktion från små fält-insamlade larver. Denna metod visar effektivt för att isolera tillräckligt hemolymfa volymer som innehåller ett stort antal hemocyte celler som kan lagras eller bearbetas för vidare experiment. Dessutom innefattar hemocyte samling från vuxen myggor en tidskrävande steg som innebär noggrann borttagning av ben, vingar och spetsen på buken 16
Vi har för avsikt att utnyttja denna metod i framtida studier för att morfologiskt karakterisera hemocyte celltyper från de olika utvecklingsstadierna i skogen skördade larver. Denna analys kan också ge den första kritiska steget för att isolera friska hemocyter att i detalj granska flera fysiologiska aspekter av insekten cellulära immunsvaret, inklusive effekten av olika utvecklingsstadier och näringsmässiga förhållanden på det totala antalet hemocyter i naiva eller infekterade larver erhållits från deras naturliga miljöer. Med tanke på kronisk exponering för Lepidopteran larver till en rad olika patogener i naturen, liksom den potentiellt kontinuerlig närvaro av sina mikrobiella symbionter, förväntas det att dessa insekter har olika typer av hemocyter med olika egenskaper jämfört med immunceller som finns i laboratorie-uppfödda insekter. Dessutom kan denna hemocyte utvinning protokoll också tillämpas på studier med andra grupper av insekter, vilket immunologiska-relaterade analyser bör införlivas ekologiska fältstudier, vilket ökar vår förståelse av cellulära försvarsmekanismer i icke-modell insektsarter av jordbruks-eller ekologiska betydelse. Sammanfattningsvis kommer vår metod ger en värdefull resurs för insekter biologer, ekologer och de som är intresserade att förstå den funktionella samspelet mellan hemocyte överflöd och förmågan vilda insektspopulationer att motstå mikrobiell eller parasitic infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
TMS stöddes av Harlan Lita Fellowship (GWU) under denna studie. Finansiering för fältet insamling och avel L. Fasciola och E. delphinii lämnades av NSF bevilja DEB 0642438 till JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
