Summary
Nous décrivons les méthodes pour établir
Abstract
Cancers épithéliaux de l'ovaire (COU) sont la principale cause de décès par cancer gynécologique dans les sociétés occidentales. Malgré les progrès dans les traitements chirurgicaux et l'amélioration des chimiothérapies à base de platine, il ya eu peu d'amélioration dans les taux de survie des COE pendant plus de quatre décennies 1,2. Bien que les tumeurs de stade I ont des taux de survie à 5 ans> 85%, les taux de survie pour le stade III / IV maladies sont <40%. Ainsi, les taux élevés de mortalité pour COE pourrait être considérablement diminué si les tumeurs ont été détectées au plus tôt, plus traitables les étapes 3-5. À l'heure actuelle, la base génétique moléculaire et biologique de stade de développement précoce de la maladie est mal comprise. Plus précisément, on sait peu au sujet du rôle du microenvironnement tumoral lors de l'initiation, mais les facteurs de risque connus pour la COU (par exemple l'âge et la parité) suggèrent que le microenvironnement joue un rôle clé dans la genèse précoce de la COU. Nous avons donc développé des modèles tridimensionnels hétérotypiquesà la fois de l'ovaire normal et du début des cancers de l'ovaire stade. Pour l'ovaire normal, nous co-cultivées surface épithéliale ovarienne normale (IOSE) et des fibroblastes du stroma normale (INOF) cellules, immortalisé par transduction retrovrial de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine holoenzyme (hTERT) pour prolonger la durée de vie de ces cellules en culture. Pour modéliser les premières étapes de la transformation cellulaire épithélial de l'ovaire, la surexpression de l'oncogène dans les cellules CMYC IOSE, nouveau co-cultivées avec des cellules INOF. Ces modèles hétérotypiques ont servi à étudier les effets du vieillissement et de la sénescence sur la transformation et l'invasion des cellules épithéliales. Ici, nous décrivons les étapes méthodologiques dans le développement de ces modèles en trois dimensions; ces méthodologies ne sont pas spécifiques au développement de l'ovaire normal et les tissus du cancer de l'ovaire, et pourrait être utilisée pour étudier les autres types de tissus où les interactions cellules stromales et épithéliales sont un élément fondamental aspect de l'entretien des tissus et didéveloppement malad.
Protocol
La figure 1 illustre une vue d'ensemble du flux de production décrit ci-dessous.
1. Isolation des fibroblastes ovarienne normale et d'extension de durée de vie in vitro par surexpression de la sous-unité catalytique de l'holoenzyme hTERT
- Tissus ovariens peuvent être recueillies avec le consentement éclairé du patient et l'approbation de l'Institutional Review Board (pour les institutions des États-Unis). Tissus ovariens normaux peuvent être collectées après hystérectomie abdominale totale ou totale hystérectomie laparoscopique avec salpingo-ovariectomie bilatérale. Dans cette étude, les tissus ont été examinés par un pathologiste et une partie du stroma ovarien biopsie pour la culture cellulaire. Des échantillons de tissus d'environ 2-5 mm 2 ont été récoltés dans la région centrale de l'ovaire pour tenter de réduire le risque d'échantillonnage épithélium ovarien aussi.
- Transports tissu ovarien frais au laboratoire de culture cellulaire dans les fibroblastes immortalisés ovaire normal (IND') milieu de culture, additionné d'antibiotiques supplémentaires et antimycosiques. Milieu de croissance INOF (INOF-GM) comprend: Medium 199 et MCDB105 mélangés dans un rapport de 1:1, supplémenté avec 15% de sérum de veau foetal, 2 mM de L-glutamine, 50 ug / ml de gentamicine et 250 ng / ml d'amphotéricine B.
- Travailler à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique: supprimer les cellules épithéliales qui restent faiblement fixées sur le tissu, par lavage de l'échantillon avec 5 ml de PBS. Aspirer et répéter deux fois plus.
- Transférer l'échantillon ainsi PBS dans un endroit propre 10 cm de diamètre (P100) boîte de culture. Utilisez une pince stérile pour manipuler le tissu et le placer dans un deuxième plat sec P100 culture propre. Utilisez scalpel stérile pour couper des tissus 0,5 cm 2 pièces. Placer chaque morceau de tissu dans un plat séparé P100 et autre coupe en morceaux <1 mm 2 dans la taille. Ajouter 20 ml INOF-GM (plus d'antibiotiques et antifongiques), et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Surveiller la croissance des cellules par microscopie de phase. Les cellules peuvent être vus en respectant l'esprit plat hin 24 h.
