Summary
Se describen las metodologías para el establecimiento de
Abstract
Cánceres epiteliales de ovario (EOC) son la principal causa de muerte por neoplasia ginecológica en las sociedades occidentales. A pesar de los avances en los tratamientos quirúrgicos y mejores quimioterapias a base de platino, ha habido pocas mejoras en las tasas de supervivencia COE durante más de cuatro décadas 1,2. Mientras que los tumores en estadio I tienen 5 años las tasas de supervivencia> 85%, las tasas de supervivencia para el estadio III / IV de la enfermedad son <40%. Así, las altas tasas de mortalidad por EOC podría disminuir significativamente si los tumores se detectan en las primeras y más tratables, etapas 3-5. En la actualidad, la base genética molecular y biológica de la enfermedad en etapa temprana de desarrollo se entiende poco. Más específicamente, se sabe poco sobre el papel de la microambiente durante la iniciación del tumor, pero los factores de riesgo conocidos para los EOC (por ejemplo la edad y la paridad) sugieren que el microambiente juega un papel clave en la génesis temprana de EOC. Por lo tanto, desarrollado modelos tridimensionales heterotípicastanto del ovario normal y de las primeras etapas de cáncer de ovario. Para el ovario normal, co-cultivadas superficie epitelial ovárico normal (pierdes) y fibroblastos normales del estroma (INOF) las células, inmortalizada por la transducción retrovrial de la subunidad catalítica de la telomerasa humana holoenzyme (hTERT) para extender la vida útil de estas células en cultivo. Para modelar las primeras etapas de transformación de la célula epitelial de ovario, la sobreexpresión del oncogén cmyc en células Iosé, de nuevo co-cultivadas con células INOF. Estos modelos heterotípicas se utilizaron para investigar los efectos del envejecimiento y la senescencia en la transformación y la invasión de las células epiteliales. Aquí se describen los pasos metodológicos en el desarrollo de estos modelo tridimensional; estas metodologías no son específicos para el desarrollo de ovario normal y tejidos de cáncer de ovario, y podría ser utilizado para estudiar otros tipos de tejido, donde las interacciones de células estromales y epiteliales son un fundamental aspecto del mantenimiento del tejido y dimedad desarrollo.
Protocol
La Figura 1 ilustra una vista general del flujo de trabajo se describe a continuación.
1. Aislamiento de los fibroblastos normales del ovario y extensión de la vida útil in vitro por la sobreexpresión de la subunidad catalítica de la holoenzima hTERT
- Tejidos ováricos pueden ser recogidos con el consentimiento informado del paciente y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (para instituciones de Estados Unidos). Los tejidos normales de ovario se puede recoger después de una histerectomía total abdominal o histerectomía laparoscópica total con salpingo-ooforectomía bilateral. En este estudio, los tejidos fueron examinados por un patólogo y una parte del estroma ovárico biopsia para cultivo celular. Las muestras de tejido de aproximadamente 2-5 mm 2 se cosecharon a partir de la región central del ovario para tratar de reducir la probabilidad de muestreo también el epitelio ovárico.
- Transportar tejido ovárico fresco al laboratorio de cultivo celular en fibroblastos inmortalizados ovárica normal (ENDE) medio de crecimiento, suplementado con antibióticos y antimicóticos adicionales. INOF medio de crecimiento (INOF-GM) comprende: Medium 199 y se mezcla en una proporción de 1:1, suplementado con suero fetal bovino 15%, 2 mM L-glutamina, 50 mg / ml de gentamicina y 250 ng / ml de anfotericina B. MCDB105
- Trabajar dentro de una cabina de bioseguridad: eliminar las células epiteliales que permanecen ligeramente unidos al tejido, lavando la muestra con 5 ml de PBS. Aspirar y repite dos veces más.
