Summary
Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.
Abstract
Weinig natuurlijk voorkomende plasmiden worden gehandhaafd in zoogdiercellen. Onder deze zijn genomen van gamma-herpesvirussen, zoals Epstein-Barr virus (EBV) en Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus (KSHV) die leiden tot meerdere menselijke maligniteiten 1-3. Deze twee genomen worden gerepliceerd in een erkende wijze elk een unieke virale eiwitten en cellulaire replicatie machines, en worden doorgegeven aan dochtercellen bij celdeling ondanks hun waar traditionele centromeren 4-8.
Er is veel werk gedaan om de replicatie van deze plasmide genomen karakteriseren methoden zoals Southern blotting en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze methoden zijn beperkt, alhoewel. Kwantitatieve PCR en Southern blots informatie over het gemiddelde aantal plasmiden per cel in een populatie van cellen. FISH is een single-cell assay dat zowel het gemiddelde aantal en de verdeling van plasmide onthult s per cel in de populatie van cellen, maar statisch, zodat geen informatie over de ouder of nakomelingen van de onderzochte cel.
We beschrijven een werkwijze voor het visualiseren van plasmiden in levende cellen. Deze methode is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lactose repressor eiwit naar meerdere locaties in het plasmide plaats 9. Het DNA van belang is ontworpen om ongeveer 250 tandem repeats van de lactose operator (LACO) sequentie omvatten. LACO is specifiek gebonden door de lactose repressor eiwit (LacI), die kan worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit. Het fusie-eiwit kan tot expressie worden gebracht van de kunstmatige plasmide zijn of van een retrovirale vector. Op deze wijze worden de DNA moleculen fluorescent gelabeld en daardoor zichtbaar via fluorescentiemicroscopie. Het fusie-eiwit wordt geblokkeerd binden van plasmide DNA door het kweken van cellen in aanwezigheid van IPTG tot de plasmiden kan worden bekeken.
NHOUD "> dit systeem kan de plasmiden worden bewaakt in levende cellen heen zijn de eigenschappen onthullen hun synthese en partitionering dochtercellen. Ideal hechtende cellen, getransfecteerd eenvoudig en hebben grote kernen. Deze techniek is gebruikt om te bepalen of 84% van EBV afgeleide plasmiden worden gesynthetiseerd elke generatie en 88% van de nieuw gesynthetiseerde plasmiden partitie getrouw aan dochtercellen in HeLa cellen. paren van deze EBV plasmiden werden gezien worden gebonden aan of verbonden met zusterchromatiden na hun synthese in S- fase totdat ze werden beschouwd te scheiden als zusterchromatiden gescheiden Anaphase 10. methode wordt momenteel gebruikt om replicatie van KSHV genomen in HeLa cellen en SLK cellen te bestuderen. HeLa cellen geïmmortaliseerde menselijke epitheelcellen en SLK cellen geïmmortaliseerde humane endotheliale cellen. Hoewel SLK-cellen werden oorspronkelijk afkomstig van een KSHV laesie, noch de HeLa noch SLK cellijn natuurlijk harbors KSHV genomen 11. Naast het bestuderen van virale replicatie kan deze visualisatie techniek worden toegepast om de effecten van de toevoeging, verwijdering of wijziging van verschillende DNA sequentie-elementen op synthese, lokalisatie en partitioneren van andere recombinant plasmide DNA te onderzoeken.Protocol
1. Engineering van Cellen met Zichtbare Plasmiden
- Gebruik standaard restrictiedigestie of homologe recombinatie technieken om een DNA fragment dat ongeveer 250 kopieën van de operatorsequentie lactose (LACO) in het plasmide te introduceren gevisualiseerd. Het plasmide was bacmide van ongeveer 170 kbp en die het gehele genoom van Kaposi-sarcoom-geassocieerd Herpes Virus (KSHV) en gecodeerde resistentie tegen hygromycine 12.
- Introduceren LACO bevattende plasmide DNA in zoogdiercellen door transfectie met Lipofectamine 2000. We HeLa cellen getransfecteerd en SLK in 60 mm schalen gedurende 4 uur met 10 ug gezuiverd plasmide DNA met 25 pl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, en 3,5 ml DMEM.
- Verander het kweekmedium tot 5 ml DMEM met 10% foetaal runderserum en incubeer cellen gedurende 48 uur.