- Ré-alimentation après une semaine, à enlever de tissu non adhérent par aspiration. Par la suite, réinsérer les cultures deux fois par semaine. Les cellules formeront des colonies, généralement dans les 1-3 semaines. Une fois que ces colonies sont assez grands pour sous-culture (une fois qu'ils atteignent environ 500 um), isoler les clones en utilisant le clonage de disques trypsine-enduits.
Confirmer les cellules sont des fibroblastes et 100% exempte d'autres contaminants cellulaires par placage d'un échantillon de la lignée de cellules sur des lamelles de verre et d'interprétation de coloration immuno-fluorescence d'un marqueur fibroblastique (FSP), un marqueur épithélial (pan-cytokératine) et un marqueur de cellule endothéliale (von Willenbrand facteur VIII). - Passage primaire fibroblastes normaux de l'ovaire (NOF) isole la cellule à partir d'un seul plat P100 P100 en 3 plats un jour avant la transduction rétrovirale de hTERT. Pré-rendu surnageants viraux peuvent être achetés ou fabriqués en interne en utilisant des protocoles standard pour les cellules de co-transfection HEK293T (voirtarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Surnageants rétroviraux peuvent être produites en utilisant le vecteur pBABE-hygro-hTERT (Addgene). Retirer NOFS de l'incubateur, puis aspirer le milieu de culture cellulaire. Ajouter 3 ml de surnageant viral à chaque plat: un plat reçoit hTERT-rétrovirus, le plat 2 ème reçoit GFP-rétrovirus et le troisième plat ne reçoit pas de virus. Superposez surnageants viraux avec INOF-GM contenant polybrène pour donner une concentration finale de 8 pg / ml. Re-alimentation des cellules le jour suivant avec un milieu frais. Deux jours après l'infection, commencer la sélection à faible dose (10 U / ml) hygromycine B. Au bout de sept jours, cette dose peut être augmentée à 20 U / ml, la sélection devrait être terminé dans les 10-14 jours. - Les clones exprimant hTERT ou GFP peut être isolé par clonage anneau une fois qu'ils atteignent environ 500 um. Les lignées cellulaires nécessitent une caractérisation supplémentaire pour confirmer l'expression réussie de hTERT et la rétention des principales caractéristiques de lignées cellulaires. Il s'agit de: (a)confirmer l'activité télomérase par PCR-ELISA et la longueur des télomères, par Southern blot ou PCR 6,7; (b) confirmant l'expression des marqueurs essentiels (par exemple immunomarquage avec un anticorps anti-pan-cytokératine pour identifier les cellules épithéliales, et avec un anti- anticorps de protéines de surface des fibroblastes pour les fibroblastes) sont similaires entre les cellules primaires et hTERT-immortalisé; (c) confirmant les cellules ne présentent des propriétés de transformation néoplasique (par exemple en utilisant des tests d'ancrage de croissance indépendants), (d) l'extension de confirmation de la durée de vie in vitro observée dans . cellules exprimant la GFP hTERT mais pas hTERT-immortalisées exprimant des fibroblastes normaux de l'ovaire (INOFs) doit contourner la sénescence réplicative mais pas être transformé néoplasique; outre les cellules INOF devrait maintenir l'expression de la protéine de surface des fibroblastes mais pas les marqueurs épithéliaux comme cytokératine (figure 2) .
2. Revêtement de tissus CulturPlats e avec polyHEMA pour culture de cellules non-adhérentes
- Pour préparer la solution polyHEMA, pèsent pour 1,5 polyHEMA g, et le placer dans un flacon stérile. Ajouter 95 ml de biologie moléculaire de l'éthanol absolu et 5 ml d'eau pour culture cellulaire distillée. L'hydrogel polyHEMA se dissout dans l'eau contenue dans la solution, et l'éthanol permet de stériliser la préparation.
- Placer la solution dans un bain-marie polyHEMA à 65 ° C jusqu'à dissolution complète. Cela peut prendre jusqu'à 8 heures. Notez que la solution polyHEMA ne peut être stocké pendant de longues périodes de temps et donc il faut toujours être préparé.