- Transferir la muestra más PBS en un cm de diámetro limpio 10 (P100) placa de cultivo. Utilice pinzas estériles para manipular el tejido y colocarlo en un segundo plato seco P100 cultivo limpio. Utilice bisturí estéril para cortar el tejido de 0,5 cm 2 piezas. Coloque cada pieza de tejido en un plato separado P100 y recorte en trozos <1 mm de tamaño 2. Añadir 20 ml INOF-GM (más antibióticos y antimicóticos), y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Controlar el crecimiento celular mediante microscopía de fase. Las células se pueden ver adherirse a la ingenio plato hin 24 horas.
- Re-alimentación después de una semana, la eliminación de cualquier tejido no adherentes por aspiración. A partir de entonces, realimentar cultivos dos veces a la semana. Las células se forman colonias, generalmente dentro de 1-3 semanas. Una vez que estas colonias son suficientemente grandes para subcultivo (una vez que alcanzan alrededor de 500 micras), aislar los clones usando tripsina recubiertos con discos de clonación.
Confirmar células son 100% fibroblástica y libre de otros contaminantes celulares mediante siembra de una muestra de la línea de células en cubreobjetos de vidrio y la realización de inmuno-tinción fluorescente para un marcador fibroblástico (FSP), un marcador epitelial (pan-citoqueratina) y un marcador de células endoteliales (von Willenbrand Factor VIII). - Pasaje primario de fibroblastos normales de ovario (NOF) de células aisladas de un solo plato P100 P100 en 3 platos un día antes de la transducción retroviral de hTERT. Pre-hechos sobrenadantes virales pueden ser comprados o producidos internamente utilizando protocolos estándar para las células HEK293T co-transfección (véasetarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Sobrenadantes retrovirales se pueden producir usando el vector pBABE-Hygro-hTERT (Addgene). Eliminar NOF de la incubadora y luego aspirar el medio de cultivo celular. Añadir 3 ml de sobrenadante viral a cada placa: un plato recibe hTERT-retrovirus, el plato nd 2 recibe GFP-retrovirus y el tercer plato no recibe ningún virus. Superponer sobrenadantes virales con INOF-GM que contiene polibreno para dar una concentración final de 8 mg / ml. Piensos Re-células el día siguiente con medio fresco. Dos días después de la infección, comenzar con dosis bajas de selección (10 U / ml) higromicina B. Después de siete días pueden ser este aumento de la dosis a 20 U / ml; selección debe ser completa dentro de 10-14 días. - Los clones que expresan hTERT o GFP se puede aislar por clonación de anillo una vez que alcanzan alrededor de 500 micras. Las líneas celulares requieren caracterización adicional para confirmar el éxito de expresión de hTERT y la retención de las características principales de la línea celular. Esto implica: (a)confirmar la actividad de telomerasa mediante PCR-ELISA y la longitud del telómero, por Southern blot o PCR 6,7, (b), que confirma la expresión de marcadores críticos (por ejemplo, la inmunotinción con un anticuerpo anti-pan-citoqueratina para identificar las células epiteliales, y con una anti- superficie de fibroblastos anticuerpo de proteína para los fibroblastos) son similares entre las células primarias y hTERT inmortalizado-; (c) confirmar que las células no muestran propiedades de transformación neoplásica (por ejemplo, usando ensayos de crecimiento independiente del anclaje), (d) la extensión de confirmar in vitro vida útil observada en células que expresan hTERT. pero no GFP-expresando hTERT inmortalizado fibroblastos normales del ovario (INOFs) debe pasar por alto la senescencia replicativa, pero que no se transforme neoplásicamente; adicionalmente las células INOF debe mantener la expresión de la proteína de superficie de fibroblastos pero no marcadores epiteliales, tales como la citoqueratina (Figura 2) .
2. Recubrimiento de Cultur TissuePlatos E con poliHEMA para cultivo de células no adherentes
- Para preparar la solución poliHEMA, pesar 1,5 g poliHEMA, y colocar en un frasco estéril. Añadir 95 ml biología molecular grado etanol absoluto y 5 ml de cultivo celular de agua destilada de grado. El hidrogel de poliHEMA se disolverá en el contenido de agua de la solución, y el etanol se esterilizar la preparación.
- Colocar la solución de poliHEMA en un baño de agua a 65 ° C hasta que se disuelva completamente. Esto puede tomar hasta 8 horas. Tenga en cuenta que la solución poliHEMA no se puede almacenar durante largos períodos de tiempo y por lo que siempre debe estar recién preparado.
Problema: Soluciones de poliHEMA requieren largos tiempos de incubación a 65 ° C. Regularmente invertir la solución poliHEMA para mezclar. Viscosidad observada en la parte inferior de la botella de vidrio indica la poliHEMA no se haya disuelto completamente y una incubación adicional a 65 ° C es necesaria. - Trabajar dentro de una campana de flujo laminar, capa platos de cultivo de tejidos con la solución de poliHEMA. Cualquier size de placa de cultivo tisular, frasco o placa de múltiples pocillos puede ser recubierta con poliHEMA. Volúmenes recomendados de solución poliHEMA requerido para cada recipiente se dan en la Tabla 2.
- Deje que los platos de cultivo celular para secar el interior de la campana de flujo laminar. Esto puede tomar de 2-3 días. Balanceo suave en una plataforma oscilante se puede utilizar para garantizar una cobertura uniforme de mayor tamaño platos o frascos. Si se seca la solución poliHEMA demasiado rápido de la superficie no puede ser lisa. Para evitar esto, asegurar la tapa de la placa / matraz permanece encendida durante el proceso de secado.
- Aplicar una segunda capa de poliHEMA y dejar secar como se ha descrito anteriormente.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Los agujeros en el revestimiento poliHEMA puede ocurrir, sobre todo cuando las placas se seque demasiado rápido. Doble recubrimiento de las placas con poliHEMA ayuda para cubrir los huecos o grietas en el revestimiento están cubiertos antes de su uso. Las placas suelen tardar 2-3 días para que cada capa se seque poliHEMA por lo que debe estar preparado por lo menos una semana antes de que sean necesarios para el cultivo celular. - PoliHEMA placas recubiertas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.
NOTA: 1% soluciones de agarosa, se disolvió en PBS 1X y en autoclave para esterilizar, también se puede utilizar para recubrir platos de cultivo celular para crear una superficie no adherente a corto plazo cultivo 3D (menos de una semana). Recubrimiento de agarosa de placas de múltiples pocillos crea una superficie cóncava que promueve la formación de un esferoide solo por pocillo para muchas líneas celulares. Sin embargo, para los cultivos más 3D recubrimiento poliHEMA se recomienda como recubrimiento de agarosa con frecuencia se desintegra después de períodos de cultivo más largos.
3. Generación de tres dimensiones (3D) Spheroids heterotípicos y Re-alimentación de las culturas 3D
- Recuperar y ampliar los cultivos de células epiteliales y INOF in vitro para preparar suficientes células para el establecimiento de 3D esferoides heterotípicos. Para las "culturas de masas que normalmente semillas de 2 4x10 6 INOFs por P100 plato y 0,5-1x10 6 células epiteliales para dar un estroma: epitelio ratio de 4:1. INOF células se cultivan en medio de crecimiento INOF (INOF-GM) sin gentamicina o anfotericina B. Si se desea, las células de fibroblastos puede ser pretratada antes del cultivo 3D (por ejemplo, para la inducción de la senescencia, las células pueden ser tratadas con dosis subletales de peróxido de hidrógeno ).
- Lavar una placa de poliHEMA seco con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min. Aspirar el PBS y reemplazar con 15 ml INOF-GM.
- Mientras tanto, Tripsinizar inmortalizada normal de las células de fibroblastos de ovario para separarlas de la placa de cultivo, después de 3-5 min neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio de cultivo y sedimentar las células por centrifugación a 450 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante. Crear una única suspensión de células resuspendiendo el pellet de células en 5 ml INOF-GM, mezclar bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo o vórtex suavemente. Determinar la concentración de células mediante la mezcla de 10 l de suspensión celular y 10 l azul de tripano y enumerar utilizando un hemocitómetro. Trypan azul exclusión se puede utilizard para identificar células vivas.
