Summary
Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.
Abstract
Einige natürlich vorkommende Plasmide in Säuger-Zellen aufrechterhalten. Unter diesen sind Genomen von Gamma-Herpesviren, einschließlich Epstein-Barr-Virus (EBV) und Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV), die mehrere menschlichen Malignitäten 1-3 verursachen. Diese beiden Genomen sind in einem lizenzierten Weise jede Verwendung eines einzigen viralen Proteins und zellulären Replikationsmaschinerie repliziert und an Tochterzellen weitergegeben während der Zellteilung trotz ihrer fehlenden traditionellen Centromeren 4-8.
Viel Arbeit wurde getan, um die Wiederholungen dieser Plasmid Genome Charakterisierung mit Methoden wie Southern-Blot-und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Methoden sind beschränkt, though. Quantitative PCR und Southern-Blots geben Auskunft über die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Zelle in einer Population von Zellen. FISH ist ein Single-Zell-Assay, der sowohl die durchschnittliche Anzahl und die Verteilung von Plasmid enthüllt s pro Zelle in der Population von Zellen, jedoch statisch ist, so dass keine Informationen über die Eltern oder Nachkommen des untersuchten Zelle.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von Plasmiden in lebenden Zellen. Dieses Verfahren basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Lactose Repressorproteins an mehrere Stellen des Plasmids von Interesse 9 basiert. Die DNA von Interesse wird ausgeführt, um etwa 250 Tandemwiederholungen des Lactose-Operator (LacO)-Sequenz umfassen. LacO speziell vom Lactose-Repressor-Protein (LacI), die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden kann, gebunden. Das Fusionsprotein kann entweder aus dem konstruierten Plasmids oder eingeführt durch einen retroviralen Vektor exprimiert werden. Auf diese Weise werden die DNA-Moleküle fluoreszierend markierten und damit sichtbar werden über Fluoreszenzmikroskopie. Das Fusionsprotein wird die Bindung der Plasmid-DNA durch Kultivieren von Zellen in der Gegenwart von IPTG blockiert, bis die Plasmide bereit, zu betrachten sind.
nhalt "> Dieses System ermöglicht die Plasmide in lebenden Zellen über mehrere Generationen, offenbart Eigenschaften ihrer Synthese und Partitionierung Tochterzellen überwacht werden. Ideal Zellen haftende, leicht transfiziert und haben große Kerne. Diese Technik wurde verwendet, um festzustellen, dass 84% der EBV-abgeleitete Plasmide jede Generation synthetisiert und 88% des neu synthetisierten Plasmide Partition getreu Tochterzellen in HeLa-Zellen. Paare dieser EBV Plasmide wurden als zu angebunden werden oder damit verbunden Schwesterchromatiden nach ihrer Synthese in der S- Phase bis sie gesehen wurden, wie die Schwesterchromatiden in Anaphase 10 getrennt voneinander zu trennen. Die Methode wird derzeit verwendet, um die Replikation von KSHV Genome in HeLa-Zellen und SLK Zellen zu untersuchen. HeLa-Zellen werden immortalisierten humanen Epithelzellen und SLK Zellen immortalisierten humanen Endothelzellen Zellen. Obwohl SLK Zellen wurden ursprünglich aus einem KSHV Läsion abgeleitet, weder die HeLa noch SLK Zelllinie natürlich harbors KSHV Genome 11. Neben dem Studium Virusreplikation kann diese Visualisierungstechnik verwendet, um die Wirkungen der Zugabe, Entfernen oder Mutation der DNA-Sequenz verschiedenen Elemente auf Synthesegas-, Lokalisierungs-und Partitionierung von anderen rekombinanten Plasmid-DNAs zu untersuchen.Protocol
Ein. Engineering von Zellen mit Visible Plasmide
- Verwenden Standard Restriktionsverdau oder homologe Rekombination Techniken, um eine DNA-Fragment, das etwa 250 Kopien des Lactose-Operatorsequenz (lacO) in das Plasmid zu visualisierenden einzuführen. Unsere Plasmid war ein Bacmid von etwa 170 kbp und enthalten das gesamte Genom des Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV) und kodierte Resistenz gegen Hygromycin 12.
- Einführen LacO enthaltenden Plasmid-DNA in Säugetierzellen durch Transfektion mit Lipofectamin 2000. Wir transfizierten HeLa-Zellen und SLK in 60 mm-Schalen für 4 h mit 10 ug gereinigten Plasmid-DNA mit 25 ul Lipofectamin 2000, 0,5 ml OptiMEM, und 3,5 ml DMEM.
- Ändern des Kulturmediums zu 5 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und inkubieren Zellen für 48 Stunden.
