Summary
Un método de observación de moléculas individuales de ADN en células vivas se describe. La técnica se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia represor lac a sitios de unión ingeniería genética en el ADN de interés. Este método puede ser adaptado para seguir muchos ADNs recombinantes en células vivas en el tiempo.
Abstract
Pocos plásmidos de origen natural se mantienen en células de mamífero. Entre éstos están los genomas de gamma-herpesvirus, incluyendo el virus de Epstein-Barr (EBV) y el sarcoma de Kaposi asociado a herpesvirus (KSHV), que provocan múltiples malignidades humanas 1-3. Estos dos genomas se replican de manera autorizada, cada uno usando una sola proteína viral y maquinaria de replicación celular, y se pasan a las células hijas durante la división celular a pesar de que carecen de sus centrómeros tradicionales 4-8.
Mucho trabajo se ha realizado para caracterizar las repeticiones de estos genomas plásmido utilizando métodos tales como Southern blot y la hibridación fluorescente in situ (FISH). Estos métodos están limitados, sin embargo. PCR cuantitativa y las transferencias de Southern proporcionar información sobre el número medio de plásmidos por célula en una población de células. La FISH es un ensayo de una sola célula que revela tanto el número medio y la distribución de plásmido s por célula en la población de células, pero es estática, no permitiendo ninguna información sobre el padre o progenie de la célula examinada.
Aquí se describe un método para visualizar los plásmidos en células vivas. Este método se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia lactosa represor a múltiples sitios en el plásmido de interés 9. El DNA de interés está diseñada para incluir aproximadamente 250 repeticiones en tándem del operador lactosa (LACO) secuencia. Laco es unido específicamente por la proteína represora de la lactosa (LacI), que puede ser fusionada con una proteína fluorescente. La proteína de fusión puede expresarse a partir del plásmido de ingeniería o introducida por un vector retroviral. De esta manera, las moléculas de ADN están marcados fluorescentemente y por lo tanto se hacen visibles a través de microscopía de fluorescencia. La proteína de fusión se bloquea la unión de la ADN plasmídico por cultivo de células en presencia de IPTG hasta los plásmidos están listos para ser visto.
ONTENIDO "> Este sistema permite que los plásmidos sea controlados en células vivas a través de varias generaciones, revelando propiedades de su síntesis y la partición a las células hijas. células ideales son adherente, fácilmente transfectadas, y tienen núcleos grandes. Esta técnica se ha utilizado para determinar que 84% de EBV derivados de plásmidos se sintetizan cada generación y 88% de la partición recién sintetizado plásmidos fielmente a las células hijas en células HeLa. pares de estos plásmidos EBV se observaron a ser atados o asociado a las cromátidas hermanas después de su síntesis en S- fase hasta que se observaron para separar como las cromátidas hermanas en la anafase separados 10. El método se está utilizando actualmente para estudiar la replicación de los genomas HVSK en células HeLa y células SLK. células HeLa se inmortalizan las células epiteliales humanas, y las células inmortalizadas se SLK endoteliales humanas las células. Aunque las células SLK se derivaron originalmente de una lesión KSHV, ni la línea HeLa ni SLK celular naturalmente harbors HVSK genomas 11. Además de estudiar la replicación viral, esta técnica de visualización se puede utilizar para investigar los efectos de la adición, eliminación o mutación de los diversos elementos de secuencia de ADN en la síntesis, la localización, y la partición de otros ADN de los plásmidos recombinantes.Protocol
1. Ingeniería de células con plásmidos visibles
- Utilice la digestión de restricción estándar o técnicas de recombinación homóloga para introducir un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 250 copias de la secuencia operador lactosa (LACO) en el plásmido para ser visualizados. Nuestra plásmido era un bácmido de aproximadamente 170 kpb y contenía el genoma completo de Sarcoma de Kaposi asociado a herpesvirus (KSHV) y la resistencia a la higromicina codificada 12.
- Introducir Laco que contienen ADN plásmido en células de mamífero por transfección con Lipofectamine 2000. Estamos transfectadas las células HeLa y SLK en placas de 60 mm durante 4 horas con 10 g ADN de plásmido purificado con 25 l Lipofectamine 2000, 0,5 OptiMEM ml, y 3,5 ml de DMEM.
