의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em> S. cerevisiae</em> Zygotes
Summary
의 zygotes을 정화하려면<em> S. cerevisiae</em>, 반대 결합 유형의 haploid 세포는 흐름 세포 계측법 기반 프로토콜을 사용하여 빨간색 또는 녹색 형광 접합자 형성을 허용 공동 incubated 단백질, 그리고 fractionated을 표현하도록 설계되었습니다. 높은 강화 분율은 초기 자손의 후속 "omic"연구, 복구 및 접합자 morphogenesis의 체계적인 조사를 할 수 있습니다.
Abstract
Zygotes는 효모 등 여러 생물의 수명주기의 haploid와 diploid 상태 사이의 중요한 중간체, (그림 1) 1. S. 아르 cerevisiae는 별개의 결합 유형 (마타, MATalpha)의 haploid 세포의 융합에서 결과를 zygotes과 연속의 놀랍도록 비대칭 mitotic 부문이의 결과로 많은 20로 diploid의 자손을 생성하는 해당 안정 diploids에 상승을 제공합니다. 접합자 형성은 사건의 복잡한 순서에 의해 조율되어 있습니다 :이 과정에서 용해 결합 요소는 세포 세포 융합에 세포주기와 절정에 달하다 중단을 촉진 수용체 – 매개 신호 폭포를 게재하고, 수용체 기원하기 위해 바인딩합니다. Zygotes는 전구 또는 줄기 세포 기능의 모델로 간주 될 수 있습니다.
대부분 zygotes의 형성에 대해 알게되었지만 및 zygotes는 일반 signif의 휴대 분자 질문을 조사하는 데 사용되었습니다 있지만,icance는 거의 모든 연구 zygotes가 3-8 haploid 세포의 과반수 인구 함유되어있는 결합 혼합물의 사용을 만들었습니다. 접합자 형성 생화학의 여러 측면과 접합자의 지속적인 삶을 따라서 uninvestigated 남아있다.
효모 zygotes의 정화의 보고서는 침강 특성 9 일 기준으로 프로토콜을 설명하지만,이 침전 기반 절차는 우리의 손에 약 90 % 순도를 얻을 수 없습니다. 또한,이 세포는 hypertonic sorbitol에 노출되는 단점이 있습니다. 따라서 우리는 다양한 정화 절차를 개발했습니다. 이러한 목적을 위해, 빨간색 또는 녹색 형광 단백질을 표현 haploid 세포의 쌍 접합자 형성, 다양한 시간에 수확하고, 결과 zygotes이 흐름 세포 계측법 기반 정렬 프로토콜을 사용하여 정제 된 수 있도록 공동 incubated했다. 이 기술은 결함과 성숙의 편리한 시각적 평가를 제공합니다. 평균 순도분수의 약 90 %이다. 수확의 타이밍에 따르면, 성숙의 학위를 변화의 zygotes은 복구 할 수 있습니다. 정화 샘플 초기 자손의 복구를 위해,이 전구 세포의 체계적 조사에 대해 "omic"연구에 대한 출발의 편리한 점을 제공합니다.
Protocol
Discussion
정화 zygotes의 가용성 zygotes는 또한 세포주기 재입국, 세포 벽 개조, 신진 및 상속 특성 등을 받아야하는가 transcriptomics, 단백질 체학 및 lipidomics뿐만 아니라, 메커니즘에 대한 조사를 포함 생화학 연구를 촉진해야 zygotes가 시작 생성 할 수 하나 또는 둘 모두 부모의 특성 변이를 들고 긴장을 갖추고 있습니다. 또한, 정화 zygotes은 haploid 또는 diploid 세포로, 중간 15 % 글리세롤을 포함하는 동안 얼어있을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그림과 도움을 이전 입력 및 일리아 Aylyarov에 대한 유동 세포 계측법, 박사 뿌르 니마 Jaiswal 박사 디 우와 관련하여 도움이 박사 R. 마이클 Sramkoski 감사드립니다. NIH 그랜트 R01GM089872과 세포 계측법 및 사례 종합 암 센터 (P30 CA43703)의 이미징 현미경 핵심 설비의 지원.
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. . Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. . Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
