Vävnadsteknik av tarmen i en murin modell

Summary

Den här artikeln och den åtföljande videon presenterar vår protokoll för att generera vävnadstekniska tarmen i musen med hjälp av en organoid enheter-på-schavotten strategi.

Abstract

Vävnadstekniska tunntarmen (TESI) har framgångsrikt använts för att rädda Lewis-råttor efter massiv tunntarmen resektion, vilket resulterar i återgång till preoperativa vikter inom 40 dagar. ¹ Hos människor kan massiva tunntarmen resektion resultera i kort tarm, en funktionell malabsorptiv stat som ger hög sjuklighet, dödlighet och sjukvårdskostnader, inklusive parenteral nutrition beroende, leversvikt och levercirros, och behovet av multiorgan organtransplantation. ² I detta dokument beskriver vi och dokumentera vår protokoll för att skapa vävnadstekniska tarmen i en musmodell med en flercellig organoid enheter-på-schavotten strategi. Organoid enheter är flercelliga aggregat som härrör från tarmen som innehåller både slemhinnor och mesenkymala element, ³ förhållandet mellan som bevarar den intestinala nisch stamceller. ⁴ i pågående och framtida forskning, övergången av vår teknik tillmus kommer att möjliggöra undersökning av processer under TESI bildning genom att använda de transgena verktyg tillgängliga i denna art. ⁵ Tillgången till nedsatt immunförsvar musstammar också kommer att tillåta oss att tillämpa tekniken för människors tarmvävnad och optimera bildandet av mänskliga TESI som mus xenograft innan dess övergång till människor. Vår metod använder god tillverkningssed (GMP) reagenser och material som redan har godkänts för användning i humana patienter, och därför ger en betydande fördel över metoder som förlitar sig på decellulariserade djurvävnader. Det yttersta målet för detta förfarande är dess översättning till människor som en regenerativ medicin terapeutisk strategi för kort tarm.

Protocol

1. Organoid enheter Förberedelser

1. Instrument lämpliga för mus dissektion (saxar och pincetter) bör steriliseras genom autoklav.
2. Humant avliva givaren musen enligt lokala IACUC protokoll. Se till att djuret är dött innan du fortsätter.
3. Gör en mittlinjesnitt att få tillgång till den peritoneala kaviteten. Hud flikar kan reflekteras som behövs för att förbättra exponeringen.
4. Rensning tunntarmen och dela det precis distalt ligamentet av Treitz. Separera tunntarmen från dess tarmkäx med skarpa och mild trubbig dissektion. Identifiera ileocecal korsningen och dela tunntarmen 5 mm proximalt till detta.
5. Med sax, öppna tarmen längdriktning antimesenteric gränsen i en Petri-skål med 10 ml 4 ° C, steril Hanks buffrade saltlösning (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotikum-svampmotverkande (anti-anti, Invitrogen) lösning. Rensa avföring från den öppnade tarmen medförsiktig omröring överföra öppnas sedan tarmen till en 15 ml centrifugrör med 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti.
6. Tvätta den öppnade tarmen tre gånger i 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti i ett provrör. Varje tvätt kan utföras med mild skakning av 15 ml rör under 30 sek. Efter skakning sjunker tarmvävnaden till botten av röret. Kassera flytande material, vilket är mesenkymala skräp. Ta tvättlösningen försiktigt med en pipett.
7. Finhacka tvättade tarmen i en petriskål med 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti till mindre än 1 mm kvadratiska bitar med en sax. Samla det malda materialet med en automatisk pipett och placera den i ett provrör.
8. Centrifugera röret vid 500 rpm under 8 minuter. Kasta bort supernatanten, som innehåller fett och mesenkym.
9. Smälta malda, tvättade materialet med 10 ml steril HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml dispas (Invitrogen) och 800 enheter / mL kollagenas typ 1 (Worthington, Lakewood NJ). För att bereda 40 ml av lösningen matsmältningen, vägs 5 mg dispas, 142 mg kollagenas, och lägga steril HBSS upp till en volym av 40 ml. Bered denna lösning nyligen varje gång organoid enheter är beredda, och hålla vid 4 ° C tills den ska användas. Tillsätt matsmältningen lösningen direkt till pelleten från steg 1,8.
10. Inkubera provröret som innehåller malda, tvättade materialet med matsmältningen lösningen vid 37 ° C under 20 minuter.
11. Hämta provröret och ytterligare störa den digererade vävnaden genom triturering med en 10 ml pipett. Upprepa mellan 20 till 50 gånger tills ett enhetligt utseende erhålles.
12. Centrifugera provröret under 5 minuter vid 800 varv per minut. Kasta bort supernatanten, som innehåller enskilda celler.
13. Stoppa uppslutningsreaktionen med 10 ml 4 ° C, steril Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% volym / volym värmeinaktiverat fetalt bovint serum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspendera pellet och skaka röret.
14. Centrifugera provröret under 5 minuter vid 800 varv per minut. Avlägsna supernatanten försiktigt med en automatisk pipett tills de sista dropparna. Använd en disponibel plast pipett för de senaste några droppar för att undvika att återsuspendering pelleten.

