Summary
En metod att observera individuella DNA-molekyler i levande celler beskrivs. Tekniken är baserad på bindningen av en fluorescent märkt lac-repressor-protein till bindningsställen manipulerade i DNA av intresse. Denna metod kan anpassas att följa många rekombinanta DNA i levande celler över tiden.
Abstract
Några naturligt förekommande plasmider upprätthålls i däggdjursceller. Bland dessa är genomen hos gamma-herpesvirus, inklusive Epstein-Barr-virus (EBV) och Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV), som orsakar multipla humana maligniteter 1-3. Dessa två genomen replikeras på en licensierad sätt, var och en med en enda viralt protein och cellulär replikering maskiner och skickas till dotterceller under celldelning trots deras saknar traditionella centromerer 4-8.
Mycket arbete har gjorts för att karakterisera replikationer av dessa plasmid genomen med metoder som Southern blotting och fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa metoder är begränsade, dock. Kvantitativ PCR och Southern blöts ger information om det genomsnittliga antalet plasmider per cell i en population av celler. FISH är en enkel-cellanalys som avslöjar både det genomsnittliga antalet och fördelningen av plasmiden s per cell i populationen av celler men är statisk, så ingen information om förälder eller avkomma av den undersökta cellen.
Här beskriver vi en metod för att visualisera plasmider i levande celler. Denna metod är baserad på bindningen av en fluorescent märkt laktosrepressorproteinet till flera ställen i plasmiden av intresse 9. DNA: t av intresse är konstruerad för att omfatta cirka 250 tandemupprepningar av laktos operatören (LACO) sekvens. LACO specifikt bunden av laktosrepressorproteinet (LACI), som kan smältas till ett fluorescerande protein. Fusionsproteinet kan antingen uttryckas från den manipulerade plasmiden eller introduceras genom en retroviral vektor. På detta sätt, är DNA-molekyler taggade fluorescent och därmed bli synlig via fluorescensmikroskopi. Fusionsproteinet är blockerad från att binda plasmid-DNA genom odling av celler i närvaro av IPTG tills plasmiderna är redo att ses.
ontent "> Detta system tillåter plasmiderna som skall övervakas i levande celler genom flera generationer, avslöjar egenskaper hos deras syntes och uppdelning till dottercellerna. Ideala celler är vidhäftande, lätt transfekterade, och har stora kärnor. Denna teknik har använts för att fastställa att 84% av EBV-härledda plasmider syntetiseras varje generation och 88% av den nysyntetiserade plasmiderna partitionen troget till dotterceller i HeLa-celler. Par av dessa EBV plasmider sågs vara bundna till eller associeras med systerkromatider efter deras syntes i S- fas tills de ansågs att separera som systerkromatider separerade i Anafasa 10. Metoden används för närvarande för att studera replikering av KSHV genomet i HeLa-celler och celler SLK. immortaliseras humana epitelceller, och SLK celler immortaliserade HeLa-celler human endotel celler. Även SLK celler ursprungligen härstammar från en KSHV lesion, varken HeLa eller SLK cellinje Harb naturligtOrs KSHV genomen 11. Förutom att studera virusreplikation, kan denna visualisering teknik användas för att undersöka effekterna av tillägg, borttagning eller mutation av olika element DNA sekvens på syntes, lokalisering och fördelning av andra rekombinanta plasmid-DNA.Protocol
1. Teknik av celler med synliga plasmider
- Använd standard restriktionsdigerering eller homologa tekniker rekombination att införa ett DNA-fragment som innehöll cirka 250 kopior av laktos operatorsekvensen (LACO) i plasmiden att vara visualiseras. Vår plasmid var en bacmid av ca 170 kbp och innehöll hela genomet av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV) och kodade resistens mot hygromycin 12.
- Införa LACO-innehållande plasmid-DNA in i däggdjursceller genom transfektion med Lipofektamin 2000. Vi transfekterade HeLa och SLK celler i 60 mm skålar för 4 timmar med 10 ng renad plasmid-DNA med 25 | il Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, och 3,5 ml DMEM.
- Ändra odlingsmediet till 5 ml DMEM med 10% fetalt bovint serum och inkubera celler under 48 timmar.
- Plate cellerna vid låg densitet i stora rätter och celler kultur i medium innehållande ett antibiotikum val för den införda plaSmid, vi valt celler i DMEM med 10% fetalt bovint serum med 300 ng / ml hygromycin under 3 veckor.
- Använd bitar av sterilt, trypsin-dränkts filterpapper för att överföra hygromycinresistenta kolonier till nya odlingsskålar.
- När transfekterade kloner har vuxit att fylla skålen, isolera DNA för restriktionsklyvning och Southern blotting för att säkerställa att polymeren av LACO plasmiden är homogen och av den förväntade storleken.
- Om plasmiden inte har konstruerats för att uttrycka en fusion av LACI, infektera lämpliga kloner med ett retrovirus som kodar för repressorn laktos (LACI) fuserad till en röd fluorescerande protein, såsom Lacl-tdTomato. Vi använder tdTomato stället proteiner som fluorescerar närmare grönt för att minimera photoxicity som skulle uppstå från flera exponeringar över långa tider 13.
- När Lacl fusionsproteinet införs cellerna odling i närvaro av 200 pg / ml isopropyl-BD-tiogalaktosid (IPTG) för att blockera fusionsproteinerna från bindningDNA.
- Odla cellerna i minst 3 dagar för att tillåta uttryck av LACI-tdTomato protein.
- Screena kloner (genom att tvätta bort IPTG och visning celler såsom beskrivits nedan) för dem med optimala nivåer av Lacl-tdTomato som avslöjar distinkta signaler med minimala bakgrundsnivåer av obundet fusionsprotein.
2. Utveckling av Imaging System
Vårt avbildning består av en Zeiss Axiovert 200M försedd med en motoriserad scen och Plan-Aochromat 63x/1.4 olja mål. Fluorescensexcitation ljus ges av "neutralt vitt" LED av ett Colibri-system. Emission detekteras av en CascadeII: 1024 EMCCD kamera. Detta är en kyld, back-förtunnad kamera med en vinst register för förstärkning av signaler, den mörka strömmen 0,061 elektroner per pixel per sekund, och kvantverkningsgraden är större än 0,90. Systemet styrs av AxioVision 4,8 programvaran, inklusive SmartExperiments modulen. För detektering av tdTomatill att vi använder en Zeiss filter set 75HE som 85% av den passerade ljuset kan excitera fluor och 95% av det emitterade ljuset kommer att passera utsläppen filtret.
- Montera ett avbildningssystem med ett inverterat mikroskop och en EMCCD kamera för känslig detektion av signaler, en LED-ljuskälla för excitering specifik och snabb formsättning, ett motoriserat steg och fokus arm och programvara kontroll för automatiska förvärv av bilder över långa tidsintervall med flera z-stackar. Systemet bör sitta på en luft tabellen isoleras från vibrationer.
- Montera en steg-topp inkubator för att hålla cellerna vid 37 ° C, 5-10% CO 2 i en fuktad kammare. Tillräckligt med tid för systemet att komma till en stabil temperatur för att minimera rörelse artefakter under experimentet.
- Använd en uppvärmd krage för målet att förhindra att målet från hävert värme från provet.
3. Visualisering av märkt DNA
- Plate celler i en 35 mmglasbotten skålen vid en densitet av mindre än 10% konfluens, som kommer att tillåta par av celler att dela in kolonier av 8-16 celler utan överlappning. Gör detta minst 24-48 timmar före avbildning så att de livsdugliga celler hinner dela.
- En till tre timmar före starten av avbildning, skölj plattan 3 gånger med odlingsmedium som saknar både selektiva läkemedel och IPTG. Detta förfarande tvättar bort icke-viabla celler och tillåter LACI fusionsproteiner att binda LACO platser i plasmiderna.
