Framsteg inom masspektrometri har tillåtit hög genomströmning analys av proteinuttryck och modifiering i en mängd vävnader. Kombinerat med subcellulär fraktionering och modeller sjukdom, kvantitativ masspektrometri och bioinformatik kan avslöja nya egenskaper i biologiska system. Det häri beskrivna förfarandet analyserar kromatin-associerade proteiner i inställningen av hjärtsjukdomar och är lätt tillämpas på andra<em> In vivo</em> Modeller av mänsklig sjukdom.
I kärnan bor på proteom vars funktioner är mest intimt förknippade med genreglering. Vuxen däggdjur cardiomyocyte kärnor är unika på grund av den höga andelen binucleated celler, 1 den övervägande heterochromatic tillstånd DNA, och icke delande natur cardiomyocyte som gör vuxna kärnor i ett permanent tillstånd av interfas. 2 Transkriptionsreglering under utveckling och sjukdom har studerats i detta organ, 3-5, men det som återstår relativt outforskat är den roll som spelas av nukleära proteiner som är ansvariga för DNA-förpackning och uttryck och hur dessa proteiner kontrollerar förändringar i transkriptionella program som inträffar under sjukdom. I utvecklade 6 världen är hjärtsjukdom den vanligaste dödsorsaken för både män och kvinnor. 7 insikt om hur kärnproteiner samverkar för att reglera utvecklingen av denna sjukdom är avgörande för att föra den aktuella behandlingen o= Val.
Masspektrometri är det perfekta verktyget för ta itu med dessa frågor, eftersom det möjliggör en opartisk anteckning av kärn proteomet och relativa kvantifiering för hur överflöd av dessa proteiner förändras med sjukdom. Även om det har gjorts flera proteomik studier för däggdjur nukleära proteinkomplex, 8-13 tills nyligen 14 har det varit bara en studie för att undersöka hjärtats nukleära proteom, och det ansåg hela kärnan, snarare än att utforska proteomet i nivå med nukleära sub fack . 15 Till stor del är denna brist på arbete på grund av svårigheten att isolera hjärt kärnor. Hjärt kärnor sker inom en styv och tät aktin-myosin apparat som de är anslutna via flera förlängningar från det endoplasmatiska retiklet, i den utsträckning som myocyt kontraktion förändrar deras totala form. 16 Dessutom, kardiomyocyter är 40% mitokondrier volym 17 vilken necessitaTES anrikning av kärnan bortsett från de andra organeller. Här beskriver vi ett protokoll för hjärt anrika uran och ytterligare fraktionering i biologiskt relevanta delar. Dessutom har vi detalj metoder för märkning utan kvantitativa masspektrometrisk dissektion av dessa fraktioner-tekniker som lämpar sig för in vivo-experiment i olika djurmodeller och organsystem där metabolisk märkning inte är möjlig.
Två huvudsakliga metoder för kärn isolering har granskats tidigare: 27 en är Behrens teknik homogenisering lyofiliserat vävnad i ett icke-vattenhaltigt lösningsmedel och andra, en modifiering som vi använder här, homogenisering vävnad i en vattenbaserad sackaros / saltlösning följt genom differentiell eller densitet-centrifugering.
Subfraktionering av kärnorna genom syraextraktion på vävnadsprov är ett viktigt verktyg för att studera kromatin som har använts sedan…
The authors have nothing to disclose.
Den Vondriska Lab stöds av anslag från National Heart, Lung and Blood Institute av NIH och Laubisch Endowment vid UCLA. EM är mottagare av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi vid UCLA, HC är mottagare av ett American Heart Association doktorander Fellowship, MP är mottagare av en NIH Ruth Kirschstein postdoktorala stipendiet, och SF är mottagare av en NIH K99 Award.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |