Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Summary

Metoder for å rense kolesterol bindende toksin streptolysin O fra rekombinant<em> E. coli</em> Og visualisering av toksin binding til leve eukaryote celler er beskrevet. Lokalisert levering av toksin induserer raske og komplekse endringene i målrettede celler avslører nye sider ved toksin biologi.

Abstract

Bakterielle giftstoffer binder seg til kolesterol i membraner, forming porene som tillater lekkasje av mobilnettet innhold og tilstrømningen av materialer fra det ytre miljø. Cellen kan enten komme fra denne fornærmelse, som krever aktive membran reparasjonsprosesser, ellers dø avhengig av mengden av toksin eksponering og celletype ^en. I tillegg er disse toksiner indusere sterke inflammatoriske responser i infiserte verter gjennom aktivering av immunceller, inkludert makrofager, som produserer en rekke pro-inflammatoriske cytokiner ^2. Mange grampositive bakterier produserer kolesterol bindende giftstoffer som har vist seg å bidra til virulens deres gjennom hovedsak uncharacterized mekanismer.

Morfologiske endringer i plasmamembranen av celler eksponert for disse toksiner inkluderer deres håndtering i kolesterol-beriket overflate fremspring, som kan utskilles i det ekstracellulære rom, tyder på en iboende cellulær forsvarmekanismen ^3,4. Denne prosessen skjer på alle celler i fravær av metabolsk aktivitet, og kan bli visualisert med EM etter kjemisk fiksering ^4. I immunceller slik som makrofager som medierer inflammasjon som svar på toksin eksponering, induseres membranvesikler foreslo å inneholde cytokiner av IL-1-familien, og kan være ansvarlig for både shedding toksinet og spre disse pro-inflammatoriske cytokiner ^5,6,7. En kobling mellom IL-1β utgivelse og en bestemt type celledød, har kalt pyroptosis blitt foreslått, som begge er caspase-1 avhengige prosesser ^8. Å sortere ut kompleksiteten i dette makrofag respons, som inkluderer toksin bindende, Shedding av membranvesiklene, cytokine release, og potensielt celledød, har vi utviklet merking teknikker og fluorescens mikroskopi metoder som tillater for sanntids visualisering av toksin-celle interaksjoner, inkludert målinger av dysfunksjon og død (figur 1). Brukav levende celle bildebehandling er nødvendig på grunn av begrensninger i andre teknikker. Biokjemiske metoder kan ikke løse effekter som oppstår i enkelte celler, mens flowcytometri ikke tilbyr høy oppløsning, sanntids visualisering av individuelle celler. Fremgangsmåtene beskrevet her kan brukes til kinetisk analyse av responser indusert av andre stimuli involverer komplekse fenotypiske endringer i celler.

Protocol

1. Rensing av Streptolysin O (SLO) Inokulere 20 ml over natten kultur av BL21 GOLD celler inneholdende pBADgIII-SLOhis plasmid 9 inn 0,5 L LB-næringsløsning og tilsett 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Rist kultur ved 225 rpm ved 37 ° C inntil OD 600 = 0,6, vanligvis ~ 1,5 hr. Sentrifuger 1 ml bakterier (vurderes T 0) på 10.000 xg 5 min, oppløse pellet i 140 ul 1x SDS sample buffer / 1 OD og sonicate å klippe DNA for protein renhet analyse. Induser bakterier med ti…

Representative Results

Typisk 10 7 -10 8 U / ml SLO kan oppnås med en proteinkonsentrasjon på 4 mg / ml. Mengden av toksin kreves for cellelyse varierer etter celletype, men er vanligvis 125 til 500 U / ml SLO (figur 2B). Celletyper som makrofager kan være mer motstandsdyktig (4000 U / ml) skjønt andre (spesielt T-cellelinjer) er mer følsomme. Disse sensitiviteter samsvarer med kommersielt tilgjengelig SLO. Toksin aktivitet reduserer omtrent to ganger med hver fryse-tine, så hemolytiske analyser me…

Discussion

Teknikkene som beskrives her la undersøkelse av svarene immunceller til bakterielle giftstoffer. Den mest kritiske trinnet er håndtering og dosering av toksinet. Toksin aktivitet kan være svært variabel, selv mellom forskjellige aliquoter av samme preparatet, på grunn av skjørhet sin. Dette nødvendiggjør enten testing hvert alikvot av toksin mot en referanse cellelinje eller RBCs eller bruker toxin gradienter. Toksin gradienter, som leveres av mikropipette, la hele spekteret av toksin-indusert aktiviteter som sk…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.