Summary
פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.
Abstract
פרוטוקולים קיימים לדור של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם (hPSCs) הם לעתים קרובות מייגעים שבהם נהלים רבים שלבים המעורבים הבידוד וההתרחבות של תאים מבשרים עצביים, לפני ההתמיינות סופנית. בהשוואה לגישות זמן רב אלה, שמצאנו לאחרונה כי עיכוב משותף של שלושה מסלולי איתות, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 וFGF / ERK, מקדם אינדוקציה מהירה של neuroectoderm מhPSCs, ואחריו בידול מיידי לנוירונים פונקציונלי. הנה, יש לנו הנוהל שלנו הותאמו לפורמט צלחת multititre רומן, כדי לשפר עוד יותר את השחזור שלה וכדי לעשות את זה תואם עם יישומי אמצע תפוקה. היא כוללת ארבעה ימים של היווצרות neuroectoderm בתחומים צפים (גופי embryoid), ואחריו ארבעה ימים נוספים של בידול לנוירונים בתנאי חסיד. רוב התאים שהושגו עם פרוטוקול זה להיראות נוירונים חושיים דו קוטביים. יתר על כן,ההליך הוא יעיל ביותר, אינו דורש מיומנויות מומחה מסוימות, והוא מבוסס על מדיום הגדרה כימית פשוט עם מולקולות קטנות חסכוניות. בשל תכונות אלה, ההליך עשוי לשמש כפלטפורמה שימושית לחקירה פונקציונלית נוספת וגם להקרנה מבוססת תאים מתקרב דורש נוירונים חושיים אדם או נוירונים מכל סוג.
Introduction
hPSCs, המהווים עוברי מופקים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (hiPSCs), הוא משמעות pluripotent שהם יכולים להצמיח שושלות תאים שונות במבחנת 1-2. סוגי תאים מובחנים רבים שנגזרים מhESCs עד כה, תומכים ברעיון כי התאים הללו מהווים כלים חשובים למחקר מדעי וגישות הקרנה מבוססות תאים, והבטחה עבור תרופות מבוססות תאים.
פרוטוקולי בידול עצביים לhESCs הם בדרך כלל מורכבים ודורשים זמן רבים כפי שהם לעתים קרובות מבוססים על גורל 1 התרמה כולל עצבי, ואחרי בידוד ידני של אבות עצביים, ובידול מסוף רציף שסוג נוירון עניין מסוים 3-6. בהקשר מסוים, מורכבות זו אינה מפתיעה ובלתי נמנעת בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול מכוון כגון מדינה-of-the-art נוטים לחקות שלבי התפתחות אנושית מוקדמת, whicח הוא בעצמו מורכב ביותר. מצד השני, היא עשויה בחלקו גם משקפת חוסר ההבנה שלנו את התהליכים המולקולריים שבבסיס, וכתוצאה מפרוטוקולי בידול, כי הם עדיין רחוקים מלהיות מותאמים באופן מלא.
בכל קשור להמרה של hPSCs עבר התמיינות לneuroectoderm, פרה et al. מצא כי דיכוי איתות BMP / SMAD1/5/8 משפר השראה עצבית של 7 hESCs. יתר על כן, איון של SMAD2 / 3 איתות הוכח לקדם היווצרות neuroectoderm 8. בהתאם לכך, בשילוב של איון שני מסלולים אלה נוטה להוביל להשראה עצבית יעילה יותר של hPSCs 4,9. לאחרונה, שהראינו כי מסלול איתות שלישית, FGF / ERK, משמש כמדכא חזקה של את הצעדים הראשונים של מחויבות neuroectodermal בhESCs. מנגד, דיכוי סימולטני של כל שלושה מסלולים אלו מובילים להמרה כמעט הומוגנית של hESCs לneuroectoderm עםבארבעה ימים בלבד 10. לאחר מכן, בידול מסוף היעיל ביותר לנוירונים פונקציונלי נצפה בתוך שמונה ימים. הנוירונים שהושגו היו עשויים להיות נוירונים חושיים של מערכת עצבים ההיקפית, שעשוי בחלקו להסביר הגזירה המהירה שלהם 10. ליקויים בתחזוקת נוירון חושית נחשבים סיבה להפרעות אדם מסוימות, כגון 11 דיסאוטונומיה משפחתית. לדוגמנות מחלות כאלה המבוססים על טכנולוגית hiPSC 12, לאפיון פונקציונלי נוסף, כמו גם למטרות שימושיות שלא דורשים כל סוג מסוים של תאי עצב, הליך הבחנה זו עשויה להציג בסיס שימושי.
עם זאת, אסטרטגית הבידול העסקנו היווצרות מעורבת של גופים עובריים (EBS) במקור מגושים של מושבות hESC 10, וזה הביאה די מידת ההטרוגניות לגבי גדלי EB, והופיעה גם להתפשר יעילות היווצרות תא עצב בחלק ceקווי LL. יתר על כן, בשל ההטרוגניות בגדלי EB, היכולת השיטתית כדי לבחון השפעות של גורמי גדילה נוספים או מולקולות קטנות במהלך ואחרי היווצרות נוירון נראה היה מבולבלת במקצת.
בדו"ח זה, התאמן ההליך הקודם שלנו לטכניקה בינונית תפוקה תואמת, נאלצה צבירה מבוססת לייצר EBS באופן מאוד גודל מבוקר, כפי שהראה גם בהקשרים אחרים 13. כתוצאה מכך, נוצר EBS בבארות בצורת V של צלחות גם 96-הועברו לקובץ מצורף בצורת U נמוך במיוחד 96-גם צלחות, ליזום היווצרות neuroectoderm בהשעיה. ארבעה ימים לאחר מכן, EBS יכול להיות מצופה מהוליד הנוירונים נבדלים סופנים ביעילות גבוהה והומוגניות. לחלופין, יום-4 EBS היו ניתק לתוך תאים בודדים ומצופה כאמורים, אשר הביא monolayers צפיפות הנמוכה של תאי עצב אנושיים. תוצאות עקביות וכך התקבלו הרבה באופן עצמאי 2 דהקווים מבוקעים hESC, HuES6 וNCL3.
כתנאי מוקדם, היווצרות EB המוצלחת הייתה בהחלט תלויה בשימוש בפולימר סינטטי, אלכוהול פוליוויניל (PVA), יחד עם מעכב ROCK Y-27632 הידועים כדי לקדם הישרדות hESC 13-14. כתוצאה מכך, ההומוגניות של EBS נוצרה ב96-V-צלחות היה משופר באופן משמעותי בהשוואה להיווצרות של EBS כתרבויות המוניות המבוססות על טכניקות פיצול אקראיות. מערכת זו ובכך מספקת פלטפורמה השתפרה באופן משמעותי להיווצרות neuroectoderm בתרבות השעיה, ואחרי היווצרות נוירון מבוקרת מאוד בתנאי חסיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הצלחות Matrigel מצופות ומדיה
- הכנת Matrigel הצלחות Matrigel המצופה כבר מצא להיות מצע מועדף לצירופה של הבחנת EBS וגם מקדמת היעילה התולדה של נוירונים מ10 אלה.
- 10 מיליליטר הפשרה של Matrigel הלילה על קרח.
- למחרת, מדלל דמוי הג'לי Matrigel עם שני כרכים של DMEM/F-12 קר כקרח ולהכין aliquots של 1 מ"ל ב15 צינורות חרוטי מ"ל prechilled אשר עשוי להיות מאוחסן קפוא ב -20 ° C.
- החלט על פורמט צלחת להתמיינות עצבית. לדוגמה, כנקודת התחלה, אנו ממליצים לבצע סבב ראשוני של בידול בפורמט 12-כן. טרום מגניבות ארבע צלחות 12-גם ב 4 ° C. ממס aliquot אחד Matrigel הקפוא על ידי הוספת 9 מ"ל של DMEM/F-12 מראש מצונן ואחרי pipetting מעלה ומטה עד שכל Matrigel prediluted כבר הפשיר ונמס.
- אז, להעביר את התוכן לתוך צינור חדש מ"ל 50 המכיל 15 מ"ל של DMEM/F-12 על קרח (דילול סופי Matrigel: 1:75). לאחר מכן יש להוסיף 0.5 מ"ל של Matrigel המדולל לכל אחד גם מהצלחות מראש המקוררות 12-כן. לעטוף צלחות עם Parafilm ולתת לעמוד בRT בן הלילה.