2. Lastning av polyglykolsyra Scaffold

1. Form 2-mm långa, 5-mm yttre diameter cylindriska byggnadsställningar från ovävda polyglykolsyra (2-mm plåttjocklek, 60 mg cm-3 skrymdensitet, porositet> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) såsom beskrivits i Ref. 4.
2. Trimma distala 2 mm av en engångs 1.000 mikroliter pipett toppen med en sax som framställts med 70% etanol i destillerat vatten.
3. Placera ställningen i en 4-brunnars odlingsplatta. Ladda organoid enheter på ställningen med på 1.000 mikroliter pipett, först in i lumen och därefter på den yttre ytan. Använd en tång för att säkerställa beläggning av lumen. Stör inte eller bryta den cylindriska formen av polymeren.

   3. Implantation i värdmusen

   1. Använd en syngen värd musen på samma bakgrund som givaren om det finns. Annars använder en nedsatt immunförsvar nonobese diabetiker / svår kombinerad immunbrist eller NOD / SCID djur (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
   2. Inducera generell anestesi med isofluran. Raka, prep och drapera musens mage.
   3. Gör en 5 mm mittlinjeincision att få tillträde till den peritoneala kaviteten. Identifiera och noggrant rensning större omentum. Placera den laddade polymeren på omentum och linda den med vävnaden. Riv inte omentum.
   4. Fäst polymeren omentum med en 5-0 monocryl sutur. Försiktigt ersätta omentum med den lindade polymeren i sin anatomiska läge.
   5. Stäng buksnitt i skikt med 4-0 Vicryl suturer. Kör muskeln stängningen och se till att inte skada buken inälvor under snittet. Använd avbrutna suturer för huden.
   6. Administrera postoperativ smärtlindring med 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) i sterilt vatten som en subkutan strimmigt intill snittet. Djuren bör utvärderas dagligen och om djuret visar tecken på smärta eller obehag, kan ytterligare en dos av ketoprofen administreras på postoperativ dag 2. Genom den tredje postoperativa dagen, bör djuret återhämtat sig helt utan tecken på smärta eller ångest. Om smärta eller lidande fortsätter på postoperativ dag 3 anses detta vara onormal och bör behandlas i enlighet med de IACUC och djur protokoll vårdinrättning.
   7. Låt musen för att återhämta och vävnadstekniska tarmen att växa i fyra veckor. Ge djuret tillgång ad libitum till gnagare (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St Louis, MO) och vatten med Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) vid 1:100 utspädning.