- Plaat de cellen bij lage dichtheid in grote schotels en cultuur cellen in medium dat een antibioticum selectie voor de geïntroduceerde plaSmid, we geselecteerde cellen in DMEM met 10% foetaal bovine serum met 300 ug / ml hygromycine 3 weken.
- Gebruik stukjes steriel, trypsine gedrenkte filtreerpapier tegen hygromycine-resistente kolonies over te dragen aan nieuwe cultuur gerechten.
- Wanneer getransfecteerde klonen gegroeid tot de schotel vullen, isoleren DNA voor restrictie digestie en Southern blotting om te waarborgen dat het polymeer van de LACO plasmide homogeen is en de verwachte grootte.
- Als het plasmide niet is ontworpen om een fusie van LacI drukken, infecteren geschikte klonen met een retrovirus dat codeert voor de repressor lactose (LacI) gefuseerd aan een rood fluorescerend eiwit, zoals LacI-tdTomato. We maken gebruik van tdTomato in plaats van eiwitten die fluoresceren dichter naar groen naar photoxicity die zouden ontstaan door meerdere belichtingen over lange tijden 13 te minimaliseren.
- Zodra de LacI fusieproteïne geïntroduceerd, de cellen kweek in aanwezigheid van 200 ug / ml isopropyl-bD-thiogalactoside (IPTG) aan de fusie-eiwitten te blokkeren bindingDNA.
- Cultuur de cellen ten minste 3 dagen expressie van het LacI-tdTomato eiwit toestaan.
- Screen klonen (door wegwassen van IPTG en die cellen zoals hieronder beschreven) voor mensen met niveaus van LacI-tdTomato dat verschillende signalen tonen met minimale achtergrondniveaus van ongebonden eiwit.
2. Ontwikkeling van de Imaging System
Het beeldvormingssysteem omvat een Zeiss Axiovert 200M uitgerust met een gemotoriseerde fase en Plan-Aochromat 63x/1.4 olie doel. Fluorescentie excitatie licht door de "neutrale witte" LED van een Colibri systeem. Emissie wordt gedetecteerd door een CascadeII: 1024 EMCCD camera. Dit is een gekoeld, verdund back-camera met een gain register voor het versterken van signalen, de donkerstroom is 0,061 elektronen per pixel per seconde en kwantumefficiëntie groter dan 0,90. Het systeem wordt geregeld door AxioVision 4.8 software, zoals de SmartExperiments module. Voor detectie van tdTomatot we een Zeiss filterset 75HE voor die 85% van de doorgegeven licht kan prikkelen de fluor en 95% van het uitgezonden licht zal passeren de uitstoot filter.
- Monteer een afbeeldingssysteem met een omgekeerde microscoop en een EMCCD camera voor gevoelige detectie van signalen, een LED lichtbron voor specifieke excitatie en snelle bekisting een gemotoriseerde fase en focus arm en software controle voor automatische verwerving van beelden over lange tijdsintervallen met meerdere z-stacks. Het systeem moet zitten op een lucht tafel te worden geïsoleerd tegen trillingen.
- Stel een stage-top incubator bloedcellen bij 37 ° C, 5-10% CO2 in een bevochtigde kamer. Voldoende tijd om het systeem in een stabiele temperatuur bewegingsartefacten te minimaliseren tijdens het experiment.
- Gebruik een verwarmde kraag voor de doelstelling om het doel te voorkomen dat overheveling warmte van het monster.
3. Visualisatie van gelabelde DNA
- Plaat cellen in een 35 mmglazen onderste schaal met een dichtheid van minder dan 10% confluentie, waardoor paren cellen in kolonies van 8-16 celdeling zonder overlapping. Doe dit ten minste 24-48 uur voor beeldvorming, zodat de levensvatbare cellen tijd te verdelen hebben.
- Een tot drie uur voor de start van beeldvorming spoel de plaat 3 maal met kweekmedium dat zowel selectieve geneesmiddelen en IPTG mist. Deze procedure spoelt niet-levensvatbare cellen en maakt LacI fusie-eiwitten binden LACO sites in de plasmiden.
- Het kweekmedium vervangen met 2 ml DMEM met 10% foetaal runderserum en 25 mM HEPES.
- Plaats de top van de kweekschaal met CultFoil opgespannen in een montageraam voor een 35 mm plaat. Dit deksel remmen verdamping van het kweekmedium, dat zoutconcentratie tijd zou toenemen en doden de cellen.
- Gebruik differentieel interferentie contrast (DIC) beeldvorming om de cellen bekijken en het brandvlak van de boven-en onderkant van de cellen in meerdere gezichtsveld bepalen.In elk veld naar een brandvlak ongeveer 1/3 van de weg vanaf de bovenkant van de cel. Sla de x, y, z-coördinaten in de lijst opgeslagen fase posities.
Opmerking: Plasmide signalen niet zichtbaar zijn door de oculairs wanneer cellen worden verlicht door LED's van de golflengte geschikt is voor de LacI fusieproteïne. Zwakke signalen kunnen alleen zichtbaar zijn met het gebruik van de EMCCD camera, die integratie mogelijk maakt van het signaal in de tijd en daardoor effectief versterkt zwakke signalen. - In de microscoop besturingssoftware, definiëren een z-stack afbeeldingen worden uitgevoerd bij elk opgeslagen podium. Kies az stapgrootte van 0.35-+0.50 micrometer, die u zal toelaten om bij benadering Nyquist bemonstering in de z-dimensie 14. Onder "extra" slices boven en onder de vlakken waarin de cellen zich bevinden, kunnen deze schijfjes detectie na celbewegingen tijdens de celcyclus, en worden ook gebruikt in post-processing acquisitie (deconvolutie) van het beeld stacks. Deze integratie zalresulteren in een stapel van 40-60 beelden, afhankelijk van de dikte van de cellen.
- In de microscoop besturingssoftware, definiëren een tijdreeks experiment een helderveld beeld van de z-stacks verzamelen op 30 min intervallen (voor het volgen celdelingen en migratie over lange tijd) en fluorescentiebeelden op 10-60 min interval (plasmiden voor het visualiseren in cellen). Laat DIC imaging Niet gebruiken tijdens het experiment, zoals het vereist meer licht dan de standaard helderveld beeldvorming, die onnodig kunnen de cellen bloot te stellen aan fototoxiciteit in de loop van lange experimenten.
- Start de software-gecontroleerd experiment. Zorg ervoor dat het systeem niet wordt verstoord (gestoten, blootgesteld aan teveel licht in de kamer, enz.) tijdens het experiment.
- Eventueel vullen het water in het bevochtigingssysteem tijdens het experiment.
4. Post-acquisitie verwerking van beelden
- Bekijk de afbeeldingen voor elke z-stack en tijdstip. Snijd uit elke onnodige gebieden vande beelden naar de computer verwerkingstijd te verkorten in de volgende stap.
- Gebruik een deconvolutie algoritme om signaalintensiteit opnieuw toe te wijzen aan de pixel van oorsprong in elk z-stack 15. Hoewel deze deconvolutie kan worden gebaseerd op een theoretisch puntspreidingsfunctie voor imaging systeem, verdient het de voorkeur de puntspreidingsfunctie van specifieke systeem meten imaging fluorescerende microbolletjes en deze meting gebruiken in de deconvolutie algoritme. We hebben de puntspreidingsfunctie van onze afbeeldingssysteem en toegepast een beperkt maximaal waarschijnlijk algoritme iteratief in AxioVision software (AxioVision software beschrijving, Zeiss).
- Onderzoek de afbeeldingen om de intensiteit veranderingen en bewegingen van plasmiden tijdens de celcyclus en de verdeling van plasmiden met de dochter van cellen te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Maximumintensiteit projecties van z-stacks verkregen in een representatief experiment worden getoond in Figuur 3. Typische plasmide signalen in 3-8 segmenten van de z-stack, naargelang zij vertegenwoordigen een of clusters van plasmiden. In het geval van EBV-en KSHV-afgeleide plasmiden, de signalen langzaam bewegen in de cel totdat de cel mitose bereikt. De cellen zelf migreren in de loop van het experiment. Ze worden ook sferische en losmaken van de schotel tijdens de mitose. De celcyclus voor gezonde en HeLa cellen SLK duurt ongeveer 24 uur, cellen van deze die langer dan 30 uur tot de celcyclus te voltooien worden overwogen ongezond. Dochtercellen typisch hechten dichtbij elkaar gaan splitsen tegelijkertijd in de volgende celcyclus. Alleen cellen die kunnen worden aangetoond dat celcyclus te voltooien moeten worden geanalyseerd.
05/4305fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Schema voor het maken van plasmiden zichtbaar. (A) Tandem repeats van de lactose operatorsequentie (LACO) worden gekloneerd in het plasmide plaats. De lactose repressor eiwit (LacI) bindt specifiek aan deze sequenties, fusie met een fluorescerend eiwit werft de fluorescerende tag het plasmide plaats. (B en C) de kern van een cel die HeLa LacI-tdTomato fluorescerend is door de nucleaire lokalisatie signaal op het fusieproteïne gelokaliseerd aan de nucleus. KSHV genoom codeert LACO sequenties werven vele kopieën van het fluorescerende eiwit en onderscheiden als heldere signalen over de achtergrond intensiteit van de kern in de afwezigheid van IPTG (B), terwijl de LacI-fluorescerende eiwitten worden voorkomen om erkend LACO sequentie binden de aanwezigheid van IPTG (C). Deze beelden worden gemaakt rekenkundig meerdere z-vlakken waarin de verschillende signalen omvatten verblijven.
Figuur 2. Diagram van het plasmide visualisatie procedure. Eerst worden tandem repeats Laco gekloneerd in het plasmide plaats. Dit plasmide wordt ingebracht in cellen door transfectie. Klonen van getransfecteerde cellen worden geselecteerd en gescreend, en vervolgens geïnfecteerd met een retrovirus expressie van een fluorescent LacI fusieproteïne.
Figuur 3. Beoordelen beelden plasmiden volgen gedurende de celcyclus. Fluorescent gelabeld virale genomen in een HeLa cel (A) worden gesynthetiseerd in de S-fase (B) en verdeeld aan dochtercellen bij celdeling (CE) en kunnen worden gevolgd voor meerdere generaties. Getoond zijn maximale intensiteit projecties van z-stapels verworven van een HeLa cel cyclus op vijf tijdstippen in een representatief experiment. Deze beelden worden gemaakt, zoals in figuur 1B en C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven werkwijze kan worden gebruikt om plasmiden in levende zoogdiercellen tijd volgen over meerdere generaties. Door de beperking van de blootstelling aan excitatielicht, hebben we gebruik gemaakt van deze technieken om cellen van nieuw verdeeld paren volgen via kolonies van 16-32 cellen, die ten minste 72 uur en 3 celdelingen. Deze experimenten geven informatie niet kan worden verkregen door statische assays zoals kwantitatieve PCR, Southern blotting en FISH.
Het is essentieel om klonen van cellen screenen op plasmiden met een homogene structuur, herschikkingen kunnen optreden bij plasmiden met repetitieve sequenties zoals het tandem repeats LACO. Bovendien is het nuttig retrovirus infectie en screen klonen van geïnfecteerde cellen te optimaliseren voor een optimaal signaal intensiteit. Cellen die teveel LacI eiwit een hoge achtergrond fluorescentie in de kern, en die expressie te weinig hebben zwakke signalen. Tenslotte iis belangrijk om te kijken naar de celmorfologie en kies gezonde cellen als markering gezichtsveld te gebruiken tijdens hun visualisatie.
Deze techniek kan gebruikt worden om bijna elke DNA molecule visualiseren, indien wordt gemanipuleerd om tandem repeats van de sequentie omvatten LACO. Voorbeelden zijn cellulaire chromosomen natuurlijk voorkomende als kunstmatige plasmiden en virale genomen verpakt in virions. In experimenten vergelijkbaar met die weergegeven in figuur 3, vonden we dat onze KSHV afgeleide plasmiden lijken willekeurig verdeeld tijdens de celdeling. In het verlengde van de techniek is een DNA molecule markeer een LACO / LacI paar met een fluorescerend eiwit, en een DNA-molecuul in dezelfde cel als Tetracycline Operator / Tetetracycline Repressor koppeling met een ander fluorescerend eiwit. Experimenten zijn beperkt door de hoeveelheid excitatielicht de cellen kan weerstaan voordat cytotoxische effecten ondervindt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de NIH en ACS, met inbegrip van T32CA009135, CA133027, CA070723 en CA022443. Bill Sugden is een American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
