Summary
وصفنا لإنشاء منهجيات
Abstract
سرطان المبيض الظهاري (EOCs) هي السبب الرئيسي للوفاة من أمراض النساء الأورام الخبيثة في المجتمعات الغربية. على الرغم من التقدم في العلاجات الجراحية وتحسين الكيميائي البلاتيني، كان هناك تحسن طفيف في معدلات البقاء على قيد الحياة لEOC 1،2 أكثر من أربعة عقود. في حين المرحلة الأولى الأورام لديها معدلات البقاء لمدة 5 سنوات> 85٪، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لمرحلة III / IV المرض هي <40٪. وبالتالي، يمكن أن ارتفاع معدلات وفيات EOC انخفضت بشكل ملحوظ إذا تم الكشف عن الأورام في وقت سابق، مراحل، أكثر قابلية للعلاج 3-5. في الوقت الحاضر، ما زال يجهل الأساس الجزيئي الوراثية والبيولوجية في وقت مبكر من مرحلة تطور المرض. وبشكل أكثر تحديدا، لا يعرف إلا القليل عن دور المكروية خلال بدء الورم، ولكن عوامل الخطر المعروفة لEOCs (مثل العمر والتكافؤ) تشير إلى أن المكروية يلعب دورا رئيسيا في نشأة الأولى من EOCs. لذلك قمنا بتطوير نماذج ثلاثية الأبعاد غيرويمن المبيض كل من الطبيعي في وقت مبكر وسرطان المبيض المرحلة. لالمبيض الطبيعي، شاركنا في سطح المبيض الطبيعي مثقف الظهارية (IOSE) والخلايا الليفية اللحمية العادي (INOF) الخلايا، الذي خلده تنبيغ retrovrial من الوحيدات الحفاز لعميم الإنزيم تيلوميراز الإنسان (hTERT) لتمديد عمر هذه الخلايا في الثقافة. في تصميم نموذج المراحل الأولى من التحول المبيض الخلايا الظهارية، overexpression من الجين الورمي CMYC في الخلايا IOSE، ومرة أخرى شارك في تربيتها مع خلايا INOF. واستخدمت هذه النماذج غيروي للتحقيق في آثار الشيخوخة والشيخوخة على التحول وغزو الخلايا الظهارية. نحن هنا وصف الخطوات المنهجية في تطوير هذه نموذج ثلاثي الأبعاد، وهذه المنهجيات ليست محددة لتنمية المبيض الطبيعي والأنسجة سرطان المبيض، ويمكن استخدامها لدراسة أنواع الأنسجة الأخرى حيث التفاعلات الخلية اللحمية والظهارية هي الأساسية جانب من جوانب صيانة الأنسجة وديsease التنمية.
Protocol
يوضح الشكل (1) لمحة عامة عن سير العمل هو موضح أدناه.
1. عزل الخلايا الليفية المبيض عادي وتمديد فترة الحياة في المختبر بواسطة Overexpression من الوحدة الفرعية الحفاز للعميم الإنزيم hTERT
- ويمكن جمع أنسجة المبيض مع موافقة المريض عن علم وموافقة مجلس المراجعة المؤسساتي (على مؤسسات الولايات المتحدة الأمريكية). ويمكن جمع أنسجة المبيض الطبيعي بعد استئصال الرحم في البطن أو استئصال الرحم بالمنظار مجموع الكلي مع التهاب البوق و المبيض الثنائية. في هذه الدراسة، تم فحص أنسجة من قبل الطبيب الشرعي وجزء من المبيض سدى تحتاج فحص للثقافة الخلية. تم حصادها عينات الأنسجة من حوالي 2-5 مم 2 من المنطقة الوسطى من المبيض إلى محاولة تقليل فرصة يستمتع ظهائر المبيض.
- نقل الطازجة أنسجة المبيض إلى الخلية مختبر زراعة الخلايا الليفية في خلد المبيض الطبيعي (INOF) متوسطة النمو، وتستكمل مع المضادات الحيوية الزائدة وantimycotics. INOF المتوسطة النمو (INOF-GM) ما يلي: متوسطة 199 و MCDB105 مختلطة في نسبة 1:1، على أن تستكمل مع مصل بقري جنيني 15٪، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 250 نانوغرام / مل الأمفوتريسين B.
