Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op andere<em> In vivo</em> Modellen van menselijke ziekten.
In de kern bevinden de proteomen waarvan de functies zijn het meest nauw verbonden met de genregulatie. Volwassen zoogdier cardiomyocyte kernen zijn uniek vanwege het hoge percentage binucleaire cellen, de overwegend een heterochromatine toestand van het DNA en de niet-delende aard van de cardiomyocyt waarin volwassen kernen maakt in een permanente staat van interfase. Twee Transcriptionele regulatie tijdens de ontwikkeling en ziekte zijn goed bestudeerd in dit orgaan, 3-5 maar wat blijft relatief onontdekt is de rol van de nucleaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA verpakking en expressie, en hoe deze eiwitten veranderingen in transcriptie's die tijdens ziekte te bestrijden. 6 In de ontwikkelde wereld, hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen. 7 Inzicht in hoe nucleaire eiwitten samen te werken om de progressie van deze ziekte te reguleren is van cruciaal belang voor het bevorderen van de huidige behandeling oOPTIES.
Massaspectrometrie is de ideale tool voor het aanpakken van deze vragen omdat het zorgt voor een onpartijdige annotatie van de nucleaire proteoom en de relatieve kwantificatie voor de manier waarop de overvloed van deze eiwitten verandert met de ziekte. Hoewel er verschillende proteomics studies voor zoogdieren nucleaire eiwit-complexen, 8-13 tot voor kort 14 is er slechts een studie naar de cardiale nucleaire proteoom, en zij van mening was de hele kern, in plaats van het verkennen van het proteoom op het niveau van de nucleaire sub compartimenten 15. In groot deel is dit gebrek aan werk te wijten aan de moeilijkheid van het isoleren van cardiale kernen. Cardiac kernen optreden binnen een starre en dichte actine-myosine inrichting waaraan zij verbonden via meerdere verlengingen van het endoplasmatisch reticulum, voorzover myocyte contractie verandert bovendien hun algemene vorm. 16 cardiomyocyten zijn 40% mitochondria vol 17 die necessitates verrijking van de kern naast de andere organellen. Hier beschrijven we een protocol voor cardiale nucleaire verrijking en verdere fractionering in biologisch relevante compartimenten. Verder hebben we detail werkwijzen voor label-free kwantitatieve massaspectrometrische dissectie van deze fracties-technieken vatbaar voor in vivo experimenten in verschillende diermodellen en orgaansystemen waar metabolische labeling niet haalbaar.
Twee methoden voor nucleaire isolatie eerder zijn beoordeeld: 27 men de techniek van Behrens homogeniseren gelyofiliseerd weefsel in een niet-waterig oplosmiddel en de tweede een wijziging waarvan we hier homogeniseren van weefsel in een waterige sucrose / zoutoplossing gevolgd door differentiële of dichtheid-gradiënt centrifugatie.
Subfractionation van de kernen door zure extractie op weefselmonsters is een belangrijk instrument voor het bestuderen van chromatine die is sinds 1…
The authors have nothing to disclose.
De Vondriska lab wordt ondersteund door subsidies van de National Heart, Lung and Blood Institute van de NIH en de Laubisch Endowment aan de UCLA. EM is ontvanger van de Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship voor de Fysiologie aan de UCLA, HC is de ontvanger van een American Heart Association Pre-doctorale beurs, MP is de ontvanger van een NIH Ruth Kirschstein post-doctorale beurs, en SF is de ontvanger van een NIH K99 Award.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |