Summary
生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。
Abstract
いくつかの天然に存在するプラスミドを、哺乳動物細胞内に保持されます。これらのうち、複数のヒト悪性腫瘍1-3引き起こすエプスタイン-バーウイルス（EBV）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）を含むガンマヘルペスウイルスのゲノムは、されています。これら二つのゲノムは単一のウイルス蛋白質と細胞複製機構を使用して、それぞれの、ライセンスされた方法で複製され、その欠けている伝統的なセントロメア4月8日にもかかわらず、細胞分裂の際に娘細胞に渡されます。
多くの仕事は、サザンブロッティングやin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inなどのメソッドを使用して、これらのプラスミドゲノムの複製を特徴付けるために行われている。これらの方法は、しかし、制限されています。定量PCRおよびサザンブロットは、細胞集団における細胞あたりのプラスミド数の平均値に関する情報を提供します。 FISHは平均数とプラスミドの分布の両方を明らかに単一セルアッセイであるの細胞あたりの細胞集団でなく調べセルの親や子孫の情報を全く許さない、静的なものである。
ここでは、生きた細胞内のプラスミドを可視化するための方法を説明します。このメソッドは、関心9のプラスミド内に複数のサイトへの蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質の結合に基づいています。目的とするDNAをラクトースオペレーター（LACO）配列の約250タンデムリピートを含むように設計されています。 LACOは、具体的に蛍光タンパク質に融合させることができるラクトースリプレッサータンパク質（LACI）によってバインドされています。融合タンパク質は、いずれかの人工プラスミドまたはレトロウイルスベクターにより導入されたから発現させることができる。このように、DNA分子は、蛍光標識、したがって、蛍光顕微鏡を介して、目に見えるようになるされています。プラスミドが閲覧できるようになるまで融合タンパク質は、IPTGの存在下で培養することによりプラスミドDNAを結合からブロックされています。
ontentは ">このシステムは簡単にトランスフェクションし、理想的な細胞が接着されています。それらの合成の特性を明らかにし、娘細胞に分割、プラスミドは数世代を通して生きた細胞で監視することができ、大規模な核を持っているこの技術はあることを決定するために使用されていますEBV由来プラスミドの84％は、HeLa細胞に娘細胞に忠実に、各世代を合成し、新たに合成されたプラスミドパーティションの88％されており、これらのEBVプラスミドのペアがでそれらの合成の後につながまたは姉妹染色分体に関連付けられていることが観察されたS-彼らは後期10で分離された姉妹染色分として分離するのを見たまで。メソッドは現在、HeLa細胞とSLK細胞におけるKSHVゲノムの複製を研究するために使用されています。HeLa細胞は、ヒト上皮細胞を不死化され、SLK細胞が内皮ヒト不死化している段階細胞。SLK細胞はもともとKSHVの病変に由来したものの、ヒーラもSLKのセルライン自然にハーブもORS KSHVゲノム11。ウイルス複製の勉強に加えて、この可視化技術は、合成、ローカリゼーション、および他の組換えプラスミドDNAのパーティション化に様々なDNA配列の要素の追加、削除、または変異の影響を調査するために使用することができます。Protocol
1。可視プラスミドを有する細胞のエンジニアリング
- 視覚化するプラスミドにラクトースオペレーター配列（LACO）の約250部を含むDNA断片を導入するために標準の制限酵素消化または相同組換え技術を使用しています。私たちのプラスミドは約170 kbpのバクミドだっおよびハイグロ12にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの全ゲノム（KSHV）とエンコードされた抵抗を含んでいた。
- リポフェクタミン2000を用いたトランスフェクションにより、哺乳動物細胞へLACO含有プラスミドDNAを導入。我々は、25μlのリポフェクタミン2000、0.5ミリリットルのOptiMEM、および3.5ミリリットルDMEMで精製プラスミドDNA10μgを4時間の場合は60 mmディッシュでHeLaおよびSLK細胞をトランスフェクションした。
- 10％ウシ胎児血清および48時間インキュベート細胞と5ミリリットルDMEMに培地を変更します。
- プレート導入ナンプラーための抗生物質の選択を含む培地中で大きな皿や培養細胞における低密度での細胞SMID、我々は3週間300μg/ mlのハイグロマイシンを10％ウシ胎児血清を含むDMEM中で細胞を選択した。
- 新しい培養皿にハイグロマイシン耐性コロニーを転送するために、滅菌したトリプシンに浸したろ紙の小片を使用しています。
- トランスフェクトされたクローンは皿を埋めるために成長しているときは、プラスミドLACOのポリマーが均一に、予想されたサイズのあることを確認するブロッティング、制限消化し、サザンのためにDNAを単離する。
- プラスミドはlacIの融合を発現するように設計されていない場合は、そのようなLacIリ-tdTomatoとして赤色蛍光タンパク質と融合ラクトースリプレッサー（LACI）をコードするレトロウイルスを適切なクローンを感染させる。我々はtdTomatoはなく長い時間13を介して複数のエクスポージャーから生じるであろうphotoxicityを最小限にするために緑色に近い蛍光を発するタンパク質を使用しています。
- バインディングからの融合タンパク質をブロックするように200μg/ mlのイソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG）の存在下でLacIリ融合タンパク質が導入されると、細胞培養DNA。
- 文化少なくとも3日間の細胞は、lacI-tdTomatoタンパク質の発現を可能にする。
- バインドされていない融合タンパク質の最小限のバックグラウンドレベルとの明確なシグナルを明らかLacIリ-tdTomatoの最適レベルとのそれらのためのスクリーンのクローン（IPTGを洗い流し、下記のようにセルを表示することによって）。
2。イメージングシステムの開発
当社のイメージング·システムは、電動ステージと計画Aochromat 63x/1.4油浸対物装備ZEISS AXIOVERT 200Mで構成されています。蛍光励起光がコリブリシステムのLEDが "昼白色"によって提供されています。 1024 EMCCDカメラ：発光がCascadeIIによって検出されます。これは、信号を増幅するゲイン·レジスタを用いて冷却、裏面入射型カメラです。暗電流は、毎秒画素あたり0.061電子であり、量子効率は0.90より大きい。システムはSmartExperimentsモジュールを含む、AxioVisionの4.8ソフトウェアによって制御されます。 tdTomaの検出のための我々はそのために通過した光の85％が蛍光と放出された光の95％を励起することができるツァイスフィルターセット75HEを使用すると、発光フィルターを通過します。
- 複数の長い時間間隔で連続して画像の自動取得のために敏感な信号の検出、特定の励起と高速シャッター、電動ステージとフォーカスアーム用LED光源、およびソフトウェア制御用倒立顕微鏡とEMCCDカメラとイメージングシステムを組み立てるZ-スタック。システムは、振動から隔離される空気テーブルの上に座ってください。
- 37℃、加湿チャンバー内の5〜10％のCO 2で細胞を維持するために、ステージトップインキュベーターを組み立てる。実験中に動きのアーチファクトを最小限に抑えるために安定した温度に来るシステムのための十分な時間を確保します。
- サンプルから熱を吸い上げるから客観を防ぐために客観的なため、加熱されたカラーを使用しています。
3。標識されたDNAの可視化
- 35ミリメートルの板細胞セルのペアが重ならずに8月16日細胞のコロニーに分割することができます10％未満の合流点の密度でガラスボトムディッシュ、。生存細胞が分裂する時間を持つようにイメージを作成する前に、この少なくとも24〜48時間を行う。
- 撮影開始前に1〜3時間、選択的薬剤およびIPTG両方を欠いている培地でプレートを3回すすいでください。この手順では、離れて、非生存細胞を洗浄およびlacI融合タンパク質はプラスミド中LACOサイトをバインドすることができます。
- 10％ウシ胎児血清および25mM HEPESで2ミリリットルDMEMで培養液を交換してください。
- 35mmディッシュ用取付リングに延伸CultFoilと培養皿の上部を元に戻します。このカバーは、時間をかけて塩濃度を増加させ、細胞を殺す培地の蒸発を抑制します。
- セルを表示し、ビューの複数のフィールド内のセルの上部と下部の焦点面を決定する微分干渉コントラスト（DIC）のイメージングを使用しています。各フィールドで、セルの上部から焦点面に道の約1/3を下に移動します。 x、yを保存し、zが保存されてステージ位置のリストに座標。
注：プラスミド信号は細胞があるlacI融合タンパク質を適切な波長のLEDによって照らされる接眼レンズを介して表示されない場合があります。弱い信号だけ時間をかけて信号の統合を可能にし、したがって効果的に弱い信号を増幅EMCCDカメラの使用、と見えるかもしれません。 - 顕微鏡制御ソフトウェアでは、保存された各ステージの位置で実行される画像のzスタックを定義します。 z次元14に近似ナイキスト·サンプリングにあなたをできるようになります0.35から0.50μmのAZのステップサイズを選択してください。細胞周期の間の細胞の動きに従い、これらのスライスは、検出を可能にし、また画像スタックの取得後の処理（デコンボリューション）で使用され、細胞が置かれている面の上下に "余分な"スライスが含まれています。この包含は意志セルの厚さに応じて、40から60までの画像をスタックにつながる。
- 顕微鏡制御ソフトウェアでは、（プラスミドを可視化するための10から60分間隔で30分間隔（長時間にわたって細胞分裂および移行を追跡するため）と蛍光画像でZ-スタックの明視野像を収集するために、時系列の実験を定義細胞内で）。それは長い間実験の過程で光毒性を不必要に細胞を公開することができます標準の明視野像、より多くの光を必要とするため、実験中にDICのイメージングを使用しないでください。
- ソフトウェア制御の実験を開始します。システムが妨害されないことを確認します（等、過剰な室内光にさらされ、バンプ）実験中。
- 必要に応じて、実験中に加湿システムで水を補給してください。
4。画像の取得後の処理
- 各zスタックと時間ポイントの画像を確認してください。の不要な領域を切り抜く次のステップでコンピュータの処理時間を短縮するための画像。
- 各zスタック15で原点の画素に信号強度を再割り当てするにはデコンボリューションアルゴリズムを使用します。このデコンボリューションは、イメージングシステムのための理論的な点広がり関数に基づくことができますが、それは、イメージング蛍光ミクロスフェアによる特定のシステムの点広がり関数を測定し、デコンボリューションアルゴリズムでは、この測定値を使用することが好ましい。私たちは、イメージングシステムの点広がり関数を測定し、適用AxioVisionのソフトウェア（AxioVisionのソフトウェアの説明、ツァイス）の最尤反復アルゴリズムを拘束されています。
- 細胞周期と娘細胞へのプラスミドのパーティションの分割中にプラスミドの強度変化と動きを追跡するために画像を調べます。
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Representative Results
代表的な実験で取得したZ-スタックの最大強度の予測を図3に示します。典型的なプラスミド信号は、単一またはプラスミドのクラスタを表しているかどうかに応じてzスタックの3-8スライスに存在しています。細胞が分裂期に達するまでのEBVおよびKSHV由来プラスミドの場合、信号が細胞内でゆっくりと移動します。細胞自体は、実験のコースを上に移行されます。彼らはまた、球状になり、有糸分裂の間に皿から切り離す。健康HeLaおよびSLK細胞の細胞周期は約24時間かかります。細胞周期を完了するには30以上の時間がかかるこれらの種類の細胞が正常でないと判断されるべきである。娘細胞は、通常、互いに近くに添付し、次の細胞周期で同時に分割するために行く。細胞周期を完了することを示すことができる唯一の細胞を分析する必要があります。