- العمل داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية: إزالة أي الخلايا الظهارية التي لا تزال فضفاضة يعلق على الأنسجة، من خلال غسل العينة مع 5 مل PBS. وكرر أكثر نضح مرتين.
- نقل العينة بالإضافة إلى PBS قطرها 10 سم نظيفة (P100) طبق الثقافة. استخدام ملقط معقم للتعامل مع الأنسجة والمكان الى وجافة 2 P100 طبق الثقافة نظيفة. استخدام مشرط معقم لقطع الأنسجة 0.5 سم 2 قطعة. وضع كل قطعة من النسيج في طبق منفصل وP100 خفض اخر الى قطع <1 مم 2 في الحجم. إضافة 20 مل INOF-GM (بالإضافة إلى المضادات الحيوية وantimycotics)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. رصد نمو الخلايا باستخدام المجهر المرحلة. ويمكن رؤية الخلايا التمسك الطرافة طبق هين 24 ساعة.
- إعادة تغذية بعد أسبوع واحد، وإزالة أي نوع من الأنسجة غير ملتصقة من الطموح. بعد ذلك، refeed الثقافات مرتين في الأسبوع. سوف تشكل مستعمرات الخلايا، عادة في غضون 1-3 أسابيع. مرة واحدة هذه المستعمرات هي كبيرة بما يكفي لثقافة فرعية (بمجرد وصولها إلى حوالي 500 ميكرون)، عزل الحيوانات المستنسخة باستخدام الأقراص المغلفة الاستنساخ التربسين.
تأكيد خلايا ليفية هي 100٪ وخالية من الملوثات الخلوية الأخرى من الطلاء عينة من خط الخلية على coverslips الزجاج وأداء المناعية تلطيخ الفلورسنت لعلامة ليفية (FSP)، علامة الظهارية (عموم cytokeratin) وعلامة الخلية البطانية (فون Willenbrand عامل VIII). - مرور الأولية الخلايا الليفية المبيض الطبيعي (NOF) خلية يعزل من طبق واحد إلى 3 P100 P100 الأطباق قبل يوم واحد من لتنبيغ فيروسات hTERT. يمكن صنع قبل أن تشتري supernatants الفيروسية، أو المنتجة في المنزل باستخدام البروتوكولات القياسية للخلايا HEK293T المشترك بنقل العدوى إلى (انظرالهدف = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
يمكن أن تنتج supernatants فيروسات باستخدام ناقلات pBABE-الرطوبة-hTERT (Addgene). إزالة NOFs من الحاضنة ثم نضح خلية ثقافة المتوسط. أضف 3 مل من طاف الفيروسية لكل طبق: طبق واحد يتلقى hTERT-الارتجاعي، الطبق الثانية 2 يتلقى GFP-الارتجاعي وطبق 3 لا يتلقى أي فيروس. تراكب supernatants الفيروسية مع INOF-GM تحتوي على polybrene لإعطاء تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. إعادة تغذية الخلايا في اليوم التالي مع المتوسط الطازجة. بعد يومين من الإصابة، تبدأ مع اختيار جرعة منخفضة (10 U / مل) هيغروميسين B. بعد سبعة أيام قابلة للزيادة هذه الجرعة إلى 20 U / مل، واختيار يجب أن يكون كاملا في غضون 10-14 يوما. - يمكن عزل الحيوانات المستنسخة معربا عن GFP hTERT أو عن طريق الاستنساخ حلقة بمجرد وصولها إلى حوالي 500 ميكرون. خطوط الخلايا تتطلب توصيف إضافية لتأكيد التعبير الناجح لhTERT والاحتفاظ الأولية ميزات خط الخلية. وهذا ينطوي على: (أ)تأكيد النشاط تيلوميراز بواسطة PCR-ELISA وطول التيلومير، وذلك لطخة أو جنوب PCR 6،7، (ب) التأكد من التعبير عن علامات الحرجة (مثل الأجسام المضادة المناعية مع المضادة للعموم cytokeratin لتحديد الخلايا الظهارية، ومع مضاد لل الأجسام المضادة الخلايا الليفية الخلايا الليفية للبروتين السطح) متشابهة بين الخلايا الأولية وhTERT خلد؛ (ج) التأكد من الخلايا لا يمكن أن تظهر خصائص التحول الأورام (على سبيل المثال باستخدام فحوصات مرسى النمو المستقل)، (د) تمديد يؤكد من العمر في المختبر لوحظ في . معربا عن الخلايا GFP hTERT لكن ليس hTERT، معربا عن الخلايا الليفية ينبغي خلد المبيض الطبيعي (INOFs) تجاوز الشيخوخة تنسخي ولكن ليس أن تتحول neoplastically؛ بالإضافة إلى الخلايا INOF يجب أن نحافظ على التعبير عن بروتين سطح الخلايا الليفية ولكن ليس علامات الظهارية مثل cytokeratin (الشكل 2) .