- Byt odlingsmediet med 2 ml DMEM med 10% fetalt bovint serum och 25 mM HEPES.
- Ersätt toppen av odlingsskålen med CultFoil sträcktes i en monteringsring för 35 mm skål. Detta lock kommer att hämma avdunstningen av odlingsmediet, vilket skulle öka saltkoncentrationen över tiden och döda cellerna.
- Använd differential interferens kontrast (DIC) avbildning för att visa cellerna och bestämma fokalplan toppen och botten av cellerna i flera synfält.I varje fält, flytta till ett fokalplan ca 1/3 av vägen ner från toppen av cellen. Spara x, y, samordnar z i listan över sparade steg positioner.
Obs: Plasmid signalerna kanske inte vara synliga genom okularen när celler belyses av lysdioder av våglängden lämplig för Lacl fusionsproteinet. Svaga signaler kan endast vara synliga med användning av EMCCD kamera, vilket möjliggör integration av signalen över tiden och sålunda effektivt förstärker svaga signaler. - I mikroskop styrprogram, definierar en z-stapel av bilder som ska utföras vid varje sparad steg läge. Välj az stegstorleken 0,35-0,50 um, vilket gör att du kan närma Nyquist provtagning i z-dimensionen 14. Inkludera "extra" segment ovanför och nedanför de plan i vilka cellerna belägen, dessa skivor tillåter detektion efter cell rörelser under cellcykeln, och används också i efter förvärvet bearbetning (dekonvolution) i bildstaplar. Denna integration kommerresultera i en stapel av 40-60 bilder, beroende på tjockleken av cellerna.
- I mikroskop styrprogram, definierar en experiment tidsserie att samla en ljus fält bild av z-stackar med 30 minuters intervaller (för att spåra celldelningar och migrationer över långa tider) och fluorescensbilder vid 10-60 min intervaller (för visualisering plasmider inom celler). Använd inte DIC avbildning under experimentet, eftersom det kräver mer ljus än standard ljusfält avbildning, vilket kan exponera cellerna onödan fototoxicitet under loppet av långa experiment.
- Starta programmet kontrollerade experiment. Se till att systemet inte störs (stötte, utsatts för överdriven rumsljus etc.) under experimentet.
- Om nödvändigt, fylla på vatten i fuktsystem under experimentet.
4. Efter förvärvet Bearbetning av bilder
- Granska bilder för varje z-stack och tidpunkt. Beskära ut några onödiga områdenbilderna att minska tiden databehandling i nästa steg.
- Använd en avfaltning algoritm för att åter tilldela signalintensitet till pixeln ursprung i varje z-stack 15. Även om detta avfaltning kan baseras på en teoretisk punktspridningsfunktion för avbildning, är det att föredra att mäta funktionen punkten spridningen av ditt system genom avbildning fluorescerande mikrosfärer, och använda denna mätning i avfaltning algoritmen. Vi mätte funktion punkten spridningen av vårt bildsystem och tillämpat en begränsad iterativ algoritm maximal sannolikhet i AxioVision programvara (AxioVision programvara beskrivning, Zeiss).
- Undersök bilderna för att spåra intensitet förändringar och rörelser plasmider under cellcykeln och avskärmning av plasmider till dotter celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Maximal intensitet projektioner av z-stackar som förvärvats i ett representativt experiment visas i figur 3. Typiska plasmid signaler närvarande i 3-8 skivor av z-stacken, beroende på om de representerar en eller kluster av plasmider. I fallet av EBV-och KSHV-härledda plasmider, signalerna rör sig långsamt i cellen tills cellen når mitos. Cellerna själva migrera under loppet av experimentet. De blir också sfärisk och lossa från skålen under mitos. Cellcykeln för friska HeLa och SLK celler tar cirka 24 timmar, celler av dessa typer som tar mer än 30 timmar att slutföra cellcykeln bör betraktas ohälsosamt. Dotterceller fäster vanligtvis nära varandra och gå på att dela på samma gång i nästa cellcykeln. Endast celler som kan visas för att slutföra en cellcykel bör analyseras.