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図1のプラスミドが見えるようにするためのスキーム。 （A）は、ラクトースオペレーター配列（LACO）のタンデムリピートが目的のプラスミドにクローニングされています。ラクトースリプレッサータンパク質（LacIは）これらの配列に特異的に結合し、蛍光タンパク質との融合は、関心のプラスミドに蛍光タグを募集しています。 （BとC）LacIリ-tdTomatoを発現するHeLa細胞の核には、蛍光核に局在する融合タンパク質の核局在化シグナルによるものです。 LacIリ - 蛍光タンパク質がでその認識LACO配列に結合することを防止している間LACO配列をコードするKSHVゲノムは、蛍光タンパク質の多くのコピーを募集し、IPTG（B）の非存在下における核のバックグラウンド強度の上に明るい信号として目立つIPTGの存在下（C）である。これらの画像は計算的に異なる信号が存在する複数のz-平面を含むように作られています。
図2プラスミド可視化手順の図。まず、タンデムLACOが繰り返さ目的のプラスミドにクローニングされています。そのプラスミドをトランスフェクションによって細胞に導入する。トランスフェクトされた細胞のクローンを選択し、スクリーニングした後、蛍光のlacI融合タンパク質を発現するレトロウイルスに感染している。
図3：細胞周期を通してプラスミドを追跡するために画像を確認してください。 HeLa細胞（）で蛍光標識ウイルスゲノムは、S相（B）で合成され、細胞分裂の際に娘細胞に分配（CE）、および複数世代にわたって続くことができています。代表的な実験では5の時点でHeLa細胞周期の取得したZ-スタックの最大強度の予測も表示され。これらのイメージは、 図1BとCのように作られています。
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Discussion
ここで説明する方法は、複数の世代にまたがる時間をかけて生きた哺乳動物細胞におけるプラスミドをフォローするために使用できます。励起光への曝露を制限することによって、我々は、少なくとも72時間、3細胞分裂を表す16から32細胞のコロニーを通って新しく分割ペアからセルをフォローするために、これらの技術を使用している。これらの実験は、このような定量的PCR、サザンブロッティング、魚のような静的なアッセイから得られない情報を提供します。
このようなタンデムLACO繰り返されるような反復配列を有するプラスミドを使用するときに転位が発生する可能性があるとして、それは、均質な構造を持つプラスミドの細胞のクローンをスクリーニングすることが不可欠である。また、最適な信号強度のために感染した細胞のレトロウイルス感染と画面クローンを最適化することが有用である。あまりにも多くのLacIタンパク質を発現する細胞は、核内に高いバックグラウンド蛍光を持つことになり、あまりにも少し発現するものでは弱い信号を持つことになります。最後に、私はsは、重要な細胞の形態を見て、その可視化時に使用するビューのフィールドをマーキングする際に健康な細胞を選択することができます。
この技術は、ほぼすべてのDNA分子を可視化するために使用することができ、それはLACO配列のタンデムリピートを含むように操作することができます提供しました。例としては、細胞の染色体は、天然および人工のプラスミド、およびビリオン内にパッケージ化されたウイルスゲノムを含む。 図3に示したものと同様の実験では、我々はKSHV由来のプラスミドは、細胞分裂時にランダムに分割されるように見えることがわかった。技術の論理的な拡張は、1蛍光タンパク質でLACO / LacIリペアとして1 DNA分子をタグ付けすることであり、別の蛍光タンパク質とテトラサイクリンオペレーター/リプレッサーTetetracyclineペアと同じセル内の別のDNA分子。実験は、細胞が細胞傷害性効果を体験する前に耐えることができ、励起光の量によって制限されています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIHとACS、T32CA009135含む、CA133027、CA070723、およびCA022443からの補助金によって賄われていた。ビルサグデンは、アメリカ癌協会の研究教授である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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