2. طلاء من الأنسجة الثقافةأطباق ه مع PolyHEMA لزراعة الخلايا غير ملتصقة
- لإعداد حل polyHEMA، تزن 1.5 غرام من polyHEMA، ومكان في زجاجة معقمة. إضافة 95 مل البيولوجيا الجزيئية الإيثانول المطلق الصف و 5 مل زراعة الخلايا الماء المقطر الصف. فإن هيدروجيل polyHEMA تذوب في محتوى الماء من الحل، والإيثانول وتعقيم الإعداد.
- وضع حل polyHEMA في بالحمام المائي في 65 درجة مئوية حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق فترة تصل الى 8 ساعات. لاحظ أنه لا حل polyHEMA يتم تخزين لفترات طويلة من الزمن ولذا يجب أن تكون مستعدة دائما طازجة.
TROUBLESHOOTING: حلول من polyHEMA تتطلب حضانة طويلة مرات في 65 ° C. عكس بانتظام الحل polyHEMA لخلط. اللزوجة وحظ في الجزء السفلي من زجاجة يشير ليست polyHEMA حل كامل والحضانة مرة أخرى في 65 ° C هو مطلوب. - العمل داخل الصفحي هود التدفق، أطباق معطف زراعة الأنسجة مع الحل polyHEMA. أي الاحجاميمكن المغلفة (ه) من صحن زراعة الأنسجة، قارورة أو لوحة multiwell مع polyHEMA. يتم إعطاء كميات الموصى بها من الحل polyHEMA المطلوبة لكل سفينة في الجدول 2.
- تسمح أطباق المزارع الخلوية لتجف داخل الصفحي هود التدفق. هذا قد يستغرق 2-3 أيام. ويمكن استخدام هزاز لطيف على منصة هزاز لضمان طلاء حتى من الأطباق الكبيرة الحجم أو قوارير. إذا كان الحل يجف بسرعة كبيرة polyHEMA قد لا يكون السطح على نحو سلس. لتجنب هذا، وضمان غطاء الطبق / قارورة يبقى على جميع مراحل عملية التجفيف.
- تطبيق معطف الثانية من polyHEMA والسماح ليجف كما هو موضح أعلاه.
TROUBLESHOOTING: ثقوب في طلاء polyHEMA يمكن أن يحدث، وخاصة عندما يجف بسرعة كبيرة جدا لوحات. وتغطي نقرا مزدوجا طلاء لوحات مع polyHEMA يساعد على تغطية الفجوات أو التشققات في الطلاء قبل الاستخدام. لوحات وعادة ما تستغرق 2-3 أيام لكل معطف polyHEMA لتجف وهكذا ينبغي أن تكون مستعدة على الأقل قبل أسبوع وستكون هناك حاجة لأنها ثقافة الخلية. - ويمكن تخزين PolyHEMA المغلفة لوحات في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن أيضا 1٪ الاغاروز حلول، حل PBS 1X في وتعقيمها لتعقيم، أن تستخدم لمعطف الأطباق زراعة الخلايا لخلق سطح غير ملتصقة على المدى القصير زراعة 3D (أقل من أسبوع واحد). الاغاروز طلاء لوحات متعددة جيدا يخلق سطح مقعر تعزز تشكيل كروي واحد لكل بئر لكثير من خطوط الخلايا. ومع ذلك، يعد 3D للثقافات ويوصى polyHEMA طلاء طلاء والاغاروز يتحلل بعد فترات أطول في كثير من الأحيان الثقافة.