- למחרת, להעביר צלחות עד 4 ° C. צלחות מצופות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שבועות לפני השימוש.
- כלי תקשורת
בינוני היווצרות EB (~ 15 מ"ל צורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב - ראה טבלה 1 וסכימה באיור 2):
DMEM/F-12 עם 0.4% (PVA)
1x N2
1x B27
0.05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 מיקרומטר Y-27632
1x PenStrepGln
בידול בינוני (~ 30 מ"ל הצורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב, ואחרי היווצרות נוירון בצלחת Matrigel מצופית 1 12-כן, ראה טבלה 1):
DMEM/F-12
1x N2
0.05% BSA
0.5 מיקרומטר PD0325901
15 SB431542 מיקרומטר
Dorsomorphin מיקרומטר 0.5
1x PenStrepGln
2. גיבוש EB כפייה
- לגדול בתנאי hPSCs מזין נטולי המועדפים שלך. אנו משתמשים במדיום MEF ממוזג על צלחות Matrigel מצופות 6-כן 15. עם זאת, מערכות תרבות אחרות כגון מדיה ביתית או מסחרית שהוגדרה צריכות גם לעבוד. בעת התחלת ניסוי בידול, hPSCs צריך להיות תת confluent ופעילה הולכים וגדל.
- מכאני להסיר מושבות ספונטניות נבדלות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- שטוף מושבות עברו התמיינות נותרת באמצעות PBS ולעכל לתאים בודדים באמצעות Accutase המכיל 1X Y-27632. תאים גלולים בודדים על ידי צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום EB היווצרות ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer.
- הוסף aliquot של תאים כדיהבינוני נותר EB היווצרות כדי לגרום titre בין 40,000 ל 80,000 תאים למ"ל.
- באמצעות פיפטה רב, להעביר 100 μl להיטב לצלחת 96V בתחתית, וכתוצאה מכך 4,000 עד 8,000 תאים לכל היטב. ספין הצלחת 96-גם בצנטריפוגה צלחת נדנדה החוצה ב 400 XG ל1 דקות כדי לאסוף תאים בחלק התחתון של הבארות, ולהעביר לתא תרבות חממה. EBS יהווה בין הלילה, כפי שמוצג באיור 1.
3. אינדוקצית Neuroectoderm
- למחרת (יום 0), לאסוף EBS מצלחת 96V תחת מיקרוסקופ והעברת סטריאו בנפח קטן לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ"ל של מדיום בידול. עדינות להתסיס את המנה לכמה שניות כדי לשטוף את EBS.
- הוסף 100 μl של מדיום התמיינות לטובה של U-תחתון נמוך במיוחד-96-מצורף צלחת היטב. תחת stereomicroscope, ההעברה EBS בנפחים קטנים מתבשיל הכביסה ל96U הבארות (EB אחד לכולנוLL). צלחת המקום 96U לתוך תא תרבות החממה במשך 4 ימים כדי לאפשר היווצרות neuroectoderm.
4. גיבוש Neuron
- ביום 4, להכין תבשיל כביסה כמו בשלב 3.1 ובנוסף להחליף DMEM/F-12 בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופת 12-היטב על ידי מדיום התמיינות (1 מ"ל לטוב).
- ציפוי של EBS
- איסוף EBS מצלחת 96U, לשטוף אלה כאמורים לעיל, ובזהירות זרעם אחד אחד לתוך בארות של צלחת Matrigel המצופית 12-היטב (כ 8 EBS לטוב): EBS צריך להיות מופץ באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר תולדה של הפרעה נוירונים במשך הימים הקרובים (ראה "היום 5" תמונה באיור 2).
- לפני ההעברה של גב הצלחת 12-גם לתוך החממה, תאפשר EBS לרפיון לצרף עבור סביב 10 דקות ב RT. ואז, להעביר צלחת 12-היטב בזהירות לתא תרבות חממה. הנוירונים יצמחו מEBS מצופה בצורה רדיאלית בתוך 4 הימים הבאים, כפי שshown באיור 2 ("יום 8" תמונה מהימין).
