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Immunology and Infection

प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की piggyBac Transposon सिस्टम संशोधन

Published: November 5, 2012 doi: 10.3791/4235
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,6, 2, 4,5,7, 1,2,4,8
1Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine, 3Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, 4Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 6Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine, 7Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 8Michael E. DeBakey VA Medical Center

Summary

हम आनुवंशिक रूप से एक गैर वायरल का उपयोग transgene साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक विधि का वर्णन

Protocol

0 दिन

1. PBMCs मानव रक्त से अलगाव

  1. ताजा मानव ना हेपरिन vacutainer ट्यूब में venipuncture का उपयोग करते हुए रक्त के 20 मिलीग्राम ले लीजिए.
  2. मिक्स रक्त और उन्नत 1:01 में १,६४० RPMI अनुपात (v / v).
  3. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (25 डिग्री सेल्सियस) के लिए 20 मिलीग्राम lymphoprep मध्यम जोड़ें. रक्त RPMI lymphoprep के शीर्ष पर १,६४० मिश्रण का धीरे - धीरे परत 25-30 मिलीलीटर.
  4. ब्रेक के बिना 40 मिनट के लिए 400 XG अपकेंद्रित्र.
  5. दोनों अलग और फजी 1x पीबीएस (25 डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर में एक डिस्पोजेबल विंदुक का उपयोग कर परतों ले लीजिए और मात्रा 1x पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर लाने.
  6. 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र.
  7. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate और उन्नत RPMI 1640 की 20 मिलीलीटर जोड़ें.
  8. 5 मिनट के लिए 400 XG अपकेंद्रित्र.
  9. तैरनेवाला Aspirate. पूरा टी सेल 5 एनजी / rhIL-15 मिलीग्राम के साथ पूरक मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed
  10. एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर कोट में कोशिकाओं और थाली की संख्या की गणना/ पूरा टी सेल मीडिया में अच्छी तरह से 2 x 10 6 कोशिकाओं में एड प्लेट 5 एनजी / rhIL-15 मिलीग्राम के आसपास के कुओं बाँझ पानी के साथ पूरक. एक humidified इनक्यूबेटर में 37 में रातोंरात सेते ° सी, 5% सीओ 2.

1 दिन

2. टी कोशिकाओं उत्तेजक विरोधी CD28 और विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ के लिए कोटिंग प्लेट्स

  1. बाँझ पानी में 1 ग्राम / प्रत्येक मिलीलीटर की एक एकाग्रता में विरोधी CD28 और विरोधी CD3 एंटीबॉडी पतला.
  2. 500 μl प्रत्येक एंटीबॉडी एक ऊतक गैर लेपित 24 अच्छी तरह से थाली संस्कृति के 5 कुओं के रूप में चिह्नित करने के लिए समाधान जोड़ें.
  3. बाँझ पानी जोड़ें कुओं के आराम करने के लिए. लपेटें हटना लपेटो और एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में जगह में थाली.

3. Unstimulated टी कोशिकाओं की Nucleofection

  1. 37 पर Prewarm टी सेल मीडिया डिग्री सेल्सियस और 5 एनजी / मिलीलीटर rhIL-15 के साथ पूरक. 2.25 Nucleofector समाधान के मिलीग्राम Nucleofector 1 अनुपूरक की 500 μl जोड़कर पूरा nucleofector समाधान तैयार.
  2. एकtransposon (Zeo - पीटी सीएमवी EGFP) और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में Transposase (pCMV - piggyBac) liquot 5 ग्राम प्रत्येक नोट: यह आवश्यक हो सकता है और इष्टतम जीन डिलीवरी के लिए transposon डीएनए राशि Transposase अनुकूलन और कम से कम हो सकता है सेलुलर विषाक्तता. plasmids लेखकों से अनुरोध के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
  3. 24 एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट से हार्वेस्ट PBMCs. कोशिकाओं की संख्या की गणना करें. प्रवाह cytometry के दौरान नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए 2 x 10 6 कोशिकाओं को बचाओ.
  4. एक 15 मिलीग्राम और 400 XG, 5 मिनट में ट्यूब अपकेंद्रित्र 7-10 x 10 6 कोशिकाओं जोड़ें, सतह पर तैरनेवाला और उंगली झटका गोली aspirate.
  5. टी सेल पूरा nucleofection ढीला सेल गोली समाधान के 100 μl जोड़ें.
  6. Plasmids युक्त ट्यूब समाधान सेल मिश्रण जोड़ें.
  7. Nucleofection क्युवेट के नीचे करने के लिए समाधान सेल प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ें. किसी भी बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहो.
  8. समर्थक का उपयोग कोशिकाओं Nucleofectग्राम U-014 (unstimulated टी कोशिकाओं, मानव, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
  9. तुरंत rhIL-15 के साथ क्युवेट prewarmed मीडिया के 500 μl जोड़ने. एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं rhIL15 साथ prewarmed मीडिया के 1.5 मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण.
  10. एक humidified इनक्यूबेटर में 37 में रातोंरात सेते ° सी, 5% सीओ 2.