- Añadir 4x10 6 células INOF al medio ya dispensa en la placa de poliHEMA-revestido. Completar el volumen medio de cultivo a 20 ml con un volumen apropiado de fresco INOF-GM y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Las células comienzan a agregarse en esferoides multicelulares dentro de 24 hr. Formación de esferoides se puede controlar mediante microscopía de fase.
Recuento preciso del número de esferoides en condiciones de cultivo de comunicación es difícil, pero se estima que obtenemos 50-100 esferoides cuando 4x10 6 células estromales se siembran. Esferoide tamaños varían típicamente 80 a 250 micras. - Volver a alimentar a los cultivos de esferoides de cada 2-3 días en reposo las placas en un ángulo en una pipeta colocada dentro de la campana de flujo laminar. Permita que los esferoides se asiente. Esto puede tomar hasta 20 minutos. Retire cuidadosamente los medios agotados con una pipeta de 5 ml, hasta que sólo aproximadamente 4 ml permanecer en el plato. Tenga cuidado de no aspirar los esferoides. Re-alimentación con 16 ml INO frescoF-GM y volver a la incubadora.
- El día 7, las células epiteliales para añadir esferoides fibroblastos para crear cultivos heterotípicas de la siguiente manera. Preparar suspensiones de células epiteliales de ovario (fenotípicamente normal o transformado) por tripsinización como se describe en la sección 3.4-3.5. Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro. Lavar una vez en INOF-GM para evitar los factores de crecimiento de ser prorrogados de los medios de cultivo epiteliales.
En nuestro laboratorio, la superficie ovárica normal de células epiteliales (OSEC) líneas se obtuvieron con el consentimiento informado del paciente a partir de ovarios extraídos por histerectomía total abdominal o histerectomía laparoscópica total con salpingo-ooforectomía bilateral. Los ovarios se cepillan con un citocepillo estéril para recolectar el epitelio. Líneas celulares primarias se establecieron y transducidas con hTERT utilizando el enfoque descrito anteriormente. Detalles de la cultura OSEC en 2D, 3D y inmortalización OSEC se pueden encontrar en las referencias 10 y 11. - Para formar pliegos heterotypiceroids, primero re-alimentación de las culturas de los fibroblastos esferoides solo. Entonces inocular cultivos de fibroblastos esferoide con 1x10 6 células epiteliales en una proporción de 4:1 fibroblastos a las células epiteliales. Cultura en los esferoides heterotípicos INOF-GM.
- Vuelva a alimentar cultivos heterotípicos cada 2-3 días para un período adicional de 14 días.
4. Procesamiento de la Imagen y Análisis Molecular
- Muchas técnicas diferentes se pueden utilizar para analizar los esferoides heterotípicas. Para las imágenes, se recomienda que los esferoides se recogen de la placa de cultivo con una pipeta de 25 ml. Pipeteado lentamente minimizar las posibilidades de las fuerzas de cizallamiento que perturban la arquitectura del esferoide. Esferoides luego se puede lavar en PBS y se sedimentaron por centrifugación suave a 100 xg durante 10 min; fuerzas centrífugas superiores pueden dañar los esferoides. Alternativamente, los cultivos pueden ser transferidas a un tubo Falcon de 50 ml y se dejó sedimentar, y el medio de crecimiento después se retira.
- Por inmunohistoquímicaquímica, fijar esferoides con formalina tamponada neutra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se precipitan los esferoides y reemplazar la formalina con 70% de etanol. Proceso en parafina utilizando protocolos estándar utilizados para los tejidos humanos. Esferoides embebidos en parafina puede ser seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina o marcadores moleculares específicos mediante inmunohistoquímica estándar (Figura 3).
- Alternativamente, esferoides lavadas en PBS se puede fijar en 4% de paraformaldehído (preparado en PBS), incrustado en una temperatura óptima de corte medio y octubre congelaron rápidamente para la sección congelada y la tinción de inmunofluorescencia.