05/4305fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. System för att plasmider synliga. (A) tandemupprepningar av den laktos operatorsekvensen (LACO) klonas in i plasmiden av intresse. Den laktosrepressorproteinet (LACI) binder specifikt till dessa sekvenser, fusion till ett fluorescerande protein rekryterar den fluorescerande taggen till plasmiden av intresse. (B och C) Kärnan i en HeLa-cell som uttrycker Lacl-tdTomato är fluorescerande på grund av den nukleära lokaliseringssignalen på fusionsproteinet lokalisera den till kärnan. KSHV genomen kodar LACO sekvenser rekrytera många kopior av det fluorescerande proteinet och sticker ut som ljusa signaler över bakgrunden intensiteten av kärnan i frånvaro av IPTG (B), medan de LACI-fluorescerande proteiner förhindras att binda till dess erkännande LACO sekvens i närvaro av IPTG (C). Dessa bilder görs beräkningsmässigt att inkludera flera z-plan i vilka de olika signalerna bor.
Figur 2. Diagram över plasmiden visualisering förfarandet. Först, är tandem LACO upprepningar klonas i plasmiden av intresse. Att plasmiden införes i celler genom transfektion. Kloner av transfekterade celler selekteras och screenas, och infekterades sedan med ett retrovirus som uttrycker en fluorescerande Lacl fusionsprotein.
Figur 3. Granska bilder för att spåra plasmider hela cellcykeln. Fluorescerande taggade virusgenom i en HeLa-cell (A) syntetiseras i S-fasen (B) och fördelades till dotterceller vid celldelning (CE) och kan följas för flera generationer. Här visas maximal intensitet projektioner av z-stackar förvärvats av en HeLa cellcykeln vid fem tidpunkter i ett representativt experiment. Dessa bilder är gjorda såsom i figur 1B och C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs här kan användas för att följa plasmider i levande däggdjursceller över tiden över flera generationer. Genom att begränsa exponeringen för excitationsljus, har vi använt dessa tekniker för att följa celler från nyligen delade par genom kolonier av 16-32 celler, som representerar minst 72 timmar och 3 divisioner cell. Dessa experiment ger information som inte kan erhållas från statiska analyser såsom kvantitativ PCR, Southern blotting och fisk.
Det är viktigt att screena kloner av celler för plasmider med en homogen struktur, eftersom omflyttningar kan inträffa vid användning av plasmider med repetitiva sekvenser såsom tandem LACO upprepningar. Dessutom, är det lämpligt att optimera retrovirusinfektion och kloner skärm av infekterade celler för en optimal signalintensitet. Celler som uttrycker för mycket Lacl-protein kommer att ha hög bakgrundsfluorescens i kärnan, och de uttrycker för lite kommer att ha svaga signaler. Slutligen, jag detär viktigt att titta på cellmorfologi och välj friska celler vid märkning synfält att använda under sin visualisering.
Denna teknik kan användas för att visualisera nästan alla DNA-molekyl, förutsatt att den kan konstrueras för att inkludera tandemupprepningar av LACO sekvensen. Exempel på cellulära kromosomer, naturligt förekommande och konstgjorda plasmider och virala genom paketerade i virioner. I experiment liknande det som visas i figur 3, fann vi att våra KSHV-härledda plasmider förefaller att partitionera slumpmässigt under celldelning. En logisk förlängning av tekniken är att märka en DNA-molekyl som LACO / Lacl par med en fluorescerande proteinet, och en annan DNA-molekyl i samma cell som en Tetracyklin Operatör / Tetetracycline repressor par med en annan fluorescerande protein. Experiment begränsas av mängden excitationsljus cellerna kan motstå innan upplever cytotoxiska effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av bidrag från NIH och ACS, däribland T32CA009135, CA133027, CA070723 och CA022443. Bill Sugden är en American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