DÉPANNAGE: Solutions de polyHEMA nécessitent de longues périodes d'incubation à 65 ° C. Régulièrement inverser la solution polyHEMA pour mélanger. Viscosité observé sur le fond de la bouteille en verre indique la polyHEMA n'est pas entièrement dissous et une nouvelle incubation à 65 ° C est nécessaire. - Intervention à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire, des plats manteau de culture de tissu avec la solution polyHEMA. Toute size de boîte de culture tissulaire, un flacon ou d'une plaque multi-puits peut être revêtue d'polyHEMA. Volumes recommandés de solution polyHEMA requis pour chaque bateau sont indiqués dans le tableau 2.
- Laissez boîtes de culture cellulaire pour sécher l'intérieur de la hotte à flux laminaire. Cela peut prendre 2-3 jours. Doux balancement sur une plate-forme à bascule peut être utilisé pour produire un revêtement uniforme des plats de plus grande taille ou des flacons. Si le produit ne sèche trop vite solution polyHEMA la surface ne soit pas parfaite. Pour éviter cela, vérifiez que le couvercle de la boîte / flacon reste au long du processus de séchage.
- Appliquer une deuxième couche de polyHEMA et laisser sécher comme décrit ci-dessus.
DÉPANNAGE: Des trous dans le revêtement polyHEMA peut se produire, en particulier lorsque les plaques sécher trop rapidement. Deux plaques de revêtement avec polyHEMA permet de combler les lacunes ou de fissures dans le revêtement sont recouvertes avant l'utilisation. Plaques prennent habituellement 2-3 jours pour chaque couche polyHEMA à sécher et doit donc être préparé au moins une semaine avant leur seront nécessaires pour la culture cellulaire. - PolyHEMA plaques revêtues peut être conservé à température ambiante jusqu'à utilisation.
REMARQUE: 1% d'agarose solutions, dissous dans du PBS 1X et autoclave pour stériliser, peut également être utilisé pour des plats manteau de culture de cellules pour créer une surface non-adhérente à court terme de culture en 3D (moins d'une semaine). Revêtement d'agarose des plaques multi-puits crée une surface concave qui favorise la formation d'un sphéroïde unique par puits pendant de nombreuses lignées cellulaires. Toutefois, pour des cultures plus polyHEMA 3D revêtement est recommandé que l'agarose revêtement se désagrège souvent après des périodes de culture plus longues.
3. Génération en trois dimensions (3D) Sphéroïdes hétérotypique et Re-alimentation des cultures en 3D
- Récupérer et développer les cultures de cellules épithéliales INOF et in vitro afin de préparer suffisamment de cellules pour établir 3D sphéroïdes hétérotopiques. Pour les «cultures de masse» nous avons généralement des semences 2-4x10 6 INOFs par P100 plat et 0,5-1x10 6 cellules épithéliales de donner un stroma: épithéliale ratio de 4:1. INOF cellules sont cultivées dans un milieu de croissance INOF (INOF-GM) sans gentamicine ou l'amphotéricine B. Si on le souhaite, des fibroblastes peuvent être prétraitées avant la culture 3D (par exemple pour l'induction de la sénescence, les cellules peuvent être traitées avec des doses sublétales de peroxyde d'hydrogène ).
- Laver une plaque polyHEMA sec avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) pendant 5 min. Aspirer le PBS et le remplacer par 15 ml INOF-GM.
- Pendant ce temps, Trypsiniser immortalisé normales des cellules de fibroblastes de l'ovaire à les détacher de la boîte de culture, après 3-5 min neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu de culture et sédimenter les cellules par centrifugation à 450 xg pendant 5 min.
- Jeter le surnageant. Créer une suspension à cellule unique en remettant en suspension le culot cellulaire dans 5 ml INOF-GM, bien mélanger par pipetage de haut en bas ou de vortex doucement. Déterminer la concentration cellulaire en mélangeant 10 ul de suspension cellulaire et 10 pl bleu trypan et l'énumération à l'aide d'un hémocytomètre. Exclusion du bleu trypan peut être utiliserd pour identifier des cellules vivantes.