- Cambiar el medio de cultivo a 5 ml de DMEM con 10% de células fetales de suero bovino y se incuban durante 48 hr.
- Las células en placas de baja densidad en platos grandes y células de cultivo en un medio que contiene una selección de antibióticos para la presentación plasmid; se seleccionaron las células en DMEM con suero fetal bovino al 10% con 300 mg / ml de higromicina durante 3 semanas.
- Utilice pedazos de estériles, la tripsina papel de filtro empapado de transferir higromicina colonias resistentes a los platos de la nueva cultura.
- Cuando los clones transfectados han crecido hasta llenar el recipiente, para aislar el ADN de la digestión de restricción y transferencia de Southern para garantizar que el polímero de la plásmido Laco es homogéneo y del tamaño esperado.
- Si el plásmido no se ha modificado genéticamente para expresar una fusión de LacI, infectar clones adecuados con un retrovirus que codifica el represor de lactosa (LacI) fusionada a una proteína fluorescente de color rojo, tal como LacI-tdTomato. Utilizamos tdTomato en lugar de proteínas que presentan fluorescencia verde cerca de minimizar photoxicity que ocurrir incluso a dosis múltiples durante largos tiempos de 13.
- Una vez que la proteína de fusión LacI se introduce, cultivar las células en presencia de 200 mg / ml isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) para bloquear las proteínas de fusión de uniónDNA.
- Cultivar las células durante al menos 3 días para permitir la expresión de la proteína de LacI-tdTomato.
- Clones de pantalla (por lavar el IPTG y visualización de las células como se describe más adelante) para aquellos con niveles óptimos de LacI-tdTomato que revelan distintas señales con niveles de referencia mínimos de proteína no unida fusión.
2. Desarrollo del sistema de imágenes
Nuestro sistema de formación de imágenes consiste en un Zeiss Axiovert 200M equipado con una platina motorizada y Plan-Aochromat 63x/1.4 objetivo aceite. Luz de excitación de fluorescencia es proporcionado por el "blanco neutral" LED de un sistema de Colibri. Emisión es detectada por un CascadeII: 1024 cámara EMCCD. Esta es una cámara enfriada, back-diluido con un registro de ganancia para amplificar las señales, la corriente oscura es 0,061 electrones por píxel por segundo, y la eficiencia cuántica es mayor que 0,90. El sistema está controlado por software Axiovision 4,8, incluyendo el módulo SmartExperiments. Para la detección de tdTomaa que utilizamos un 75HE Zeiss Juego de filtros para los que el 85% de la luz que pasa puede excitar el flúor y el 95% de la luz emitida pasará el filtro de emisión.
- Montar un sistema de imágenes con un microscopio invertido y una cámara EMCCD para la detección sensible de señales, una fuente de luz LED de excitación específica y el cierre rápido, una platina motorizada y brazo de enfoque, y el control de software para la adquisición automática de imágenes en intervalos de tiempo largos con múltiples z-pilas. El sistema debe sentarse en una mesa de aire a ser aislado de las vibraciones.
- Montar una incubadora de etapa-top para mantener las células a 37 º C, 5-10% de CO2 en una cámara humidificada. Transcurrido el tiempo suficiente para que el sistema llega a una temperatura estable para minimizar los artefactos de movimiento durante el experimento.
- Usar un collar caliente para el objetivo de prevenir el objetivo de sifón de calor de la muestra.
3. Visualización de ADN marcadas
- Células en placas de 35 mmplato de fondo de vidrio a una densidad de menos de 10% de confluencia, lo que permitirá pares de células que se dividan en las colonias de 8-16 células sin superposición. ¿Es esta hr al menos 24-48 antes de formación de imágenes de modo que las células viables tienen tiempo para dividir.
- Uno a tres horas antes del inicio de formación de imágenes, enjuagar la placa 3 veces con medio de cultivo que carece de ambos fármacos selectivos e IPTG. Este procedimiento lava las células no viables y permite que las proteínas de fusión LacI para enlazar sitios Laco en los plásmidos.