5. גיבוש נוירון כmonolayers
- כחלופה למדרגות נקודה 4), ביום 4 להליך, לאסוף EBS לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ"ל של מדיום התמיינות, ולאחר מכן להעביר את EBS בנפח קטן לצלחת המכילה PBS, ולאחר מכן אל מנה נוספת המכילה Accutase.
- תן לעכל לתאים בודדים, צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום בידול ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. התאם titre ל1-2x10 6 תאים למ"ל באמצעות מדיום התמיינות (ללא Y-27632).
- תאים את הצלחת בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופית 12-כן (1 מ"ל לטוב), והעברה לתא תרבות חממה. היווצרות נוירון כmonolayers נצפתה בין ימים 7 עד 8 (האיור 3C). יש לציין, עם זאת, כי גרסה זו של monolayerהנוהל אינו מותאם באופן מלא בכל קשור להישרדות תא ומצע המתאים ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדו"ח הקודם שלנו, בקו אחד עם רבים אחרים, EBS מhPSCs יכול להיות שנוצר פשוט על ידי replating אגרגטים בזמן חלוקה שגרתית של hPSCs למאכלים-התקשרות נמוכה 10. בדרך כלל זה גורם הפצה רחבה של גדלים וכתוצאה EB (האיור 1C, למעלה). בעיה נוספת שנובעת מכך היא שמרה EBS בהשעיה נוטה לצבור אחד עם שני, מה שמוביל להטרוגניות גבוהה אף יותר של גדלי EB. כדי להתגבר על בעיות אלו, ולכן אנו מנסים ליצור EBS על ידי ציפוי hPSCs היחיד להתקשרות נמוכה בארות של צלחות multititre (איור 1 א). זה לא גרם להיווצרות EB ומוות של תאים (האיור 1B, למטה מימין). החלת מולקולת הישרדות ידועה hPSCs, Y-27632, נתן תוצאות דומות. כמו כן, אלכוהול החלת פוליוויניל (PVA), כי בעבר הוכח כדי לשפר את היווצרות EB של 16 hESCs, נטה "לאסוף" את hPSCs בתחתית 96Vהבארות, אך לא הביאה להיווצרות EB. עם זאת, אם משלב Y-27632 עם תוספי PVA, היינו יכול בקלות לייצר EBS מהשעיות תא בודד של hESCs, בתנאי הגדרה כימית (התרשים 1B). בנוחות, בגדלי EB בפורמט צלחת multititre זה יכול להיות נשלט בחוזקה על ידי זריעת מספרים שונים של תאים לטובים, בניגוד לשימוש בשיטות קונבנציונליות (האיור 1C, למטה).
לאחר דגירה נוספת בצלחות 96V, לעומת זאת, EBS נטה להידבק לתחתית של הבארות. לכן, ביום שלאחר היווצרות EB, זה היה נדרש להעביר לצלחות EBS 96U התקשרות נמוכות במיוחד (איור 1 א). אז Neuroectoderm מושרה בפורמט זה באמצעות קוקטייל מולקולה קטנה המכיל PD0325901 (מעכב FGF / ERK), SB431542 (TGFβ/SMAD2 מעכב), וdorsomorphin (BMP/SMAD1 מעכב), כפי שתאר 10. בעקבות היווצרות neuroectodermבאמצעות קוקטייל מולקולה קטנה זו, EBS ניתן מצופה החוצה כדי להצמיח נוירונים בכל פורמט, ובלבד שמשטחים מצופים בMatrigel; (איור 2). על ידי ייזום היווצרות EB עם מספרים שונים של תאים (האיור 1C, למטה), מצא כי EBS נוצר מסביב 8000 תאים נוטים להניב יכולת ההתמיינות העצבית הטובה ביותר. זה מאופיין באוטופיות צמחו עצביות בולטות מEBS המצופה, הקטין מרכזי EB נימקים לאחר ציפוי, והביטוי גבוה של סמנים חושיים ופאן עצביים כגון BRN3A וטובולין β-III (איורים 2 ו 3 א, ב). את יעילות ההתמיינות העצבית הכללית מופיעה להיות דומה להליך המקורי (% ~ 70) (איור 3), שהיה רלוונטי לשניהם hESCs וhiPSCs 10. יש לנו שני קווים עצמאיים מועסקים hESC, HuES6 וNCL3, בהליך multiwell, עד כה ואילו השתנות קו תלויים בתא differentiatioיעילות n יכולה בדרך כלל לא ניתן לשלול.