3. توليد ثلاثية الأبعاد (3D) وإعادة الأجسام الشبه الكروية غيروي الرضاعة الثقافات 3D
- استعادة وتوسيع مزارع الخلايا الظهارية وINOF في المختبر لإعداد الخلايا ما يكفي لإنشاء الأجسام الشبه الكروية غيروي 3D. ل 'الثقافات الشامل' نحن البذور عادة 2-4x10 6 INOFs في طبق P100-1x10 و 0.5 6 خلايا الظهارية لإعطاء اللحمية: را الظهاريةتيو من 4:1. تزرع الخلايا في INOF المتوسطة النمو INOF (INOF-GM) دون B. الجنتاميسين أو الأمفوتريسين إذا رغبت، يمكن سابقة التجهيز الخلايا الليفية قبل الثقافة 3D (على سبيل المثال لتحريض الشيخوخة، يمكن علاج الخلايا مع شبه قاتلة جرعة من بيروكسيد الهيدروجين ).
- غسل لوحة polyHEMA الجافة مع 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق. نضح في برنامج تلفزيوني واستبدالها مع 15 مل INOF-GM.
- وفي الوقت نفسه، يعرض للتريبسين خلد الخلايا الليفية الخلايا الطبيعية المبيض لفصل بينها وبين الطبق والثقافة، وبعد 3-5 دقائق مع تحييد التربسين حجم مساو من وسائل الإعلام والثقافة بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف. إنشاء تعليق وحيد الخلية من resuspending بيليه خلية في 5 مل INOF-GM، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing بلطف. تحديد تركيز الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولتر تعليق الخلية و 10 ميكرولتر التريبان الأزرق وتعداد باستخدام عدادة الكريات. يمكن التريبان الأزرق استبعاد أن استخدامد لتحديد الخلايا الحية.
- إضافة الخلايا 4x10 6 إلى INOF وسيلة الاستغناء بالفعل في لوحة polyHEMA المغلفة. تشكل وسائل الإعلام الثقافة لحجم 20 مل باستخدام حجم مناسب لالعذبة INOF-GM واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تبدأ الخلايا في الأجسام الشبه الكروية لتجميع متعددة الخلايا خلال 24 ساعة. يمكن رصدها بواسطة المجهر تشكيل كروي المرحلة.
عد دقيق لأعداد كروي في ظل ظروف صعبة الثقافة الجماهيرية، ولكننا نقدر أن نحصل على الأجسام الشبه الكروية عندما 50-100 ومطلي 4x10 6 خلايا انسجة. أحجام تتراوح عادة كروي 80-250 ميكرون. - إعادة تغذية الثقافات كروي كل 2-3 أيام من الراحة لوحات بزاوية على ماصة توضع داخل غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق. الأجسام الشبه الكروية تسمح لتسوية. وهذا قد يستغرق فترة تصل الى 20 دقيقة. إزالة بعناية استنفدت وسائل الإعلام مع ماصة 5 مل، فقط حتى حوالي 4 مل البقاء في الطبق. والحرص على عدم نضح في الأجسام الشبه الكروية. إعادة تغذية مع 16 مل INO جديدةF-GM والعودة إلى الحاضنة.
- في يوم 7، إضافة إلى الخلايا الظهارية الأجسام الشبه الكروية الخلايا الليفية لخلق ثقافات غيروي على النحو التالي. إعداد معلقات من الخلايا الظهارية المبيض (عادي ظاهريا أو تحويلها) من trypsinization كما هو موضح في القسم 3،4-3،5. تحديد تركيز الخلية باستخدام عدادة الكريات. يغسل مرة واحدة في INOF-GM لمنع أي من عوامل النمو التي تقوم على وسائل الإعلام من النمو الظهاري.
في المختبر لدينا، طبيعية سطح المبيض الظهاري جمعت الخلية osec. خطوط بموافقة المريض عن علم من إزالتها عن طريق استئصال الرحم المبايض في البطن أو استئصال الرحم بالمنظار مجموع الكلي مع التهاب البوق و المبيض الثنائية. ونحى المبايض مع cytobrush معقمة لجمع ظهارة. تم إنشاء خطوط الخلايا الأولية وtransduced مع hTERT باستخدام النهج المذكورة أعلاه. تفاصيل الثقافة OSEC في 2D، يمكن العثور على 3D وتخليد OSEC في المراجع 10 و 11. - لتشكيل SPH غيرويeroids، أولا إعادة تغذية الخلايا الليفية ثقافات الأجسام الشبه الكروية وحدها. ثم تطعيم الثقافات الخلايا الليفية كروي مع 6 خلايا الظهارية 1x10 في نسبة الخلايا الليفية إلى 4:01 الخلايا الظهارية. ثقافة الأجسام الشبه الكروية في غيروي INOF-GM.