- Para los análisis moleculares, los esferoides pueden ser cosechadas, se sedimentaron y se lavaron dos veces en PBS antes de lisar las células para el ADN, el ARN o la extracción de proteínas.
- Para el análisis por citometría de flujo, esferoides pueden ser lavados en PBS y se disociaron con tripsina o la digestión Accutase a 37 ° C. Para ello, sumerja el tubo Falcon contiene esferoides ina baño de agua para facilitar la tripsinización. La disociación completa de los esferoides en una suspensión de células individuales puede ser promovida por la solución pipeteando arriba y abajo con una punta de pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no sobre-Tripsinizar las células.
Neutralizar la reacción con un volumen igual de medio de cultivo y eliminar grupos de células haciendo pasar la suspensión a través de un colador de 40-70 micras celular. Sedimentar las células, se lavan con PBS, enumerar y resuspender el número deseado de células en tampón FACS. Teñir las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Los resultados representativos
Este enfoque puede ser utilizado para una amplia gama de aplicaciones, y para el estudio de la biología de ovario normal, así como el estudio de la iniciación del cáncer de ovario. Una ventaja importante de este enfoque sobre cultivos 3D creados usando gel de matriz extracelular disponible comercialmente es que los fibroblastos normales del ovario producir la matriz extracelular que hace uP El núcleo de los esferoides. En nuestra experiencia, el material de la matriz producida por los fibroblastos normales del ovario es heterogénea y se asemeja más a la matriz extracelular del ovario que cualquier matriz de gel comercialmente disponible. En nuestro laboratorio se han utilizado las células epiteliales que han sido parcialmente transformadas in vitro utilizando definidos elementos genéticos (por ejemplo, la sobreexpresión cmyc) y co-cultivos de células de estos con fibroblastos normales del ovario y senescentes para imitar primeras etapas del cáncer de ovario en un ovario después de la menopausia. Nuestros datos sugieren que el microambiente envejecimiento promueve características neoplásicas (por ejemplo, proliferación) de células epiteliales transformadas parcialmente (Figura 3), mientras que un microambiente normal inhibe la progresión neoplásica 8. Nuestro laboratorio y otros también han utilizado métodos similares para modelar las células epiteliales de ovario normales 9, células epiteliales de las trompas de Falopio, los modelos por etapas de la progresión neoplásica
Figura 1. Presentación esquemática del protocolo para el cultivo de heterotípicos 3D. Matraces de cultivo de tejidos es dos veces revestidos con una solución poliHEMA 1% y se dejó secar. Plásticos poliHEMA recubiertas se lavan con PBS 1X inmediatamente antes de su uso. Las células normales inmortalizadas de fibroblastos de ovario (4x10 6 células) se siembran en el matraz con 20 ml de medio de crecimiento. Formación de esferoides y el crecimiento controlado durante 7 días. En este punto, los cultivos de fibroblastos esferoides se inocularon con 1x10 6 células epiteliales, y los dos tipos de células se co-cultivaron durante 14 días antes de los esferoides multicelulares se cosechan y se procesan para aplicaciones posteriores (análisis moleculares, imágenes, etc.)
Figura 2. La tinción de inmunofluorescencia de hTERT </ Em> inmortalizado fibroblastos normales de ovario. Tanto los fibroblastos primarios normales ováricos (Pr NOF) e inmortalizado fibroblastos normales de ovario (INOFs) expresa la proteína específica de fibroblastos (FSP), no expresan citoqueratina-7 (Ck-7) y expresan vimentina (VIM) . Los marcadores de interés se muestran en verde, el ADN se tiñeron con DAPI y se muestran en azul, el citoplasma se counterstained con azul de Evans y se muestra en rojo.