- Sustituir el medio de cultivo con 2 ml de DMEM con suero fetal bovino al 10% y HEPES 25 mM.
- Reemplazar la parte superior de la placa de cultivo con CultFoil estira en un anillo de montaje para un plato de 35 mm. Esta tapa inhibir la evaporación del medio de cultivo, lo que aumentaría la concentración de sal en el tiempo y matar a las células.
- El uso de contraste de interferencia (DIC) de imágenes para ver las células y determinar el plano focal de la parte superior e inferior de las células en múltiples campos de visión.En cada campo, se mueven a un plano focal de aproximadamente 1/3 del camino hacia abajo desde la parte superior de la celda. Guarde el x, y, z las coordenadas en la relación de puestos de fase guardado.
Nota: Las señales plásmido puede no ser visible a través de los oculares cuando las células son iluminadas por LEDs de la longitud de onda apropiada para la proteína de fusión LacI. Las señales débiles sólo pueden ser visibles con el uso de la cámara EMCCD, que permite la integración de la señal en el tiempo y por lo tanto amplifica eficazmente señales débiles. - En el software de control del microscopio, definir un z-pila de imágenes que se deben realizar en cada posición de fase guardado. Elija el tamaño de az paso de 0.35-0.50 m, que le permitirá a la aproximación de muestreo de Nyquist en la dimensión z 14. Incluir "extra" rebanadas por encima y por debajo de los planos en los que se encuentran las células; estas rebanadas de permitir la detección siguiendo movimientos de la célula durante el ciclo celular, y también se utilizan en el procesamiento posterior a la adquisición (deconvolución) de las pilas de imagen. Esta inclusión seresultar en una pila de 40-60 imágenes, dependiendo del grosor de las células.
- En el software de control del microscopio, definir un experimento de series de tiempo para recoger una imagen de campo brillante de la z-pilas a intervalos de 30 min (para el seguimiento de las divisiones celulares y las migraciones más largos tiempos) y las imágenes de fluorescencia a intervalos de 10-60 min (para la visualización de plásmidos dentro de las células). No utilice imágenes DIC durante el experimento, ya que requiere más luz que las imágenes de campo claro estándar, que puede exponer a las células innecesariamente a la fototoxicidad en el curso de experimentos de largo.
- Iniciar el experimento controlado por software. Asegúrese de que el sistema no está perturbado (golpeado, expuesto a la luz ambiente en exceso, etc) durante el experimento.
- Si es necesario, reponer el agua en el sistema de humidificación durante el experimento.
4. Post-adquisición de Procesamiento de Imágenes
- Revisar las imágenes para cada punto z-pila y el tiempo. Recortar cualquier área que no necesite delas imágenes para reducir el tiempo de procesamiento informático en la siguiente etapa.
- Utilizar un algoritmo de deconvolución para volver a asignar a la intensidad de la señal de píxel de origen en cada 15 z-pila. Si bien este deconvolución se puede basar en una función de dispersión de punto teórico para su sistema de imagen, es preferible medir la función de dispersión de punto de su sistema en particular por formación de imágenes microesferas fluorescentes, y el uso de esta medida en el algoritmo de deconvolución. Se midió la función de dispersión puntual de nuestro sistema de formación de imágenes y aplica a. Limitada algoritmo iterativo de máxima verosimilitud en AxioVision software (descripción AxioVision software, Zeiss)
- Examine las imágenes para el seguimiento de los cambios de intensidad y los movimientos de los plásmidos durante el ciclo celular y la división de los plásmidos a las células hijas.
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Representative Results
Proyecciones de máxima intensidad de z-pilas adquiridas en un experimento representativo se muestra en la Figura 3. Típicas señales plásmido están presentes en 3-8 rebanadas de la Z-Stack, dependiendo de si representan única o grupo de plásmidos. En el caso de EBV y KSHV plásmidos derivados, las señales se mueven lentamente dentro de la célula hasta que la célula alcanza la mitosis. Las células se migran durante el transcurso del experimento. También se vuelven esféricos y desprenden de la placa durante la mitosis. El ciclo celular de las células sanas HeLa y SLK dura aproximadamente 24 horas, las células de este tipo que tienen más de 30 horas para completar el ciclo celular se consideran saludables. Las células hijas típica, se adhieren cerca de la otra y van a dividir al mismo tiempo en el próximo ciclo celular. Sólo las células que se pueden mostrar para completar un ciclo celular debe ser analizado.