- إعادة تغذية الثقافات غيروي كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما إضافية.
4. تجهيز التصوير الجزيئي وتحليلات
- ويمكن استخدام تقنيات مختلفة لتحليل الأجسام الشبه الكروية غيروي. للتصوير، فمن المستحسن أن يتم حصاد الأجسام الشبه الكروية من الطبق الثقافة مع ماصة 25 مل. سوف Pipetting ببطء تقليل فرص قوى القص تعطيل بنية كروي. ويمكن بعد ذلك أن تغسل الأجسام الشبه الكروية في برنامج تلفزيوني ومكعبات بلطف بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 10 دقيقة؛ قوات أعلى الطرد المركزي قد تؤدي إلى تلف الأجسام الشبه الكروية. وبدلا من ذلك، يمكن نقل الثقافات إلى أنبوب 50 مل الصقر وسمح لتسوية، والمتوسطة النمو ثم إزالتها.
- لimmunohistoمخزنة الكيمياء، وتحديد الأجسام الشبه الكروية مع الفورمالين محايدة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيليه على الأجسام الشبه الكروية واستبدال الفورمالين مع الايثانول 70٪. العملية في البارافين باستخدام بروتوكولات القياسية المستخدمة في الأنسجة البشرية. الأجسام الشبه الكروية يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع، وإما ملطخة hematoxylin و eosin أو علامات محددة باستخدام الجزيئات المناعية القياسية (الشكل 3).
- وبدلا من ذلك، يمكن غسلها في إصلاح الأجسام الشبه الكروية PBS في بارافورمالدهيد 4٪ (أعد PBS)، جزءا لا يتجزأ في درجة الحرارة المثلى للقطع المتوسطة والمفاجئة أكتوبر تجميدها لباجتزاء المجمدة وتلطيخ مناعي.
- لالتحليلات الجزيئية، يمكن حصاد الأجسام الشبه الكروية، وغسلها مرتين مكعبات في برنامج تلفزيوني قبل lysing الخلايا لDNA، RNA أو استخراج البروتين.
- لتحليلها من قبل التدفق الخلوي، يمكن غسلها الأجسام الشبه الكروية في برنامج تلفزيوني وفصلها بواسطة التربسين الهضم أو accutase في C. ° 37 للقيام بذلك، غمر أنبوب فالكون يحتوي على الأجسام الشبه الكروية طNA بالحمام المائي لتسهيل trypsinization. ويمكن تعزيز التفكك الكامل للالأجسام الشبه الكروية في تعليق خلية واحدة من الحل pipetting صعودا وهبوطا مع نصيحة 1 مل ماصة. والحرص على عدم الإفراط في الخلايا يعرض للتريبسين.
تحييد التفاعل مع حجم مساو من ثقافة المتوسط وإزالة كتل الخلايا وذلك بتمرير التعليق من خلال مصفاة الخلية ميكرومتر 40-70. بيليه الخلايا، وغسل مع PBS، تعداد و resuspend الرقم المطلوب من الخلايا في المخزن المؤقت FACS. وصمة عار الخلايا وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
5. ممثل النتائج
ويمكن استخدام هذا النهج لمجموعة واسعة من التطبيقات، ودراسة علم الأحياء المبيض العادي فضلا عن بدء دراسة سرطان المبيض. والميزة الرئيسية لهذا النهج على الثقافات 3D التي تم إنشاؤها باستخدام هلام المتاحة تجاريا المصفوفة خارج الخلية هو أن الخلايا الليفية تنتج المبيض الطبيعي المصفوفة خارج الخلية التي تجعل شع لب الأجسام الشبه الكروية. في تجربتنا، والمواد التي تنتجها الخلايا الليفية مصفوفة المبيض الطبيعي هو غير متجانسة وأكثر شبها المصفوفة خارج الخلية من المبيض من أي هلام مصفوفة متاحة تجاريا. في المختبر لدينا نحن تستخدم الخلايا الظهارية التي تم تحويلها جزئيا في المختبر باستخدام عناصر جينية محددة (مثل overexpression CMYC) وشارك في هذه الخلايا المستزرعة مع الخلايا الليفية المبيض الطبيعي وهرمة لتقليد في مرحلة مبكرة سرطان المبيض في المبيض بعد انقطاع الطمث. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن الشيخوخة المكروية يعزز الميزات الأورام (مثل انتشار) من الخلايا الظهارية تحولت جزئيا (الشكل 3)، في حين أن يمنع تطور طبيعي المكروية الأورام 8. وقد استخدمت مختبرنا وغيرها أيضا نهج مماثل لنموذج الخلايا الظهارية المبيض الطبيعي 9، الخلايا الظهارية قناة فالوب، ونماذج تدريجي من تطور الأورام
الشكل 1. والمغلفة مرتين نظرة عامة التخطيطي للبروتوكول لزراعة غيروي 3D. قوارير زراعة الأنسجة بمحلول polyHEMA 1٪ ويترك ليجف. تغسل البلاستيك المغلفة مع PolyHEMA 1X PBS مباشرة قبل الاستعمال. ومطلي خلد الخلايا الليفية الخلايا الطبيعية المبيض (4x10 6 خلايا) في قارورة مع 20 مل المتوسطة النمو. تشكيل كروي والنمو رصد أكثر من 7 أيام. عند هذه النقطة، يتم تلقيح الثقافات كروي الخلايا الليفية مع 6 خلايا الظهارية 1x10، وهي أنواع الخلايا المستزرعة رئيسين لمدة 14 يوما قبل أن يتم حصاد الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا ومعالجتها للتطبيقات المصب (التحاليل الجزيئية، والتصوير، الخ).
الشكل 2. المناعي من تلطيخ <hTERT/ م> خلد الخلايا الليفية المبيض الطبيعي. المرحلتين الابتدائية الخلايا الليفية المبيض الطبيعي (PR NOFs) وخلد الخلايا الليفية المبيض الطبيعي (INOFs) صريحة البروتين الليفية محددة (FSP)، لا تعبر عن cytokeratin-7 (المسيخ-7) وسرعة vimentin (VIM) . وتظهر علامات الاهتمام باللون الأخضر، اتسخت DNA مع دابي وأظهرت باللون الأزرق، والأزرق مع السيتوبلازم counterstained ايفان وأظهرت باللون الأحمر.
الشكل 3. المناعية للمشاركين في مثقف الخلايا اللحمية والظهارية. اللوحة اليمنى وضعها الطبيعي كروي الخلايا الليفية الأحادية المبيض، ملطخة hematoxylin و eosin من قبل. الخلايا الليفية الخلايا الطبيعية المبيض مثقف وحده في شكل 3D الأجسام الشبه الكروية تتكون من خلايا مع مورفولوجيا spindled والمصفوفة خارج الخلية وفيرة. الحق وحة: تعرضت الخلايا الليفية المبيض الطبيعي أن بيروكسيد الهيدروجين للحث على الشيخوخة. خلايا المبيض الظهاري تتحول جزئيا (IOSE
الشكل 4. الميزات النسيجي للخلايا الأنسجة مثقف 3D تعكس الأولية. (A) واضح سرطان المبيض الخلية عرض مميزة هياكل الخلية واضحة، وهذه هي غائبة عندما تزرع واضحة خطوط EOC الخلية على الهياكل البلاستيكية لكنها متشابهة عندما يتم الكشف عن تزرع الخلايا نفس الأجسام الشبه الكروية 3D ( B). (C) صورة مجهرية الإلكترون المسح من الخلايا الظهارية المبيض العادي كما نمت الأجسام الشبه الكروية لمدة 14 يوما. زغيبات سطح مرئية (الأسهم). (D) خلية مصلية الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض خط، في الثقافة. (A، B) hematoxylin و eosin تلطيخ من البارافين مقطوع جزءا لا يتجزأ من نسيج الورم أو الأجسام الشبه الكروية 3D، (C) المسح المجهري الإلكترون، (D) المجهر النقيض من المرحلة. يمكن أن تكون كروية الأجسام الشبه الكروية (دائرة متقطع)أو عدم انتظام في الشكل، كما في حالة لهيكل ينظر في الجانب الأيسر من الصورة.
| طبق / الحجم بلايت | حجم PolyHEMA (ليتم تطبيقها مرتين) | ثقافة الإعلام الحجم النهائي |
| 6 لوحة جيدا | 3 مل | 5-7 مل |
| 12-وحة جيدا | 1.5 مل | 2 مل |
| 24 لوحة جيدا | 500 ميكرولتر | 1.5 مل |
| 48-وحة جيدا | 250 ميكرولتر | 500 ميكرولتر |
| 96-وحة جيدا | 50 ميكرولتر | 200 ميكرولتر |
| P100 الثقافة طبق | 4-5 مل | 20 مل |
| P60 الثقافة طبق | 2-3 مل | 5-7 مل |
| F25 قارورة | 2-3 مل | 7 مل |
| F75 قارورة | 4-5 مل | 20-30 مل |
| F175 قارورة | 15 مل | 30-50 مل |
الجدول 2. يوصى به مجلدات لطلاء polyHEMA وزراعة 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ما زال يجهل الكثير عن بيولوجيا في مرحلة مبكرة سرطان المبيض الظهاري (EOC). ربما كان واحدا من العقبات الرئيسية في هذا المجال لسنوات عديدة وعدم فهم أصول الأنسجة محددة لهذا المرض، وأهمية دور المكروية في التنمية EOC. على مدى السنوات القليلة الماضية، وأصبح من الواضح أن EOC هو مرض غير متجانسة مع أنواع فرعية متعددة histophathological متميزة، وربما مع أصول الخلوية مختلفة لأنواع فرعية مختلفة. على سبيل المثال، فإن البيانات الحالية تشير إلى أن الدرجة العالية EOCs المصلي قد تنشأ من الخلايا الإفرازية فالوب سواء أنبوب الظهارية وخلايا سطح المبيض الظهاري، على الأقل ويعتقد أن نسبة من الخلايا شبيهة ببطانة الرحم وEOCs واضحة لبطانة الرحم تنشأ من المبيض (ورم بطاني رحمي)، و قد تنشأ عن EOCs موسينية paraovarian أو مجاور للبوق من نوع ظهارة الانتقالية 15،16. ومع ذلك، هناك كانت محدودة فقط في المختبر و<em> في الجسم الحي من نماذج تطور المرض لأي من هذه histotypes. في النمذجة المختبر غيروي من EOC لدراسة الورم الظهاري سدى، والتفاعلات المرتبطة المكروية سرطان المبيض النامية هي منطقة أقل تطورا من البحوث. ستروما الورم ومن المرجح أن يكون مصدر كل المؤشرات الحيوية الورم، وكذلك رواية هدفا للعلاج. تطوير واستخدام نماذج غيروي من EOC قد يكون ذلك المفتاح لتحديد المؤشرات الحيوية المرتبطة بأمراض رواية مرحلة مبكرة يمكن استخدامها كجزء من برنامج الفحص والكشف المبكر عن المرض، أو للتعرف على الرواية، والأهداف العلاجية لتحسين druggable نظم العلاج للمرضى مع تشخيص EOC.
والأهم من ذلك، يمكن استخدام النماذج التي وصفناها لاكتساب فهم أعمق للتغيرات الأساسية المظهري والجزيئي التي تحدث أثناء بدء EOC وأوائل تطور المرض. فمن الواضح الآن أن الأنواع الفرعية المختلفة لها ملامح EOC الجزيئية متميزة، الخصائص السريرية وعلم الأحياء الأساسية. من خلال توليد مكتبة من خلايا السلائف EOC ونمذجة تطوير كل سلالة السرطان، بما في ذلك التأثيرات microenvironmental، قد يكون من الممكن للحصول على أفكار جديدة في تطوير histotypes EOC من خلال النماذج التي تعكس بدقة تطور المرض في حالة الإنسان. ويمكن تطبيق المنهجيات وصفنا لمجموعة واسعة من الدراسات والتطبيقات، بما في ذلك دراسة الأورام الصلبة الأخرى. لقد اختبرنا قدرة كروي تشكيل أكثر من خمسين في مختلف عادية وتتحول خطوط الخلايا المبيض حتى الآن، وأشار إلى أن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا قادرة على تشكيل الأجسام الشبه الكروية عندما مطلي بكثافة عالية على الخلايا المغلفة لوحات polyHEMA. ولذلك فإننا نتوقع أن النماذج زراعة الخلايا من أجهزة الثدييات الأخرى، وكذلك يمكن أيضا أن الأنواع الأخرى المستزرعة في 3D باستخدام هذا النهج.
