Vävnadsteknik av tarmen i en murin modell
Summary
Den här artikeln och den åtföljande videon presenterar vår protokoll för att generera vävnadstekniska tarmen i musen med hjälp av en organoid enheter-på-schavotten strategi.
Abstract
Vävnadstekniska tunntarmen (TESI) har framgångsrikt använts för att rädda Lewis-råttor efter massiv tunntarmen resektion, vilket resulterar i återgång till preoperativa vikter inom 40 dagar. 1 Hos människor kan massiva tunntarmen resektion resultera i kort tarm, en funktionell malabsorptiv stat som ger hög sjuklighet, dödlighet och sjukvårdskostnader, inklusive parenteral nutrition beroende, leversvikt och levercirros, och behovet av multiorgan organtransplantation. 2 I detta dokument beskriver vi och dokumentera vår protokoll för att skapa vävnadstekniska tarmen i en musmodell med en flercellig organoid enheter-på-schavotten strategi. Organoid enheter är flercelliga aggregat som härrör från tarmen som innehåller både slemhinnor och mesenkymala element, 3 förhållandet mellan som bevarar den intestinala nisch stamceller. 4 i pågående och framtida forskning, övergången av vår teknik tillmus kommer att möjliggöra undersökning av processer under TESI bildning genom att använda de transgena verktyg tillgängliga i denna art. 5 Tillgången till nedsatt immunförsvar musstammar också kommer att tillåta oss att tillämpa tekniken för människors tarmvävnad och optimera bildandet av mänskliga TESI som mus xenograft innan dess övergång till människor. Vår metod använder god tillverkningssed (GMP) reagenser och material som redan har godkänts för användning i humana patienter, och därför ger en betydande fördel över metoder som förlitar sig på decellulariserade djurvävnader. Det yttersta målet för detta förfarande är dess översättning till människor som en regenerativ medicin terapeutisk strategi för kort tarm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för att producera vävnadstekniska tarmen hos mus med en organoid enheter-på-schavotten strategi. De mest kritiska stegen är de av organoid enheter beredningen. Försiktighet måste vidtas för att tillräckligt ren och mekaniskt bearbeta vävnaden, men samma omsorg måste tas inte overdigest eller overtriturate de organoid enheter efter matsmältningen utförs (steg 1,11). Om detta görs kan de organoid enheterna reduceras till enstaka celler, som kan förloras i supernatanten av steg 1,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tracy C Grikscheit, Erik R. Barthel, och Frédéric G. Sala stöds av California Institute för regenerativ medicin (CIRM) bevilja nummer RN2-00.946-1 (TCG) och TG2-01.168 (ERB, FGS). Allison L. Speer är en Society of University Surgeons Ethicon forskare. Yashuhiro Torashima finansieras av ett barnsjukhus Los Angeles Saban Institute Research Career Development Fellowship.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung’s disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn’s disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