מספר יישומים של נוירונים hPSC-derived ידרשו monolayers של תאים מובחנים במקום EBS המצופה. לכן גם בדקנו האם ספירות תאי neuroectodermal משוערות ביום 4 לפרוטוקול (איור 2, באמצע) יכולות להיות מנותקות לתאים יחידים באמצעות Accutase; לאז להיות מצופה כmonolayers. ואמנם, בציפוי את התאים בודדים של היום-4 תאי neuroectodermal, מבוטא התמיינות של התאים עצביות replated אלה מתקבל ביעילות של כ 60% (האיור 3C).
איור 1. הליך ההיווצרות EB). סכמטי של הליך היווצרות EB. יום אחד לפני התחלת differe ntiation (ד-1), השעיה של hESCs המכיל כמה אלף תאים לכל 100 μl הוא seeded לתוך בארות 96V, ואחריו צנטריפוגה. EBS נוצר בין לילה ואז מועברים לתוך בארות 96U התקשרות נמוכות במיוחד להמשך טיפול. ב ') בדיקת ההשפעות של PVA וY-27632 על היווצרות EB. היווצרות EB רק יכולה להיבחן במדיום המכיל את שני PVA וY-27632 (ראה ראש חץ) ג) למעלה:. EBS נוצר באמצעים קונבנציונליים הם בדרך כלל בגודל הטרוגנית. תחתון: EBS נוצר עם הטכניקה "ספין EB" המתוארת בא באמצעות מספרים שונים של תאי קלט, גדלי EB ניתן פיקוח הדוק והיו אחידים מאוד. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
35fig2highres.jpg "/>
איור 2. תרשים זרימת היווצרות תא עצב. יום אחד לפני תחילתו של בידול (ד-1), EBS נוצר בצלחות 96V באמצעות מדיום היווצרות EB שצוין. עם העברתו של EBS ל96U צלחות, השראה עצבית היא יזם באמצעות מדיום בידול. 4 ימים מאוחר יותר, EBS מצופים בבארות Matrigel מצופות של פורמט multiwell רצוי. מורפולוגיה הייצוג הראה לכל שלב. התמונה מהימין מציגה אוטופיות צמחה טיפוסיות עצביות מEBS המצופה - אזור צפיפות התאים הגבוה על עצם זכות היא חלק ממרכז EB מצופה ממנו את הנוירונים נוטים לגדול בצורה רדיאלית. לחלופין, ביום 4, EBS יכול להיות מנותק לתאים בודדים ומצופה יצא לבידול המסוף כmonolayers (טקסט ואיור 3C לפרטים נוספים). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. אפיון של תאי עצב). אפיון זמן האמת RT-PCR של יום 8 תרבויות עצביות בתפזורת. שים לב כי בדגימות בדיל רכס עצבי וגנים סמן הפאן עצבי היו מאוד הוגבר לעומת תאי ביקורת בלתי מובחנים. למרות שדגימות שיזמו עם 16,000 תאים הראו את הרמות הגבוהות ביותר העצביות הביטוי (לציין את קנה מידת לוגריתמים), EBS בין 4,000 עד 8,000 תאים הוכיחו שימושיים ביותר בהתבסס על קריטריונים מורפולוגיים. ב ') ברוב תאי גידול מ EBS המצופה נוירונים צביעה חיובית לבטאו טובולין III (אדום) והחושי נוירון סמן BRN3A (ירוק). C) נוירונים נוצרו לאחר ציפוי תא בודד במקום ציפוי EBS. ביום 4 לפרוטוקול (איור 2), EBS הצף היו ניתק באמצעות Accutase וזרע החוצה כתאים בודדים לאז סופנים לבדל כmonolayers. כפי שניתן לראות בצד השמאל, תאים בעלי מורפולוגיה עצבית טיפוסית שהכתימו חיובי עבור טובולין בטא שלישי התקבלו בקלות, ואילו הישרדות תא נראית ירד במקצת בהשוואה לציפוי EB. מימין: כימות Immunocytochemistry מבוסס תשואה עצבית (n = 3 סעיפים מייצגים נתחו + / - SD). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
| שם גן | רצף פריימר Fwd | רצף פריימר Rev |
| ACTB (משק בית גן) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (משק בית גן) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
הטבלה 2. Primers משמש לRT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב פרוטוקולי בידול מעורבי היווצרות EB מhPSCs, כולל ההליך שלנו שפורסם בעבר 10, מבוססים על קצירה ידנית או בסיוע של האנזים hESCs כאגרגטים, שמוביל בהכרח להטרוגניות בגדלי EB. עובדה זו מובילה לשונות ביעילות בידול עם כמה שורות תאים, ובכך הופך את הניתוח שיטתי קשה, במיוחד בקנה מידת תפוקה בינוני. יתר על כן, נתיחה ידנית היא עתירה עבודה שפוגעת בעצמו יכולת רחבה.