- Platte die Zellen bei geringer Dichte in großen Gerichten und Kultivierung von Zellen in einem Medium mit einer Antibiotika-Selektion für die Einführung plasmid, wir ausgewählten Zellen in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum mit 300 ug / ml Hygromycin für 3 Wochen.
- Verwenden Stück sterile, Trypsin-getränkten Filterpapier Hygromycin-resistente Kolonien auf neue Kulturschalen übertragen.
- Wenn transfizierten Klone wurden gezüchtet, um den Teller zu füllen, Isolieren DNA für Restriktionsverdau und Southern Blotting, um sicherzustellen, dass das Polymer der LacO Plasmid homogen ist und der erwarteten Größe.
- Wird das Plasmid wurde nicht ausgeführt, um eine Verschmelzung von LacI exprimieren, infizieren geeignete Klone mit einem Retrovirus Codieren des Lactose-Repressor (lacI), fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wie LacI-tdTomato. Wir verwenden tdTomato anstatt Proteine, die näher an grün zu photoxicity, die aus mehreren Belichtungen über lange Zeiten 13 auftreten würden, zu minimieren fluoreszieren.
- Sobald das LacI Fusionsprotein eingeführt wird, die Zellen Kultur in Gegenwart von 200 ug / ml Isopropyl-bD-Thiogalactosid (IPTG), um die Fusionsproteine aus Bindung zu blockierenDNA.
- Kultur wurden die Zellen für mindestens 3 Tage, damit Ausdruck der LacI-tdTomato Protein.
- Bildschirm Klone (durch Wegwaschen der IPTG und Anzeigen Zellen wie nachstehend beschrieben) für die mit optimalen Mengen an LacI-tdTomato, die unterschiedliche Signale mit minimaler offenbaren Hintergrundwerte von ungebundenen Fusionsproteins.
2. Entwicklung der Imaging System
Unsere Imaging-System besteht aus einem Zeiss Axiovert 200M mit einem motorisierten Bühne und Plan-Aochromat 63x/1.4 Öl-Objektiv ausgestattet. Fluoreszenzanregungslichtquelle wird durch die "neutral white" eines Colibri System-LED zur Verfügung gestellt. Emission wird von einem CascadeII erkannt: 1024 EMCCD Kamera. Dies ist ein gekühlter, Back-ausgedünnt Kamera mit einer Verstärkung zum Verstärken von Signalen Register; der Dunkelstrom 0,061 Elektronen pro Pixel pro Sekunde, und die Quantenausbeute größer als 0,90 ist. Das System wird durch Software gesteuert Axiovision 4,8, einschließlich der SmartExperiments Modul. Zur Detektion von tdTomazu verwenden wir eine Zeiss Filtersatz 75HE, für die 85% der übergebenen Licht kann die Fluor und 95% des emittierten Lichts zu erregen passieren die Emissions-Filter.
- Montieren eines Bildgebungssystems mit einem invertierten Mikroskop und einer EMCCD Kamera zum empfindlichen Nachweis von Signalen, eine LED-Lichtquelle für spezifische Anregungs und schnelle Schalung einer motorisierten Tisch und Fokus Arm und Software-Steuerung für automatisierte Akquisitionen von Bildern über lange Zeitintervalle mit mehrfachen z-Stacks. Das System sollte auf einem Lufttisch von Vibrationen isoliert werden sitzen.
- Montieren Sie eine Bühne-top Inkubator Zellen bei 37 ° C, 5-10% CO 2 in einer feuchten Kammer halten. Genügend Zeit für das System auf eine stabile Temperatur kommen, um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren.
- Verwenden Sie einen beheizten Kragen für das Ziel, das Ziel von Absaugen von Wärme aus der Probe zu verhindern.
3. Visualisierung markierter DNA
- Platte Zellen in einer 35 mmGlasboden Schale bei einer Dichte von weniger als 10% Konfluenz, die Paare von Zellen erlauben, in Kolonien von 8-16 Zellen ohne Überlappung unterteilen wird. Tun Sie dies mindestens 24-48 Stunden vor der Belichtung, so dass die lebensfähigen Zellen Zeit zu teilen haben.
- Ein bis drei Stunden vor dem Beginn der Bildgebung, Spülen Sie die Platte 3 mal mit Kulturmedium, das sowohl selektive Drogen und IPTG fehlt. Dieses Verfahren wäscht nicht lebensfähigen Zellen und ermöglicht LacI Fusionsproteine LacO Plattformen mit den Plasmiden binden.
- Ersetzen des Kulturmediums mit 2 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 25 mM HEPES.
- Ersetzen Sie den oberen Teil der Kulturschale mit CultFoil gestreckt in einem Befestigungsring für einen 35-mm-Schale. Diese Abdeckung wird inhibieren Verdampfen des Kulturmediums, die Salzkonzentration über die Zeit erhöhen würde und tötet die Zellen.