- Ajouter 4x10 cellules INOF 6 à la moyenne déjà distribué dans la plaque polyHEMA-enduit. Compléter le volume de milieux de culture à 20 ml avec un volume approprié de frais INOF-GM et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Les cellules commencent à s'agréger en sphéroïdes multicellulaires dans les 24 heures. Formation sphéroïde peut être contrôlée par microscopie de phase.
Comptage précis du nombre de sphéroïdes dans des conditions de culture de masse est difficile, mais nous estimons que nous obtenons 50-100 sphéroïdes lorsque 4x10 6 cellules stromales sont plaqués. Sphéroïde tailles varient généralement de 80 à 250 um. - Ré-alimenter les cultures sphéroïdes tous les 2-3 jours de repos par des plaques en formant un angle sur une pipette placée à l'intérieur de la hotte à flux laminaire. Laissez les sphéroïdes à régler. Cela peut prendre jusqu'à 20 minutes. Retirez délicatement les médias épuisés avec une pipette de 5 ml, jusqu'à ce qu'il ne reste environ 4 ml dans le plat. Prenez soin de ne pas aspirer les sphéroïdes. Re-alimentation avec 16 ml INO fraisF-GM et revenir à l'incubateur.
- Au jour 7, ajouter les cellules épithéliales des sphéroïdes fibroblastes de créer des cultures hétérotypiques comme suit. Préparer des suspensions de cellules épithéliales de l'ovaire (phénotype normal ou transformé) par traitement à la trypsine comme décrit dans la section 3.4 au 3.5. Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Laver une fois dans INOF-GM pour éviter tout facteur de croissance d'être reporté des milieux de croissance épithéliaux.
Dans notre laboratoire, la surface ovarienne normale des cellules épithéliales (OSEC) lignes ont été recueillis avec consentement éclairé du patient à partir d'ovaires enlevés par l'hystérectomie abdominale totale ou une hystérectomie totale laparoscopique avec salpingo-ovariectomie bilatérale. Les ovaires ont été brossés avec une cytobrosse stérile pour recueillir l'épithélium. Lignées de cellules primaires ont été créées et transduites avec hTERT en utilisant l'approche décrite ci-dessus. Détails de la culture OSEC en 2D, 3D et l'immortalisation OSEC peuvent être trouvés dans les références 10 et 11. - Pour former sph hétérotypiqueeroids, d'abord ré-alimentation des cultures de fibroblastes de sphéroïdes seuls. Puis ensemencer des cultures de fibroblastes sphéroïdes avec 1x10 6 cellules épithéliales à un rapport de 4:1 fibroblastes de cellules épithéliales. Culture des sphéroïdes hétérotypiques dans INOF-GM.
- Re nourrir de cultures hétérotypiques tous les 2-3 jours pour 14 jours supplémentaires.
4. Traitement pour l'imagerie et des analyses moléculaires
- De nombreuses techniques différentes peuvent être utilisées pour analyser les sphéroïdes hétérotopiques. Pour l'imagerie, il est recommandé que les sphéroïdes sont récoltées à partir de la boîte de culture avec une pipette de 25 ml. Pipetage lentement va minimiser les risques de forces de cisaillement qui perturbent l'architecture du sphéroïde. Sphéroïdes peuvent ensuite être lavées en PBS et culottées par centrifugation douce à 100 xg pendant 10 min, les forces centrifuges plus élevé peut endommager les sphéroïdes. Alternativement, les cultures peuvent être transférés dans un tube Falcon de 50 ml et laissé décanter, et le milieu de croissance alors retiré.
- Pour immunohistochimiechimie, fixer sphéroïdes avec du formol tamponné neutre pendant 30 min à température ambiante. Granulés sphéroïdes et de remplacer le formol avec de l'éthanol à 70%. Processus dans de la paraffine en utilisant des protocoles standard utilisés pour les tissus humains. Sphéroïdes inclus en paraffine peut être divisé, et colorées avec l'hématoxyline et à l'éosine soit ou en utilisant des marqueurs moléculaires spécifiques immunohistochimie standard (Figure 3).
- Alternativement, sphéroïdes lavés dans du PBS peuvent être fixés dans du paraformaldéhyde 4% (préparée dans du PBS), intégré dans la température de coupe optimale PTOM et moyennes pression gelés pour la coupe congelée et immunofluorescence.