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Figura 1. Esquema para la fabricación de plásmidos visible. (A) repeticiones en tándem de la secuencia del operador lactosa (LACO) se clonó en el plásmido de interés. La proteína represora de la lactosa (LacI) se une específicamente a estas secuencias; fusión a una proteína fluorescente recluta la etiqueta fluorescente para el plásmido de interés. (B y C) El núcleo de una célula HeLa que expresan LacI-tdTomato es fluorescente debido a la señal de localización nuclear de la proteína de fusión de localización al núcleo. HVSK genomas que codifican secuencias de Laco reclutar muchas copias de la proteína fluorescente y se destacan como señales luminosas sobre la intensidad de fondo del núcleo en ausencia de IPTG (B), mientras que las proteínas fluorescentes LacI-se impide de unirse a su secuencia de reconocimiento en Laco la presencia de IPTG (C). Estas imágenes se hacen computacionalmente para incluir múltiples z planos en los que las diferentes señales residen.
Figura 2. Diagrama del procedimiento de visualización plásmido. En primer lugar, se repite en tándem Laco se clonó en el plásmido de interés. Ese plásmido se introduce en las células por transfección. Los clones de células transfectadas se seleccionan y se tamizan, y después infectados con un retrovirus que expresa una proteína fluorescente de fusión LacI.
Figura 3. Revisa las imágenes para rastrear plásmidos largo del ciclo celular. Marcado con fluorescencia genomas virales en una célula HeLa (A) se sintetizan en la fase S (B) y se repartió a las células hijas durante la división celular (CE) y puede ser seguido por múltiples generaciones. Se muestran las proyecciones de máxima intensidad de z-pilas adquiridas de un ciclo celular HeLa en cinco puntos de tiempo en un experimento representativo. Estas imágenes se hacen como en la Figura 1B y C.
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Discussion
El método descrito aquí se puede utilizar para seguir los plásmidos en células de mamíferos vivos en el tiempo que abarca múltiples generaciones. Al limitar la exposición a la luz de excitación, hemos utilizado estas técnicas para seguir las células de parejas recién divididas a través de las colonias de 16-32 células, lo que representa por lo menos 72 horas y 3 divisiones celulares. Estos experimentos proporcionan información que no puede obtenerse a partir de ensayos estáticos, tales como PCR cuantitativa, transferencia Southern, y FISH.
Es esencial seleccionar clones de células para plásmidos con una estructura homogénea, como reordenamientos puede ocurrir cuando se utilizan plásmidos con secuencias repetitivas, tales como las repeticiones en tándem Laco. Además, es útil para optimizar la infección por retrovirus y clones de pantalla de las células infectadas a una intensidad de señal óptima. Las células que expresan la proteína LacI demasiado tendrá alta fluorescencia de fondo en el núcleo, y las que expresan muy poco tendrá señales débiles. Por último, se is importante tener en cuenta la morfología celular y elegir las células sanas al marcar los campos de visión a utilizar durante su visualización.
Esta técnica se puede utilizar para visualizar casi cualquier molécula de ADN, siempre que pueda ser diseñado para incluir repeticiones en tándem de la secuencia de Laco. Los ejemplos incluyen los cromosomas celulares, los plásmidos de origen natural como artificial, y los genomas virales empaquetados en viriones. En experimentos similares a la representada en la Figura 3, se encontró que nuestros KSHV plásmidos derivados parecen ser dividido aleatoriamente durante la división celular. Una extensión lógica de la técnica es etiquetar una molécula de ADN como un par lacO / LacI con una proteína fluorescente, y otra molécula de ADN en la misma celda como un operador de la tetraciclina / par represor Tetetracycline con otra proteína fluorescente. Los experimentos están limitados por la cantidad de luz de excitación de las células puede soportar antes de experimentar efectos citotóxicos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH y ACS, incluyendo T32CA009135, CA133027, CA070723, y CA022443. Bill Sugden es una Sociedad Americana del Cáncer Profesor de Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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