Summary

Vävnadsteknik av tarmen i en murin modell

Published: December 01, 2012
doi:

Summary

Den här artikeln och den åtföljande videon presenterar vår protokoll för att generera vävnadstekniska tarmen i musen med hjälp av en organoid enheter-på-schavotten strategi.

Abstract

Vävnadstekniska tunntarmen (TESI) har framgångsrikt använts för att rädda Lewis-råttor efter massiv tunntarmen resektion, vilket resulterar i återgång till preoperativa vikter inom 40 dagar. 1 Hos människor kan massiva tunntarmen resektion resultera i kort tarm, en funktionell malabsorptiv stat som ger hög sjuklighet, dödlighet och sjukvårdskostnader, inklusive parenteral nutrition beroende, leversvikt och levercirros, och behovet av multiorgan organtransplantation. 2 I detta dokument beskriver vi och dokumentera vår protokoll för att skapa vävnadstekniska tarmen i en musmodell med en flercellig organoid enheter-på-schavotten strategi. Organoid enheter är flercelliga aggregat som härrör från tarmen som innehåller både slemhinnor och mesenkymala element, 3 förhållandet mellan som bevarar den intestinala nisch stamceller. 4 i pågående och framtida forskning, övergången av vår teknik tillmus kommer att möjliggöra undersökning av processer under TESI bildning genom att använda de transgena verktyg tillgängliga i denna art. 5 Tillgången till nedsatt immunförsvar musstammar också kommer att tillåta oss att tillämpa tekniken för människors tarmvävnad och optimera bildandet av mänskliga TESI som mus xenograft innan dess övergång till människor. Vår metod använder god tillverkningssed (GMP) reagenser och material som redan har godkänts för användning i humana patienter, och därför ger en betydande fördel över metoder som förlitar sig på decellulariserade djurvävnader. Det yttersta målet för detta förfarande är dess översättning till människor som en regenerativ medicin terapeutisk strategi för kort tarm.

Protocol

1. Organoid enheter Förberedelser Instrument lämpliga för mus dissektion (saxar och pincetter) bör steriliseras genom autoklav. Humant avliva givaren musen enligt lokala IACUC protokoll. Se till att djuret är dött innan du fortsätter. Gör en mittlinjesnitt att få tillgång till den peritoneala kaviteten. Hud flikar kan reflekteras som behövs för att förbättra exponeringen. Rensning tunntarmen och dela det precis distalt ligamentet av Treitz. Separera tunntarmen från…

Representative Results

Figur 1 visar en övergripande schema för protokollet dokumenteras här. Slutresultatet av detta protokoll är ett klot eller sfärisk struktur vävnadstekniska murin tarmen med en lumen, slemhinnor, submucosa och omgivande muscularis. Figur 2A visar en typisk jordglob i jämförelse med en utgångspunkt polymerskelett. Figur 2B visar samma konstruktion skarpt bivalved att avslöja dess lumen. Figur 3 visar en hematoxylin / eosin-färgade paraffin-mont…

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för att producera vävnadstekniska tarmen hos mus med en organoid enheter-på-schavotten strategi. De mest kritiska stegen är de av organoid enheter beredningen. Försiktighet måste vidtas för att tillräckligt ren och mekaniskt bearbeta vävnaden, men samma omsorg måste tas inte overdigest eller overtriturate de organoid enheter efter matsmältningen utförs (steg 1,11). Om detta görs kan de organoid enheterna reduceras till enstaka celler, som kan förloras i supernatanten av steg 1,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tracy C Grikscheit, Erik R. Barthel, och Frédéric G. Sala stöds av California Institute för regenerativ medicin (CIRM) bevilja nummer RN2-00.946-1 (TCG) och TG2-01.168 (ERB, FGS). Allison L. Speer är en Society of University Surgeons Ethicon forskare. Yashuhiro Torashima finansieras av ett barnsjukhus Los Angeles Saban Institute Research Career Development Fellowship.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
HBSS Gibco 114170-112
Antibiotic-Antimycotic 100X Invitrogen 15240-062
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Type 1 Worthington LS004194
DMEM High Glucose 1X Gibco 11995-065
Heat inactivated FBS Invitrogen 16140-071
Biofelt 100% PGA Concordia Medical FELT01-1005 For polymer preparation as in Ref. 4
Poly-L-lactic acid Durect B6002-1 For polymer preparation as in Ref. 4
Type I Collagen, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL For polymer preparation as in Ref. 4
Ketoprofen 100 mg/ml Fort Dodge Animal Health 71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 rodent chow LabDiet 5001
Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP Hi-Tech Pharmacal 50383-824-16
Isoflurane, USP Phoenix Pharmaceuticals 57319-507-06

References

  1. Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
  2. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
  3. Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
  4. Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
  5. Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
  6. Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
  7. Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung’s disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
  8. Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
  9. Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
  10. Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn’s disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
  11. Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
  12. Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
  13. Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
  14. Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
  15. Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).

Play Video

Cite This Article
Barthel, E. R., Speer, A. L., Levin, D. E., Sala, F. G., Hou, X., Torashima, Y., Wigfall, C. M., Grikscheit, T. C. Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model. J. Vis. Exp. (70), e4279, doi:10.3791/4279 (2012).

View Video