- Pour les analyses moléculaires, les sphéroïdes peuvent être récoltés, granulés et lavées deux fois dans du PBS avant la lyse des cellules de l'ADN, de l'ARN ou de l'extraction des protéines.
- Pour l'analyse par cytométrie en flux, sphéroïdes peuvent être lavées en PBS et dissocié par la trypsine ou la digestion Accutase à 37 ° C. Pour ce faire, plonger le tube Falcon contenant des sphéroïdes ina bain-marie pour faciliter la trypsine. Dissociation complète des sphéroïdes dans une suspension cellulaire unique peut être favorisée par la solution de pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette 1 ml. Prenez soin de ne pas trop trypsiniser les cellules.
Neutraliser la réaction avec un volume égal de milieu de culture et de supprimer amas de cellules faisant passer la suspension à travers une passoire 40-70 um cellule. Sédimenter les cellules, laver avec du PBS, énumérer et remettre en suspension le nombre désiré de cellules dans un tampon FACS. Colorer les cellules selon les instructions du fabricant.
5. Les résultats représentatifs
Cette approche peut être utilisée pour une large gamme d'applications, et pour l'étude de la biologie ovarienne normale ainsi que l'étude de l'initiation du cancer de l'ovaire. Un avantage majeur de cette approche sur des cultures 3D créés à l'aide de gel disponible dans le commerce matrice extracellulaire est que les fibroblastes ovariennes normales de produire la matrice extracellulaire qui rend uP le noyau des sphéroïdes. Dans notre expérience, le matériau de la matrice produite par les fibroblastes normaux de l'ovaire est hétérogène et se rapproche davantage de la matrice extracellulaire de l'ovaire que toute matrice de gel disponible dans le commerce. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé des cellules épithéliales qui ont été partiellement transformées in vitro en utilisant les éléments définis génétiques (par exemple la surexpression CMYC) et co-cultivées avec des fibroblastes ces cellules ovariennes normales et sénescents pour imiter cancer de l'ovaire à un stade précoce dans un ovaire post-ménopausique. Nos données suggèrent que le micro-environnement favorise le vieillissement des caractéristiques néoplasiques (p. ex prolifération) des cellules épithéliales transformées partiellement (figure 3), alors que le microenvironnement normale inhibe la progression néoplasique 8. Notre laboratoire et d'autres ont également utilisé des approches similaires pour modéliser les cellules épithéliales ovariennes normales 9, les cellules épithéliales des trompes de Fallope, étape-sages modèles de la progression néoplasique
Figure 1. Vue d'ensemble schématique du protocole de culture hétérotypique 3D. Flacons de culture cellulaire sont deux fois enduite d'une solution polyHEMA 1% et on laisse sécher. Plastique polyHEMA revêtues sont lavées avec du PBS 1x immédiatement avant l'utilisation. Immortalisées normales des cellules de fibroblastes de l'ovaire (4x10 6 cellules) sont plaquées dans le ballon avec 20 ml milieu de croissance. Formation sphéroïde et la croissance contrôlée pendant 7 jours. À ce stade, les cultures de fibroblastes sphéroïdes sont inoculés avec 1x10 6 cellules épithéliales, et les deux types de cellules sont co-cultivées pendant 14 jours avant que les sphéroïdes multicellulaires sont récoltées et traitées pour des applications en aval (analyses moléculaires, imagerie, etc.)
Figure 2. Immunofluorescence de hTERT </ Em> immortalisé fibroblastes ovariennes normales. Les fibroblastes primaires ovariennes normales (Pr NOFS) et immortalisé fibroblastes ovariennes normales (INOFs) protéines expresse des fibroblastes spécifique (PSA), n'expriment pas la cytokératine-7 (Ck-7) et expresse vimentine (VIM) . Marqueurs d'intérêt sont indiquées en vert, l'ADN est coloré avec du DAPI et en bleu, le cytoplasme est contre-colorées avec bleu Evans et représentée en rouge.