2 दिन

4. टी कोशिकाओं की nonspecific उत्तेजना

  1. हार्वेस्ट कोशिकाओं और सेल संख्या का निर्धारण. अलग सेट 0.5 x 10 प्रवाह cytometry के लिए 6 कोशिकाओं GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित. नियंत्रण के रूप में गैर - ट्रांसफ़ेक्ट PBMCs का प्रयोग करें.
  2. गैर टिशू कल्चर लेपित थाली से CD3/28 एंटीबॉडी समाधान Aspirate और टी सेल मीडिया के साथ प्रत्येक अच्छी तरह कुल्ला.
  3. पूरा सीटीएल मीडिया में 0.5 x 10 मिलीग्राम प्रति 6 कोशिकाओं में nucleofected कोशिकाओं Resuspend5 एनजी / rhIL-15 मिलीग्राम के साथ पूरक. 2.0 प्रत्येक गैर टिशू कल्चर प्लेट के 4 कुओं में nucleofected कोशिकाओं के मिलीलीटर जोड़ें. अच्छी तरह से 5 वें करने के लिए 0.5 x 10 6 गैर nucleofected कोशिकाओं जोड़ें.
  4. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 3 दिनों के लिए सेते ° सी, 5% सीओ 2.

5 दिन

  1. प्रेरित टी कोशिकाओं को गैर लेपित ऊतक संस्कृति की थाली से फसल.
  2. गणना और एक 24 अच्छी तरह से लेपित टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं replate 0.7 x 10 6 5 एनजी / मिलीलीटर आईएल-15 के साथ / टी सेल मीडिया में मिलीलीटर कोशिकाओं.

7 दिन

7. जीन एक्सप्रेशन का विश्लेषण

  1. हार्वेस्ट कोशिकाओं और मानव विरोधी CD8 एंटीबॉडी के साथ दाग (भी विरोधी CD3 और विरोधी CD4 इस्तेमाल कर सकते हैं) और% GFP अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry के साथ विश्लेषण.

8 दिन (वैकल्पिक)

8. टी कोशिकाओं का विस्तार

  1. अभिकर्मक के बाद 8 दिन, टी कोशिकाओं टी में replated जा सकता है0.7 x 10 और 16 विस्तार के लिए अच्छी तरह से प्रति 6 कोशिकाओं के घनत्व में सेल IL-15 के साथ मीडिया.

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Representative Results

एक आनुवंशिक रूप से एक रिपोर्टर जीन (EGFP) के साथ मानव टी lymphocytes को संशोधित करने में कदम प्रदर्शन योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया गया है. इन plasmids लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध हैं. आनुवंशिक रूप से संशोधित एक रिपोर्टर जीन (EGFP) के साथ मानव टी lymphocytes में कदम प्रदर्शन schemtic चित्रा 2 में showin है यह टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के क्रम में उन्हें विभाजित, विस्तार करने के लिए, और संस्कृति में प्रचार पाने के लिए आवश्यक है. संशोधित मानव टी कोशिकाओं और सुसंस्कृत थे तो जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक दिन और 7 दिन पर प्रवाह cytometry का विश्लेषण का उपयोग. दिखाया चित्रा 3 में एक दाता से परिणाम कोशिकाओं (APC) allophycocyanin संयुग्मित विरोधी CD8 एक 4 प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित FACSCalibur EGFP (transgene) और APC प्रतिदीप्ति के लिए विश्लेषण के साथ दाग थे सेल क्वेस्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग (Becton Dickinson). हम पहले दोनों CD4 और CD8 पॉजिटिव टी कोशिकाओं के जीन संशोधन और यहाँ दानव मनायाएक उदाहरण के रूप में 7 CD8 पॉजिटिव कोशिकाओं रणनीतियां. हालांकि हम एकल transgene अभिव्यक्ति यहां के लिए विश्लेषण, piggyBac भी मानव कोशिकाओं में 17 बहु - जीन (या मल्टिप्लेक्स) जीन स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल किया गया है. 1 दिन और 7 दिन के बीच EGFP अभिव्यक्ति में कमी होने की संभावना है तथ्य यह है कि नहीं सभी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं transposon डीएनए के स्थिर एकीकरण से गुजरना की वजह से है.

