Summary

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

Metoder for å rense kolesterol bindende toksin streptolysin O fra rekombinant<em> E. coli</em> Og visualisering av toksin binding til leve eukaryote celler er beskrevet. Lokalisert levering av toksin induserer raske og komplekse endringene i målrettede celler avslører nye sider ved toksin biologi.

Abstract

Bakterielle giftstoffer binder seg til kolesterol i membraner, forming porene som tillater lekkasje av mobilnettet innhold og tilstrømningen av materialer fra det ytre miljø. Cellen kan enten komme fra denne fornærmelse, som krever aktive membran reparasjonsprosesser, ellers dø avhengig av mengden av toksin eksponering og celletype en. I tillegg er disse toksiner indusere sterke inflammatoriske responser i infiserte verter gjennom aktivering av immunceller, inkludert makrofager, som produserer en rekke pro-inflammatoriske cytokiner 2. Mange grampositive bakterier produserer kolesterol bindende giftstoffer som har vist seg å bidra til virulens deres gjennom hovedsak uncharacterized mekanismer.

Morfologiske endringer i plasmamembranen av celler eksponert for disse toksiner inkluderer deres håndtering i kolesterol-beriket overflate fremspring, som kan utskilles i det ekstracellulære rom, tyder på en iboende cellulær forsvarmekanismen 3,4. Denne prosessen skjer på alle celler i fravær av metabolsk aktivitet, og kan bli visualisert med EM etter kjemisk fiksering 4. I immunceller slik som makrofager som medierer inflammasjon som svar på toksin eksponering, induseres membranvesikler foreslo å inneholde cytokiner av IL-1-familien, og kan være ansvarlig for både shedding toksinet og spre disse pro-inflammatoriske cytokiner 5,6,7. En kobling mellom IL-1β utgivelse og en bestemt type celledød, har kalt pyroptosis blitt foreslått, som begge er caspase-1 avhengige prosesser 8. Å sortere ut kompleksiteten i dette makrofag respons, som inkluderer toksin bindende, Shedding av membranvesiklene, cytokine release, og potensielt celledød, har vi utviklet merking teknikker og fluorescens mikroskopi metoder som tillater for sanntids visualisering av toksin-celle interaksjoner, inkludert målinger av dysfunksjon og død (figur 1). Brukav levende celle bildebehandling er nødvendig på grunn av begrensninger i andre teknikker. Biokjemiske metoder kan ikke løse effekter som oppstår i enkelte celler, mens flowcytometri ikke tilbyr høy oppløsning, sanntids visualisering av individuelle celler. Fremgangsmåtene beskrevet her kan brukes til kinetisk analyse av responser indusert av andre stimuli involverer komplekse fenotypiske endringer i celler.

Protocol

1. Rensing av Streptolysin O (SLO) Inokulere 20 ml over natten kultur av BL21 GOLD celler inneholdende pBADgIII-SLOhis plasmid 9 inn 0,5 L LB-næringsløsning og tilsett 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Rist kultur ved 225 rpm ved 37 ° C inntil OD 600 = 0,6, vanligvis ~ 1,5 hr. Sentrifuger 1 ml bakterier (vurderes T 0) på 10.000 xg 5 min, oppløse pellet i 140 ul 1x SDS sample buffer / 1 OD og sonicate å klippe DNA for protein renhet analyse. Induser bakterier med ti…

Representative Results

Typisk 10 7 -10 8 U / ml SLO kan oppnås med en proteinkonsentrasjon på 4 mg / ml. Mengden av toksin kreves for cellelyse varierer etter celletype, men er vanligvis 125 til 500 U / ml SLO (figur 2B). Celletyper som makrofager kan være mer motstandsdyktig (4000 U / ml) skjønt andre (spesielt T-cellelinjer) er mer følsomme. Disse sensitiviteter samsvarer med kommersielt tilgjengelig SLO. Toksin aktivitet reduserer omtrent to ganger med hver fryse-tine, så hemolytiske analyser me…

Discussion

Teknikkene som beskrives her la undersøkelse av svarene immunceller til bakterielle giftstoffer. Den mest kritiske trinnet er håndtering og dosering av toksinet. Toksin aktivitet kan være svært variabel, selv mellom forskjellige aliquoter av samme preparatet, på grunn av skjørhet sin. Dette nødvendiggjør enten testing hvert alikvot av toksin mot en referanse cellelinje eller RBCs eller bruker toxin gradienter. Toksin gradienter, som leveres av mikropipette, la hele spekteret av toksin-indusert aktiviteter som sk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke Richard Rest for den generøse gaven anthrolysin O, Michael Caparon for den generøse gaven av SLO plasmid og Jonathon Franks for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd T32CA82084 (PAK), og R01AI072083 (RDS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
polymixin-agarose Sigma P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col Fisher PI-89891
sheep RBCs Fisher 50-415-688
pBADgIII-SLO N/A N/A see ref9
Cy5 monoreactive dye GE Healthcare PA25001
Fura2-AM Life Technologies F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer Life Technologies L3224
Anti-CD11c-APC BD Biosciences 550261
collagen-coated glass-bottom dish Mattek P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II Fisher E5242957000
Microloader Fisher E5242956003
dextran Alexa 555 Life Technologies D34679
Injectman NI 2 Eppendorf 920000029
FemtoJet Eppendorf 5247 000.013

Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.

Buffer Composition Step Used
Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazole, pH 8.0
1.4
Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
1.7
Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
250 mM imidazole
1.8
RBC Assay buffer 0.3% BSA
2 mM CaCl2
10 mM HEPES, pH 7.4
2.1
buffer R/B RPMI cell culture medium
2 mM CaCl2
0.5% BSA
3.1

Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.

References

  1. Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
  2. Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
  3. Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
  4. Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
  5. MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
  6. Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
  7. Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
  8. Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
  9. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
  10. Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
  11. Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
  12. McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
  13. Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).

Play Video

Cite This Article
Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4227, doi:10.3791/4227 (2012).

View Video