Figure 3. Immunohistochimie des co-cultures de cellules stromales et épithéliales. Panneau de gauche, normal monoculture sphéroïde ovaire fibroblastes, colorées par l'hématoxyline et l'éosine. Normaux en culture des cellules de fibroblastes de l'ovaire seul dans sphéroïdes forme 3D comprenant des cellules avec une morphologie monobroche et abondante matrice extracellulaire. Panneau de droite: fibroblastes ovariennes normales ont été exposés à du peroxyde d'hydrogène pour induire la sénescence. Cellules ovariennes épithéliales transformées partiellement (IOSE
Figure 4. Caractéristiques histologiques de cellules en culture 3D reflètent tissus primaires. (A) Effacer carcinomes ovariens cellule d'affichage caractéristiques des structures à cellules claires, elles sont absentes lorsque les lignes claires du COU cellules sont cultivées sur des structures en plastique mais similaire sont détectés lorsque les mêmes cellules sont cultivées comme des sphéroïdes 3D ( B). (C) Micrographie électronique à balayage des cellules épithéliales ovariennes normales cultivées sous forme de sphéroïdes pendant 14 jours. Microvillosités de surface sont visibles (flèches). (D) séreux de l'ovaire sphéroïdes de cellules de cancer de ligne, dans la culture. (A, B) coloration à l'hématoxyline et l'éosine de paraffine incorporée en coupe du tissu tumoral ou sphéroïdes 3D; (C) microscopie électronique à balayage, (D) la microscopie à contraste de phase. Sphéroïdes peuvent être sphériques (cercle en pointillés)ou de forme irrégulière, comme dans le cas de la structure vu dans la partie gauche de l'image.
| Vaisselle / Dimension de la plaque | Volume de polyHEMA (à appliquer deux fois) | Culture Médias Volume final |
| Plaque à 6 puits | 3 ml | 5-7 ml |
| Plaque de 12 puits | 1,5 ml | 2 ml |
| Plaque de 24 puits | 500 pi | 1,5 ml |
| Plaque de 48 puits | 250 pi | 500 pi |
| Plaque de 96 puits | 50 pi | 200 pi |
| P100 boîte de culture | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 boîte de culture | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 flacon | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 flacon | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 flacon | 15 ml | 30-50 ml |
Tableau 2. Recommandée volumes pour le revêtement et la culture polyHEMA 3D.
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Discussion
La biologie du stade précoce de cancer ovarien épithélial (COE) est mal comprise. Peut-être l'un des principaux obstacles dans ce domaine depuis de nombreuses années a été le manque de compréhension des origines tissulaires spécifiques de la maladie, et de l'importance du rôle du microenvironnement dans le développement des COE. Au cours des dernières années, est devenu clair que des COE est une maladie hétérogène avec de multiples sous-types distincts histophathological, probablement avec différentes origines cellulaires de différents sous-types. Par exemple, les données actuelles suggèrent que de haute qualité COU séreuses peuvent provenir de deux trompes cellules sécrétrices du tube épithéliales et les cellules épithéliales de l'ovaire de surface, au moins une partie des cellules COU endométrioïdes et clair sont considérées comme provenant de l'endométriose ovarienne (endométriome), et COU mucineuses peuvent découler de paraovarian ou paratubal transition de type épithélium 15,16. Cependant, il n'a été que limitée in vitro et <em> dans les modèles in vivo de la progression de la maladie pour l'une de ces histotypes. In vitro modélisation hétérotypique du COE pour étudier les tumeurs du stroma-épithéliales interactions et le micro-environnement associé aux carcinomes ovariens en développement est un domaine encore peu développé de la recherche. Le stroma tumoral est susceptible d'être à la fois une source de biomarqueurs tumoraux ainsi que d'une nouvelle cible pour la thérapie. Le développement et l'utilisation de modèles de hétérotypiques COE peut donc être essentiel pour identifier de nouveaux biomarqueurs associés à la maladie à un stade précoce qui pourrait être utilisé dans le cadre d'un programme de dépistage et la détection précoce de la maladie, ou pour l'identification de nouvelles, druggable cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements pour les patients diagnostiqués avec des COE.
