फ्लो आधारित शोधन<em> एस cerevisiae</em> Zygotes
Summary
की युग्मनज को शुद्ध<em> एस cerevisiae</em> संभोग प्रकार विपरीत अगुणित कोशिकाओं लाल या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सह incubated युग्मनज गठन की अनुमति, और fractionated एक प्रवाह cytometry आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे. अंश अत्यधिक समृद्ध बाद "omic" प्रारंभिक संतान का अध्ययन वसूली, और युग्मनज morphogenesis की व्यवस्थित जांच के लिए सक्षम बनाता है.
Abstract
Zygotes कई जीवों के जीवन चक्र के अगुणित और द्विगुणित राज्यों में के बीच आवश्यक मध्यवर्ती, खमीर सहित (1 चित्रा) 1 एस. cerevisiae अलग संभोग प्रकार (माता, MATalpha) की अगुणित कोशिकाओं के संलयन से परिणाम zygotes और इसी स्थिर diploids कि क्रमिक रूप में कई के रूप में 20 उनके strikingly असममित mitotic 2 डिवीजनों का एक परिणाम के रूप में द्विगुणित संतान उत्पन्न करने के लिए जन्म दे. युग्मनज गठन की घटनाओं का एक जटिल अनुक्रम द्वारा करवाया जाता है: इस प्रक्रिया में, घुलनशील संभोग कारकों रिसेप्टर्स मातृपक्षी बाँध, रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेत हैं कि cascades सेल सेल संलयन में सेल चक्र और culminate की रुकावट की सुविधा को ट्रिगर. Zygotes पूर्वज या स्टेम सेल समारोह के लिए एक मॉडल माना जा सकता है.
हालांकि ज्यादा युग्मनज के गठन के बारे में सीखा है और हालांकि zygotes सामान्य signif सेल आणविक सवाल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैicance, लगभग सभी अध्ययन जिसमें zygotes अगुणित कोशिकाओं 3-8 के बहुमत जनसंख्या के साथ intermixed संभोग मिश्रण के इस्तेमाल किया है. युग्मनज गठन के जैव रसायन और युग्मनज का सतत जीवन के कई पहलुओं इसलिए uninvestigated रहते हैं.
खमीर युग्मनज की शुद्धि की रिपोर्ट उनके अवसादन 9 गुणों पर आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन है, तथापि, यह अवसादन आधारित प्रक्रिया हमारे हाथ में लगभग 90% शुद्धता उपज नहीं था. इसके अलावा, यह नुकसान है कि कोशिकाओं hypertonic sorbitol को उजागर कर रहे है. इसलिए हम एक बहुमुखी शोधन प्रक्रिया को विकसित किया है. इस प्रयोजन के लिए अगुणित कोशिकाओं के जोड़े लाल या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त युग्मनज गठन, विभिन्न समय पर काटा, और जिसके परिणामस्वरूप zygotes एक प्रवाह cytometry आधारित छँटाई प्रोटोकॉल का उपयोग कर शुद्ध थे अनुमति सह incubated थे. इस तकनीक को पवित्रता और परिपक्वता का एक सुविधाजनक दृश्य मूल्यांकन प्रदान करता है. औसत पवित्रताअंश का लगभग 90% है. फसल के समय के अनुसार, परिपक्वता की डिग्री बदलती के zygotes बरामद किया जा सकता है. शुद्ध नमूने "omic" अध्ययन के लिए प्रारंभिक संतान की वसूली के लिए, और इस पूर्वज सेल के व्यवस्थित जांच के लिए प्रस्थान का एक सुविधाजनक बिंदु प्रदान करते हैं.
Protocol
Discussion
शुद्ध युग्मनज की उपलब्धता के transcriptomics, प्रोटिओमिक्स और lipidomics, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्र की जांच सहित जैव रासायनिक अध्ययन की सुविधा चाहिए जिसके द्वारा युग्मनज सेल चक्र पुनः प्रवेश, कोशिका दीव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रवाह cytometry, डा. पूर्णिमा जायसवाल और डॉ. Di वू के साथ मदद के लिए पहले और चित्र के साथ मदद के लिए इनपुट इल्या Aylyarov के लिए डॉ. आर माइकल Sramkoski धन्यवाद. NIH अनुदान R01GM089872 और Cytometry प्रकरण व्यापक कैंसर केंद्र (CA43703 P30) की इमेजिंग माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा द्वारा समर्थित है.
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
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