Figura 3. Inmunohistoquímica de co-cultivos de células estromales y epiteliales. Panel izquierdo, fibroblastos normales de ovario monocultivo esferoide, se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las células normales de fibroblastos de ovario cultivadas solas en forma 3D esferoides que constan de células con una morfología spindled-y abundante matriz extracelular. Panel derecho: los fibroblastos normales de ovario fueron expuestas a peróxido de hidrógeno para inducir la senescencia. Parcialmente transformadas (células epiteliales de ovario Iosé
Figura 4. Las características histológicas de las células cultivadas 3D reflejar tejidos primarios. (A) Eliminar los carcinomas de células de ovario mostrar característicos estructuras de células claras, éstas están ausentes cuando claras líneas celulares de EOC se cultivan en las estructuras de plástico pero similar se detecta cuando las mismas células se hacen crecer como esferoides 3D ( B). (C) Micrografía electrónica de barrido de las células epiteliales ováricas normales cultivadas como esferoides para 14 días. Microvellosidades superficiales son visibles (flechas). (D) de cáncer de ovario seroso esferoides de líneas celulares en cultivo. (A, B) tinción de hematoxilina y eosina de parafina se seccionaron embebido en el tejido tumoral o esferoides 3D; (C) microscopía electrónica de barrido; (D) La microscopia de contraste de fase. Esferoides pueden ser esféricas (círculo de trazos)o de forma irregular, como en el caso de la estructura vista en la parte izquierda de la imagen.
| Dish / Tamaño Plate | Volumen de poliHEMA (que debe aplicarse dos veces) | Cultura Medios volumen final |
| 6-así placa | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-así placa | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-así placa | 500 l | 1,5 ml |
| 48-y placas | 250 l | 500 l |
| Placa de 96 pocillos | 50 l | 200 l |
| P100 cultura plato | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 cultura plato | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 frasco | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 frasco | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 frasco | 15 ml | 30-50 ml |
Tabla 2. Recomendaciones volúmenes para revestimiento poliHEMA y el cultivo 3D.
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Discussion
La biología de las primeras etapas del cáncer de ovario epitelial (EOC) es poco conocido. Quizás uno de los impedimentos principales en este campo durante muchos años ha sido la falta de comprensión de los orígenes de tejidos específicos de la enfermedad, y de la importancia del papel del microentorno en el desarrollo de EOC. Durante los últimos años, se ha hecho evidente que EOC es una enfermedad heterogénea con múltiples subtipos distintos histophathological, probablemente con diferentes orígenes celulares para diferentes subtipos. Por ejemplo, los datos actuales sugieren que el alto grado EOC serosas pueden proceder tanto de células epiteliales secretoras las trompas de Falopio y las células de ovario epiteliales superficiales; al menos una proporción de los EOC endometrioides y de células claras se cree que surgen de la endometriosis ovárica (endometrioma); y EOC mucinosos pueden surgir de paraovárico o paratubal transición epitelio de tipo 15,16. Sin embargo, no se han limitado únicamente in vitro y <em> en modelos in vivo de progresión de la enfermedad para cualquiera de estos histotypes. En el modelado in vitro heterotípicos de EOC para estudiar los tumores de estroma epitelial interacciones y el microambiente asociado con carcinomas de ovario en desarrollo es un área aún menos desarrollada de investigación. El estroma tumoral es probable que sea una fuente de biomarcadores tumorales, así como una nueva diana para la terapia. El desarrollo y uso de modelos heterotípicas de EOC por lo tanto puede ser clave para la identificación de nuevos biomarcadores asociados con la enfermedad en estadio temprano que podría ser utilizado como parte de un programa de cribado y la detección precoz de la enfermedad, o para la identificación de nuevos, druggable dianas terapéuticas para mejorar regímenes de tratamiento para los pacientes con EOC.