- Verwenden differenziellen Interferenz (DIC)-Bildgebung, die Zellen anzeigen und bestimmen die Brennebene der Ober-und Unterseite der Zellen in mehreren Sichtfelder.In jedem Feld auf eine Brennebene zu bewegen etwa 1/3 des Weges nach unten von der Oberseite der Zelle. Speichern Sie die x, y, z-Koordinaten in der Liste der gespeicherten Bühne Positionen.
Anmerkung: Das Plasmid Signale möglicherweise nicht durch die Okulare, wenn Zellen durch LEDs der Wellenlänge geeignet für die LacI Fusionsprotein beleuchtet werden sichtbar. Schwache Signale können nur sichtbar mit der Verwendung des EMCCD Kamera, die Integration ermöglicht des Signals über die Zeit und damit wirkungsvoll verstärkt schwache Signale. - Im Mikroskop Steuerungssoftware, definieren eine Z-Stapel von Bildern, um an jeder Stufe gespeicherten Position durchgeführt werden. Wählen az Schrittweite von 0,35-0,50 um, die Sie zur Angleichung Nyquist in z-Richtung 14 ermöglicht. Include "extra" Scheiben oberhalb und unterhalb der Ebenen, in denen die Zellen befinden; diese Scheiben erlauben, den folgenden Zellbewegungen während des Zellzyklus und werden auch in der Post-Akquisition-Verarbeitung (Dekonvolution) der Bildstapel verwendet. Diese Einbeziehung wirdführen in einem Stapel von 40 bis 60 Bilder je nach der Dicke der Zellen.
- Im Mikroskop Steuerungssoftware, definieren eine Zeitreihe Experiment ein Hellfeldbild des z-Stacks bei 30 min-Intervallen (zum Verfolgen Zellteilungen und Migrationen über lange Zeiten) und Fluoreszenzbilder bei 10-60 min Intervallen sammeln (zur Visualisierung Plasmiden innerhalb der Zellen). Verwenden Sie keine DIC Bildgebung während des Experiments, da es mehr Licht als Standard Hellfeldabbildung, die die Zellen ausgesetzt werden können unnötig Phototoxizität im Laufe der langen Experimenten erfordert.
- Starten Sie die Software-kontrolliertes Experiment. Stellen Sie sicher, dass das System nicht gestört wird (bestoßen, ausgesetzt, um überschüssige Raumlicht, etc.) während des Experiments.
- Bei Bedarf füllt die Wasser in dem Befeuchtungssystem während des Experiments.
4. Post-Akquisition Verarbeitung von Images
- Überprüfen Sie die Bilder für jedes z-Stack und Zeitpunkt. Ernte aus alle nicht benötigten Bereichedie Bilder auf den Computer Verarbeitungszeit in dem nächsten Schritt zu verringern.
- Verwenden Sie einen Dekonvolutionsalgorithmus neu zuweisen Signalintensität der Pixel des Ursprungs in jeder z-Stapel 15. Während dieser Entfaltung auf einer theoretischen Punktstreufunktion für Ihre Bildgebungssystem basieren können, ist es vorzuziehen, die Punktstreufunktion eines bestimmten Systems durch Abbilden fluoreszierenden Mikrosphären zu messen, und diese Messung in der Entfaltungs-Algorithmus. Wir maßen die Point-Spread-Funktion unserer Imaging-System und angewandte a eingeschränkt iterativen Maximum-Likelihood-Algorithmus in AxioVision Software (Software AxioVision Beschreibung, Zeiss).
- Untersuchen Sie die Bilder, um die Intensität Veränderungen und Bewegungen von Plasmiden während des Zellzyklus und die Partitionierung von Plasmiden an Tochterzellen zu verfolgen.
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Representative Results
Maximalintensität Vorsprünge von z-Stacks in einem repräsentativen Experiment erworbenen sind in Abbildung 3 dargestellt. Typische Plasmid Signale vorhanden sind in 3-8 Scheiben des Z-Stapel, je nachdem, ob sie für Einfachbindungen oder Clustern von Plasmiden. Im Fall von EBV-und KSHV abgeleitete Plasmide, bewegen sich die Signale innerhalb der Zelle langsam, bis die Zelle gelangt Mitose. Die Zellen selbst wandern über den Verlauf des Experiments. Sie werden auch sphärische und lösen sich von der Schale während der Mitose. Der Zellzyklus für gesunde HeLa-und SLK-Zellen dauert etwa 24 Stunden, die Zellen dieser Typen, die mehr als 30 Stunden dauern, bis die Zelle Zyklus abzuschließen sollte als ungesund werden. Tochterzellen typischerweise nahe aneinander zu befestigen und weiter zum gleichzeitig im nächsten Zellzyklus zu unterteilen. Nur Zellen, die nachweislich einen Zellzyklus abgeschlossen werden können, sollten analysiert werden.