   4. Skörd

   1. HumaNely euthanize värddjuret fyra veckor efter implantation.
   2. Öppna den ursprungliga snittet och återspeglar huden cephalad att underlätta tillträdet till bukhålan.
   3. Öppna muskelskiktet och identifiera vävnaden-modifierade konstruktionen som en glob av vävnad.
   4. Ta ner sammanväxningar till konstruktionen från intraabdominalt inälvor med skarp dissektion.
   5. Fäst konstruktionen i formalin för senare paraffin montering eller använd vävnaden färsk biokemiska analyser såsom realtids-PCR eller protein isolering.

Representative Results

Figur 1 visar en övergripande schema för protokollet dokumenteras här. Slutresultatet av detta protokoll är ett klot eller sfärisk struktur vävnadstekniska murin tarmen med en lumen, slemhinnor, submucosa och omgivande muscularis. Figur 2A visar en typisk jordglob i jämförelse med en utgångspunkt polymerskelett. Figur 2B visar samma konstruktion skarpt bivalved att avslöja dess lumen. Figur 3 visar en hematoxylin / eosin-färgade paraffin-monterad tvärsektion av en typisk framgångsrik konstruktion efter 4 veckors inkubering. I Ref. 4, kunde vi producera vävnadstekniska tarm framgångsrikt 89% av tiden (39 av 44 implantat).

En misslyckad konstruktion är en i vilken inga slemhinna former. Det är omöjligt att bedöma baserad på brutto utseende vid skörd om i världen kommer att ha slemhinnan på slutlig histologisk analys. Därför om biokemiska analyser är performed på den färska konstruktionen vävnaden, bör hälften av varje glob fastställas och paraffin monterad för histologisk analys för att bekräfta att slemhinnan är närvarande i varje prov. En misslyckad konstruktion kommer att visa enbart stroma och fibros i hematoxylin / eosin färgning.

Figur 1. Schemat för produktion av tissue-engineered tarmen hos mus. I korthet, är donatorvävnad skördas och bearbetas till organoid enheter. De organoid enheterna lastas på en porös polyglykolsyra byggnadsställning, som sedan implanteras i en värd och inkuberas under 4 veckor. Den modifierade konstruktionen hämtas sedan och kan karakteriseras genom histologi eller biokemiska analyser.

Figur 2. Exempel på vävnadstekniska tarmen konstruktionen skördas vid 4 veckor. A: Bygga i företagRisön att starta polymerskelett. B: Samma konstruktion, bivalved att avslöja sina lumen.

Figur 3. Låg effekt hematoxylin / eosin mikroskop av en typisk framgångsrik vävnadstekniska tarmen konstruktion. Etiketterna och pilar visar lumen med tarmslemhinnan, och vidhäftande värd bukspottkörteln.

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för att producera vävnadstekniska tarmen hos mus med en organoid enheter-på-schavotten strategi. De mest kritiska stegen är de av organoid enheter beredningen. Försiktighet måste vidtas för att tillräckligt ren och mekaniskt bearbeta vävnaden, men samma omsorg måste tas inte overdigest eller overtriturate de organoid enheter efter matsmältningen utförs (steg 1,11). Om detta görs kan de organoid enheterna reduceras till enstaka celler, som kan förloras i supernatanten av steg 1,12, och det är osannolikt att överleva för att producera vävnadstekniska tarmen, skulle då tarmen stamceller nisch inte bevaras i fall.