Plus fondamentalement, les modèles que nous avons décrits peuvent être utilisés pour acquérir une meilleure compréhension des changements phénotypiques et moléculaires sous-jacents qui se produisent lors de l'initiation du COU et le développement précoce de la maladie. Il est maintenant clair que les différents sous-types du COU ont profils moléculaires distincts, les caractéristiques cliniques et de la biologie sous-jacente. En générant une bibliothèque de cellules précurseurs du COU et la modélisation du développement de chaque sous-type de cancer, y compris les influences du micro-environnement, il peut être possible d'obtenir des informations nouvelles sur le développement de histotypes EOC grâce à des modèles qui reflètent fidèlement développement de la maladie dans la condition humaine. Les méthodes que nous décrivons peut être appliquée à un large éventail d'études et d'applications, y compris l'étude d'autres tumeurs solides. Nous avons testé la capacité de formation sphéroïde dans plus de cinquante différents normal et transformé lignées de cellules ovariennes à ce jour, et a observé que la grande majorité des lignées cellulaires sont capables de former des sphéroïdes quand étalées à de fortes densités cellulaires sur polyHEMA plaques revêtues. Nous prévoyons donc que les modèles de culture cellulaire de mammifères et d'autres organes aussi d'autres espèces pourraient aussi être cultivées en 3D en utilisant cette approche.
ve_content "> Ces approches peuvent représenter un progrès spécifiquement pour étudier le rôle du microenvironnement tumoral lors de l'initiation, par exemple dans les études sur les interactions des aberrations somatiques discrets génétiques dans les cellules épithéliales tumorales existantes en même temps que les variables spécifiques du microenvironnement. Nous avons montré que les changements phénotypiques dans les cellules stromales peuvent influer sur le phénotype des cellules épithéliales 8. En modifiant les types de cellules incluses dans le modèle, on pourrait examiner si les différentes cellules stromales différemment influencer la prolifération des cellules épithéliales et aussi l'expression d'autres marqueurs spécifiques des marqueurs associés à l'invasion par exemple ou des métastases. Par ailleurs, ces modèles peuvent également être utilisés dans l'étude des maladies bénignes et de la physiologie ovarienne normale. Par exemple, de tels modèles 3D peuvent être utilisées dans les études de fertilité pour évaluer le rôle du stroma de l'ovaire au cours de la maturation des ovocytes.Pour étudier la contribution de la microenvironment au développement des COE et le rôle de l'ovaire associées au cancer fibroblastes dans COU malignes, ces modèles peuvent être adaptés par co-culture de cellules ovariennes cancéreuses avec des fibroblastes isolés à partir d'échantillons tumoraux. Des cultures plus complexes peuvent également être générés par l'introduction d'autres types de cellules pertinentes dans la structure hétérotypique. Par exemple, le modèle des interactions cellulaires stromales et épithéliales nous avons développés pourraient par complétées par la mise en place de cellules de la granulosa, des cellules immunitaires ou endothéliales. Une autre possibilité serait de co-culture d'autres types de cellules précurseurs dans le modèle stroma ovarien, comme les cellules épithéliales de la trompe de Fallope et de l'endomètre. Il est également possible de modéliser supplémentaires interactions paracrines qui sont proposés à jouer un rôle important lors de l'initiation du COU. Par exemple, les hormones stéroïdes pourrait être introduite dans le modèle hétérotypique, ou l'expression de gènes agissant paracrines pourrait être perturbé exclusivement dans le compartiment stromal etL'effet sur les cellules épithéliales mesurée.
La majorité des cancers de l'ovaire sont identifiés à un stade tardif, après que la maladie a largement diffusé à travers le péritoine. Cancers de l'ovaire diagnostiqués lorsque localisée dans les ovaires (étape 1) peut être traitée efficacement par la chirurgie et dans plus de 90% des cas, les patients sont guéris de leur maladie. Il est clair que les stratégies de détection précoce des cancers de l'ovaire pourrait réduire considérablement la morbidité et la mortalité du cancer de l'ovaire. En acquérant une compréhension plus profonde de développement de la maladie à un stade précoce en utilisant des approches de modélisation organotypiques telles que celles décrites ici, il est prévu que de nouvelles opportunités pour la détection de la maladie dans les populations à risque seront dévoilés et, finalement, dans la pratique clinique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été effectuée à la Keck School of Medicine, University of California, Etats-Unis, et l'University College London, Royaume-Uni. KL est financé par l'Institut national de la Santé subvention de 5 U19 CA148112-02. BG a été financé par une subvention de projet de la charité appel Eve oncologie gynécologique (Royaume-Uni). Certains de ces travaux entrepris à UCLH / UCL a été en partie le financement du ministère de la Santé INDH recherche biomédicale système de financement du Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
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- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
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