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Abbildung 1. Schema zur Herstellung von Plasmiden sichtbar. (A) Tandemwiederholungen des Lactose-Operatorsequenz (lacO) werden in das Plasmid von Interesse kloniert. Die Lactose Repressor Protein (LacI) bindet spezifisch an diesen Sequenzen; Fusion mit einem fluoreszierenden Protein rekrutiert das fluoreszierende tag mit dem Plasmid von Interesse. (B und C) wird der Kern einer HeLa-Zelle, LacI tdTomato fluoreszierend ist aufgrund der Kernlokalisierungssignal auf dem Fusionsprotein lokalisiert ist, um den Kern. KSHV Genome Codieren LacO Sequenzen rekrutieren viele Kopien von dem fluoreszierenden Protein und stehen als helle Signale über dem Hintergrund-Intensität des Kerns in Abwesenheit von IPTG (B), während die LacI-fluoreszierenden Proteinen verhindert werden, um anerkannt LacO Sequenz in binden die Gegenwart von IPTG (C). Diese Bilder werden rechnerisch um mehrere z-Ebenen, in denen die unterschiedlichen Signale aufzuhalten umfassen.
Abbildung 2. Diagramm des Plasmids Visualisierung Verfahren. Zunächst werden Tandem-LacO Wiederholungen in das Plasmid von Interesse geklont. Dass das Plasmid in Zellen durch Transfektion eingebracht. Klone von transfizierten Zellen werden ausgewählt und gesiebt und danach mit einem Retrovirus Expression eines fluoreszierenden LacI Fusionsprotein infiziert.
Abbildung 3. Lesen von Bildern auf Plasmide während des Zellzyklus zu verfolgen. Fluoreszierend markierten viralen Genomen in einer HeLa-Zelle (A) in der S-Phase (B) synthetisiert und unterteilt sind, um Tochterzellen bei der Zellteilung (CE) und kann für mehrere Generationen folgen. Dargestellt sind Maximum Intensity Projections der z-Stacks einer HeLa Zellzyklus zu fünf Zeitpunkten erworben in einer repräsentativen Experiments. Diese Bilder werden, wie in 1B und C hergestellt.
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Discussion
Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um die Plasmide in lebenden Säugetierzellen zeitlich über mehrere Generationen zu folgen. Durch die Begrenzung der Exposition gegenüber Anregungslicht, haben wir diese Techniken verwendet, um Zellen aus neu eingeteilt paarweise durch Kolonien von 16-32 Zellen folgen, die mindestens 72 Stunden und 3 Zellteilungen. Diese Versuche liefern Informationen, die nicht vom statischen Assays wie quantitative PCR, Southern Blotting und FISH erhalten werden kann.
Es ist wesentlich, um Klone von Zellen für Plasmide mit einer homogenen Struktur zu screenen, wie Umlagerungen auftreten kann, wenn unter Verwendung von Plasmiden mit repetitiven Sequenzen wie die Tandem Repeats LacO. Außerdem ist es nützlich, Retrovirusinfektion und Bildschirm Klone von infizierten Zellen zur optimalen Signalintensität optimieren. Zellen, die zu viel LacI Protein hohe Hintergrundfluoreszenz im Kern haben, und diejenigen zum Ausdruck zu wenig werden schwache Signale. Schließlich ist es is wichtig, Zellmorphologie suchen und wählen Sie gesunde Zellen beim Markieren Sichtfelder während ihrer Visualisierung nutzen.
Diese Technik verwendet werden, um nahezu jede DNA-Molekül zu visualisieren, sofern sie konstruiert werden können, um Tandem-Wiederholungen des LacO Sequenz enthalten sein. Beispiele hierfür sind zelluläre Chromosomen, natürlich vorkommende und künstliche Plasmide und virale Genome in Virionen verpackt. In Experimenten ähnlich der in 3 dargestellt, fanden wir, dass unsere KSHV abgeleitete Plasmide, um zufällig während der Zellteilung partitioniert werden angezeigt. Eine logische Erweiterung der Technik ist es, ein DNA-Molekül nach einem LacO / LacI Paar markieren mit einem fluoreszierenden Protein und einer anderen DNA-Molekül in der gleichen Zelle als Tetracyclin Operator / Repressor Tetetracycline Paar mit einem anderen fluoreszierenden Proteins. Experimente werden durch die Menge des Anregungslichts die Zellen vor cytotoxischen Effekte erfährt standhalten kann begrenzt.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und ACS, einschließlich T32CA009135, CA133027, CA070723 und CA022443 finanziert. Bill Sugden ist ein American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