Den lilla storleken på musen gör det svårt att direkt anastomose vävnaden-modifierade konstruktionen av värddjurets tarm för att testa dess funktion in vivo. Alternativt representerar råttan en större modell för TESI tillväxt som underlättar in vivo-och anastomosredan har utförts av denna anledning ^1. Ändå är storleken på musen inte ett oöverstigligt hinder, som andra har kunnat utföra tunntarmen resektion och anastomos, ⁶ eller anorektal kirurgi, ⁷ i dessa djur. För att lösa dessa frågor, experiment för att karakterisera funktionen av våra vävnadstekniska intestinala konstruktioner i en in vitro sätt pågår. Ytterligare begränsningar denna teknik inkluderar en 89% framgång i genereringen av TESI ^4. Det är, kommer 89% av OU laddade ställningar genererar framgångsrikt TESI. Tillämpningen av denna teknik av andra kan bidra förfina och förbättra denna teknik ökar det totala utbytet till 100%. Dessutom skulle denna teknik kunna förbättras om den totala kroppsmassa genereras kan ökas. För närvarande, har flödescytometri visade att det totala antalet celler närvarande i den skördade TESI konstruktionen är 3-faldigt större än antalet närvarande vid implantering(3,07 x 10 ⁶ ± 0,5 x 10 ^{6) 4.} Förbättra volym TESI produktion är ett viktigt steg mot omräkning till terapi.

Vi noterar också att musen tarmen, är mycket tunna väggar och små kaliber, är särskilt lätt att bearbeta i jämförelse med andra arter, t.ex. svin eller råtta. Hos människor förväntar vi oss att några av detaljerna i de organoid enheter framställningsstegen skulle behöva modifieras för att både smälta tillräckligt vävnaden och undvika overdigestion till enstaka celler, särskilt koncentrationerna av dispas och kollagenas i matsmältningen lösningen och tiden för digerering vid 37 ° C.

Det yttersta målet för denna teknik är en övergång till humanterapi. Vävnadsteknik av mänskliga tarmen från patientens egen vävnad skulle kunna erbjuda en hållbar, långsiktig botemedel för kort tarm (SBS) med ingen av nackdelarna hos existerande terapier. Kort tarm SYNdrome är en sjuklig tillstånd som orsakas av resektion av en betydande del av den totala längden av tunntarmen, vanligen större än 50-75 procent, så att dess absorptionsförmåga kraftigt reduceras och patienten inte kan få tillräcklig näring från enteral nutrition. ² I barn, de vanligaste orsakerna till SBS är massiva tunntarmen resektion sekundärt till nekrotiserande enterokolit eller malrotation med midgut tarmvred. ^8,9 också, men mindre vanliga, kan SBS uppstå hos vuxna på grund av flera resektioner i fastställandet av Crohns sjukdom, eller mesenteriska ischemi sekundär till vaskulär sjukdom. ^10,11 Eftersom SBS patienter inte kan upprätthålla tillräcklig näring med enteral intag kan de kräva en långsiktig total parenteral nutrition, som själv kan vara komplicerat för barn med leversvikt och levercirros. ¹² SBS patienter därför uthärda betydande vårdkostnader, nyligen uppskattas till i storleksordningen $ 1.600.000 per patientöver 5 år. ¹³ Den nuvarande standardbehandling för intestinal misslyckande sekundärt till SBS är intestinala, lever / tarm eller annan multiorgan transplantation, men detta ger bara en 60% 5-års överlevnad och consigns patienten till en livslång förlopp immunsuppressiv behandling . ¹⁴ Vidare begränsad donatororgan tillgänglighet resulterar i en oundviklig obalans i tillgång och efterfrågan och långa väntan. ¹⁵ Därför skulle vävnadsteknik från patientens autolog vävnad vara ett attraktivt alternativ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Gibco	114170-112
Antibiotic-Antimycotic 100X	Invitrogen	15240-062
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase Type 1	Worthington	LS004194
DMEM High Glucose 1X	Gibco	11995-065
Heat inactivated FBS	Invitrogen	16140-071
Biofelt 100% PGA	Concordia Medical	FELT01-1005	For polymer preparation as in Ref. 4
Poly-L-lactic acid	Durect	B6002-1	For polymer preparation as in Ref. 4
Type I Collagen, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	For polymer preparation as in Ref. 4
Ketoprofen 100 mg/ml	Fort Dodge Animal Health	71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 rodent chow	LabDiet	5001
Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP	Hi-Tech Pharmacal	50383-824-16
Isoflurane, USP	Phoenix Pharmaceuticals	57319-507-06