चित्रा 1
चित्रा 1 piggyBac मानव टी कोशिकाओं की मध्यस्थता जीन संशोधन के लिए इस्तेमाल किया plasmids के योजनाबद्ध. सीएमवी, cytomegalovirus प्रमोटर, intron, mRNA स्थिरीकरण के लिए SV40 intron, piggyBac, Transposase सीडीएनए; SV40 PA, polyadenylation साइट, PUC, प्रतिकृति का मूल, ख लैक्टामेज़ एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन, PB3'IR, piggyBac 3 'उल्टे दोहराने; PB5' IR, piggyBac. '5 औंधा दोहराने; ZeoR, zeocin प्रतिरोध जीन, R6K Ori, प्रतिकृति का मूल, IVS, बीच अनुक्रम EGFP, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन नोट: एंटीबायोटिक्स बैक्टीरियल चयन और विकास के लिए इस्तेमाल किया गया, लेकिन टी सेल संस्कृतियों में इस्तेमाल किया गया नहीं यहाँ क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .

चित्रा 2
चित्रा 2 प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं piggyBac transposon प्रणाली का उपयोग कर के संशोधन का वर्णन योजनाबद्ध.

चित्रा 3
चित्रा 3 टी कोशिकाओं में स्थिर transgene अभिव्यक्ति piggyBac transposon syste साथ संशोधितमीटर. वाम पैनल: 1 दिवस पर EGFP अभिव्यक्ति. सही पैनल: 7 दिन EGFP अभिव्यक्ति बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ बताया विधि प्राथमिक मानव टी lymphocytes के स्थिर transgene संशोधन के लिए सक्षम बनाता है. हम पहले piggyBac transposon प्रणाली के उपयोग का परीक्षण किया है के लिए टी कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक संवाददाता जीन (4 सप्ताह से अधिक के लिए), एक गैर immunogenic आत्महत्या जीन, दत्तक immunotherapy के लिए एक chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (100 से अधिक दिनों के लिए) को व्यक्त करने के लिए, और immunosuppressive 7,13-15 दवाओं के लिए प्रतिरोध करने के लिए इंजीनियर. दत्तक immunotherapy और अन्य अनुप्रयोगों के लिए टी कोशिकाओं की गैर वायरल संशोधन बहुत कम खर्चीला है और रेट्रोवायरल transduction की तुलना में इसलिए अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाना चाहिए. नई अतिसक्रिय piggyBac तत्वों का उपयोग स्थिर मानव टी कोशिकाओं 9 संशोधित transgene के निर्माण की व्यवहार्यता में वृद्धि करनी चाहिए. हालांकि यहाँ बताया नहीं, एक संभावित नैदानिक ​​आवेदन के लिए stably ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं की आवश्यक संख्या प्राप्त कर सकते हैं. PiggyBac की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण और ए का एक संयोजन का उपयोग562 (कृत्रिम प्रतिजन) फीडर कोशिकाओं, के बारे में 2 x 10 6 stably ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं के एक प्रारंभिक उपज 10 10 पर 4 से 5 हफ्तों में टी कोशिकाओं transduced और 12 10 से 4 से 5 लॉग 6 से 7 में विस्तार किया जा सकता है 7 सप्ताह. मानव टी कोशिकाओं में piggyBac एकीकरण साइटों का विश्लेषण आद्य ओंकोजीन की दिशा में कोई पूर्वाग्रह से पता चला है, तथापि, यह अत्यधिक सक्रिय टी कोशिकाओं में व्यक्त जीनों में एकीकृत जब nucleofection 13 ऊपर उल्लिखित तकनीक का उपयोग कर के लिए एक predilection दिखाने PiggyBac स्थिर लिए एक आशाजनक पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है. आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए मानव टी कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एसएस भाग में ग्रैड TBMM कार्यक्रम के माध्यम से प्रशिक्षण अनुदान में HHMI मेड द्वारा समर्थित है. MHW भाग में दिग्गजों मामलों के विभाग से एक कैरियर विकास पुरस्कार और डॉ. और श्रीमती हेरोल्ड एम. Selzman की उदार सहायता के द्वारा समर्थित है. यह काम भी NIH लिंफोमा बीजाणु अनुदान P50CA126752 और NIH DK093660 R01 द्वारा भाग में समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lympholyte Cedarlane CL5015
Advanced RPMI 1,640 LifeTechnologies 12633020
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3008803
GlutaMAX-I Supplement LifeTechnologies 35050-061
Human IL-15 Recombinant Protein eBioscience 14-8159
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza VPA-1002
CD8-APC Southern Biotech 9536-11
Anti-Human CD3 eBioscience 16-0037-81
Anti-Human CD28 BD Pharmingen 555725
24 Well Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 353047
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 351147
Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

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References

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Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., … More

Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).

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