לעומת זאת, בשיטה המתוארת כאן מבוססת על היווצרות EB מתאים בודדים, המאפשר טיפול בתא והשתנות ממזערת בין דגימות. חשוב לציין, אנו מראים כי יכולת התמיינות לתאי עצב כללית לא נראית להיות מושפעת על ידי ייזום הפרוטוקול עם הספין EBS. יתר על כן, שמירה על EBS הפרט מופרד זה מזה באמצעות שימוש בצלחות השעיה 96-גם מונע tמכפלת מ צבירה אחד עם השני בהשעיה - המציג עדיין חסרון נוסף של ההליך הקונבנציונלי 10. כתוצאה מכך, כמות hPSCs קלט הנדרש כדי ליזום ניסוי נתון היא נמוכה בכ אחד שגם צלחת של 6-היטב עם מושבות hPSC subconfluent הוא בדרך כלל מספיק כדי ליזום בידול בשתי צלחות 96-כן. לבסוף, טכניקת EB הספין מאפשרת שליטה הדוקה על גדלי EB. לפי התצפיות שלנו, את רמות הביטוי של סמנים עצביים נוטות להגדיל במידה מסוימת עם גדלים הולכים וגדלות של EBS המצופה (איור 3 א). מצד השני, EBS גדול מדי נוטה להציג מרכזי נימקים לאחר ציפוי. לפיכך, כפשרה, מצא EBS של 4,000 עד 8,000 תאים להיות טווח מתאים.
בשל היעילות הגבוהה שלה, בפשטות, מהירות ועלות אפקטיבית, אנו צופים בשיטה המתוארת להיות פלטפורמה שימושית עבור מחקרים פונקציונליים, מחל דוגמנות דורש האנושי שלהנוירונים ensory, או מבחני תפוקה בינוניים מבוסס תא תרופתי דורשים נוירונים מכל סוג. לגבי הבקשה האחרונה, תאימות עם ניתוח אוטומטי כגון הדמיה גבוהה תוכן תהיה רצויה. זה, עם זאת, עשוי להיות בסכנה בשל העובדה שרק תאי עצב של התבגרות בפריפריה של EBS המצופה יכולים להיות מנותחים. כדי לעקוף את המכשול הזה, אנחנו גם ניסינו לייצר monolayers של נוירונים ידי dissociating EBS ביום 4 לפרוטוקול וציפוי את התאים בודדים. ואכן, הנתונים באיור 3C מראים שנוירונים נוצרו ביעילות סבירה של כ 60%. עם זאת, נצפינו ירידה בהישרדות תא בתנאים אלה, טוען כי וריאציה זו של הפרוטוקול עשויה להיחקר עוד יותר ומותאם, למשל על ידי שימוש במצע מצורף שונה. (התוספת של Y-27632 על ציפוי את היום-4 התאים בשלב 5.2 עשתה לקדם את הישרדות תא לאחר ציפוי אבל זה גם הופיע להתערב wבידול עצבי לאחר ith ולכן יש להשמיט.) יתר על כן, זה יהיה גם מעניין לחקור האם סוגים אחרים של תאי עצב יכולים להיות שנוצרו עם פלטפורמה זו, על ידי שינוי בהרכב הבינוני בשלב השני של הפרוטוקול. יתר על כן, בכל קשור להעברת EBS מ96V לתוך בארות 96U דמויות ביום 0, היה רצוי לתכנן הליך המבוסס על pipetting רב, סופו של דבר להשגת תאימות תפוקה גבוהה של השיטה שתוארה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלנק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