ve_content "> هذه النهج قد تمثل تقدما خصيصا لدراسة دور المكروية خلال بدء الورم، على سبيل المثال في دراسات تفاعلات جسدية منفصلة الانحرافات الجينية في الخلايا الظهارية السرطانية الموجودة بالتزامن مع المتغيرات microenvironmental محددة. لقد أظهرنا أن التغيرات المظهرية يمكن في الخلايا اللحمية تؤثر الظهارية النمط الظاهري الخلية 8. عن طريق تغيير أنواع الخلايا المدرجة في هذا النموذج، يمكن للمرء أن التحقيق ما إذا كانت الخلايا اللحمية مختلفة تؤثر بشكل مختلف انتشار الخلايا الظهارية، وكذلك التعبير عن علامات أخرى محددة مثل علامات المرتبطة غزو أو ورم خبيث. وعلاوة على ذلك، فإن هذه ويمكن أيضا أن تستخدم النماذج في دراسة مرض حميدة وطبيعية فسيولوجيا المبيض، فعلى سبيل المثال، يمكن أن تستخدم مثل هذه النماذج 3D في الدراسات الخصوبة لتقييم دور سدى المبيض بويضة خلال النضج.لدراسة مساهمة ميلcroenvironment في التنمية EOC ودور الخلايا الليفية بالسرطان المرتبطة المبيض في EOCs الخبيثة، ويمكن أيضا أن تتكيف هذه النماذج من خلال المشاركة في زراعة خلايا سرطان المبيض مع الخلايا الليفية المعزولة من عينات الورم. ويمكن أيضا أكثر تعقيدا الثقافات أن تتولد عن طريق إدخال إضافية، أنواع الخلايا ذات الصلة في هيكل غيروي. على سبيل المثال، يمكن للنموذج التفاعلات الخلية اللحمية والظهارية التي قمنا بتطويرها تكملها مع إدخال الخلايا الحبيبية، أو البطانية الخلايا المناعية. وهناك احتمال آخر يتمثل في المشاركة في الثقافة الأخرى أنواع الخلايا السلائف في المبيض نموذج سدى، مثل الخلايا الظهارية من قناة فالوب وبطانة الرحم. ومن الممكن أيضا في تصميم نموذج التفاعلات نظير الصماوي الإضافية التي من المقترح أن تكون مهمة خلال بدء EOC. على سبيل المثال، يمكن إدخال هرمونات الستيرويد في النموذج غيروي، أو يمكن التعبير عن الجينات تعمل نظير الصماوي قلق حصريا في المقصورة واللحميةالتأثير على الخلايا الظهارية قياسها.
يتم تحديد غالبية سرطانات المبيض في مرحلة متأخرة، وبعد المرض على نطاق واسع في جميع أنحاء والصفاق. يمكن تشخيص سرطان المبيض عندما المترجمة إلى المبايض (المرحلة 1) علاجها على نحو فعال مع الجراحة وفي أكثر من 90٪ من الحالات ويشفى المريض من المرض. من الواضح أن استراتيجيات الكشف المبكر عن سرطان المبيض المبيض يمكن أن تقلل إلى حد كبير الإصابة بالأمراض السرطانية والوفيات. من خلال الحصول على فهم أعمق لتطور المرض في مرحلة مبكرة باستخدام نهج النمذجة عضوي النمط مثل تلك الموضحة هنا، ومن المتوقع أن يتم كشف فرص جديدة للكشف عن المرض في السكان المعرضين للخطر وترجمتها في نهاية المطاف في الممارسة السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم إجراء هذا البحث في كلية كيك للطب في جامعة كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية، وجامعة كوليدج في لندن، المملكة المتحدة. ويتم تمويل KL من المعهد الوطني للمنحة الصحة 5 U19 CA148112-02. وقد تم تمويل BG المشروع من خلال منحة من المؤسسة الخيرية الاستئناف عشية الأورام النسائية (UK). وبعض هذه الأعمال التي اضطلعت في UCLH / UCL تمويل جزئي من وزارة الصحة بحوث الطبية الحيوية NIHR نظام التمويل المركز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