Más importante aún, los modelos que hemos descrito puede ser utilizado para obtener una comprensión más profunda de los cambios subyacentes fenotípicas y moleculares que ocurren durante el inicio del COE y el desarrollo temprano de la enfermedad. Es Ahora está claro que los diferentes subtipos de EOC tienen diferentes perfiles moleculares, las características clínicas y la biología subyacente. Mediante la generación de una biblioteca de células precursoras de EOC y modelar el desarrollo de cada subtipo de cáncer, incluyendo las influencias microambientales, puede ser posible obtener nuevos conocimientos sobre el desarrollo de histotipos COE a través de modelos que reflejan con precisión el desarrollo de la enfermedad en la condición humana. Las metodologías se describen pueden aplicarse a una amplia gama de estudios y aplicaciones, incluyendo el estudio de otros tumores sólidos. Hemos probado la capacidad de formación de esferoides en más de cincuenta diferentes líneas celulares normales y transformadas ovario hasta la fecha, y se observa que la gran mayoría de las líneas celulares son capaces de formar esferoides cuando sembraron en placas a altas densidades de células en placas recubiertas con poliHEMA. Por lo tanto, anticipar que los modelos de cultivo de células de otros órganos de mamíferos y también otras especies también pueden ser cultivadas en 3D utilizando este enfoque.
ve_content "> Estos enfoques pueden representar un avance específicamente para estudiar el papel del microambiente durante la iniciación del tumor, por ejemplo en los estudios de las interacciones de las discretas aberraciones genéticas somáticas en células epiteliales tumorales existentes al mismo tiempo que las variables específicas de microambientales. Hemos demostrado que los cambios fenotípicos en células estromales pueden afectar el fenotipo celular epitelial 8. Mediante la alteración de los tipos de células incluidos en el modelo, se puede investigar si diferentes células estromales diferencialmente influir en la proliferación de células epiteliales y también la expresión de otros marcadores específicos por ejemplo, marcadores asociados con la invasión o metástasis. Además, estos modelos también puede ser utilizado en el estudio de la enfermedad benigna y la fisiología ovárica normal. Por ejemplo, tales modelos 3D podría ser utilizado en los estudios de fertilidad para evaluar el papel de la estroma ovárico durante la maduración de ovocitos.Para el estudio de la contribución de la millascroenvironment al desarrollo EOC y el papel de los asociados con el cáncer de ovario fibroblastos en los EOC malignas, estos modelos también puede ser adaptada por las células de co-cultivo de cáncer de ovario con fibroblastos aislados de especímenes tumorales. Culturas más complejas también podrían ser generados por la introducción de tipos de células adicionales, relevantes en la estructura heterotípica. Por ejemplo, el modelo de las interacciones de células estromales y epiteliales que hemos desarrollado por podría complementarse con la introducción de células de la granulosa, células inmunes o endotelial. Otra posibilidad sería la de otros tipos de co-cultivo de células precursoras en el modelo de estroma ovárico, tales como las células epiteliales de la trompa de Falopio y el endometrio. También es posible modelar interacciones adicionales paracrinos que se proponen para ser importante en la iniciación EOC. Por ejemplo, las hormonas esteroides podrían ser introducidos en el modelo heterotípica, o la expresión de genes que actúan paracrinos podría ser perturbado exclusivamente en el compartimiento del estroma yel efecto sobre las células epiteliales medido.
La mayoría de los cánceres de ovario se identifican en una etapa tardía, después de la enfermedad se ha difundido ampliamente en todo el peritoneo. Cánceres de ovario diagnosticados cuando está localizado en los ovarios (Etapa 1) se pueden tratar eficazmente con la cirugía y en más del 90% de los casos los pacientes se curan de su enfermedad. Es claro que las estrategias para la detección temprana de los cánceres de ovario podría reducir significativamente la morbilidad y mortalidad por cáncer de ovario. Al obtener una comprensión más profunda del desarrollo de la enfermedad en etapa temprana el uso de enfoques de modelado organotípicos como las descritas aquí, se prevé que las nuevas oportunidades para la detección de la enfermedad en las poblaciones en riesgo se dará a conocer y en última instancia a la práctica clínica.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación se realizó en la Escuela Keck de Medicina de la Universidad de California, EE.UU., y la Universidad College de Londres, Reino Unido. KL es financiado por el Instituto Nacional de Salud de subvención U19 5 CA148112-02. BG fue financiado por una subvención para el proyecto de la caridad Apelaciones Eva oncología ginecológica (Reino Unido). Parte de este trabajo realizado en UCLH / UCL fue en parte la financiación del Departamento de Salud NIHR esquema de financiación, el Centro de Investigación Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
