Summary
Protokoll för neuronal differentiering av pluripotenta mänskliga stamceller (hPSCs) är ofta tidsödande och kräver omfattande kunskaper cellodling. Här, har vi anpassat en liten molekyl-baserad differentiering förfarande en multititre plattformat, vilket ger en enkel, snabb och effektiv generering av humana neuroner på ett kontrollerat sätt.
Abstract
Befintliga protokoll för alstring av neuroner från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) är ofta tråkiga i att de är flera steg förfaranden involverar isolering och expansion av neurala prekursorceller, före terminal differentiering. I jämförelse med dessa tidskrävande tillvägagångssätt, har vi funnit nyligen att kombinerad hämning av tre signalvägar, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 och FGF / ERK, främjar en snabb induktion av neuroectoderm från hPSCs, följt av omedelbar differentiering till funktionella nervceller. Här har vi anpassat vårt förfarande till en ny multititre platta format för att ytterligare stärka sin reproducerbarhet och att göra den kompatibel med mitten genomströmning applikationer. Den består av fyra dagars neuroectoderm bildas i flytande sfärer (embryoidkroppar), följt av ytterligare fyra dagars differentiering till neuroner enligt vidhäftande förhållanden. De flesta celler erhållna med detta protokoll verkar vara bipolära sensoriska neuroner. Dessutom,förfarandet är mycket effektiv, kräver inte speciella expertkunskaper, och baseras på en enkel kemiskt definierat medium med kostnadseffektiva små molekyler. På grund av dessa funktioner, kan förfarandet utgöra en användbar plattform för vidare funktionell utredning samt för cellbaserad screening närmar kräver mänskliga sensoriska neuroner eller nervceller av något slag.
Introduction
hPSCs bestående embryo-mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är pluripotenta vilket innebär att de kan ge upphov till olika cellinjer in vitro 1-2. Ett flertal differentierade celltyper har härletts från hESCs hittills, stöder uppfattningen att dessa celler utgör värdefulla verktyg för vetenskaplig forskning och cellbaserade metoder screening, och håll lovande för cellbaserade terapier.
Neuronal differentiering protokoll för hESCs är oftast komplexa och tidskrävande eftersom de ofta bygger på första inducerande övergripande neurala öde, följt av manuell isolering av neurala stamceller och efterföljande terminal differentiering till en viss neuron typ av intresse 3-6. I vissa sammanhang är denna komplexitet inte förvånande och oundviklig med tanke på att en sådan state-of-the-art riktade differentiering protokoll tenderar att stegvis härma människans tidiga utveckling, which är i sig mycket komplicerat. Å andra sidan kan det i en del också spegla vår brist på förståelse för de bakomliggande molekylära processer, vilket resulterar i differentiering protokoll som fortfarande långt ifrån helt optimerad.
När det gäller omvandlingen av odifferentierade hPSCs i neuroectoderm, Pera et al. fann att hämning av BMP / SMAD1/5/8 signalering ökar neural induktion av hESCs 7. Dessutom har inaktivering av SMAD2 / 3 signalering visats främja neuroectoderm bildning 8. Därför tenderar kombinerad inaktivering av dessa två vägar att leda till en effektivare neurala induktion av hPSCs 4,9. På senare tid har vi visat att en tredje signalväg, serverar FGF / ERK, som en stark repressor av de tidigaste stegen i neuroektodermala engagemang i hESCs. Omvänt samtidigt förtryck av alla dessa tre vägar leder till nästan homogent konvertering av hESCs till neuroectoderm medpå bara fyra dagar 10. Därefter var mycket effektiv terminal differentiering till funktionella nervceller observerades inom åtta dagar. De erhållna nervceller var sannolikt sensoriska nervceller i det perifera nervsystemet, vilket kan delvis förklara deras snabba härledning 10. Defekter i sensoriska neuron underhåll betraktas en orsak till vissa humana störningar såsom familjär Dysautonomia 11. För modellering sådana sjukdomar baserade på hiPSC teknik 12, för ytterligare funktionell karakterisering samt för tillämpad ändamål som inte kräver någon särskild typ av nervceller, kan denna differentiering procedur presentera en användbar grund.
Resulterade dock differentiering strategi vi ursprungligen användes inblandade bildning av embryonala organ (EBS) från klumpar av hESC kolonier 10, och detta i en ganska grad av heterogenitet avseende EB storlekar och även verkade kompromissa neuron-bildning effektivitet i vissa cell linjer. Dessutom, på grund av heterogeniteten i EB storlekar föreföll förmåga att systematiskt testa effekterna av ytterligare tillväxtfaktorer eller små molekyler under och efter neuron-bildning vara något skam.
I denna rapport har vi anpassat vår tidigare förfarande till ett medium genomströmning-kompatibel, påtvingad aggregering-baserad teknik för att generera EB i en mycket storlek kontrollerat sätt, vilket också visas i andra sammanhang 13. Därefter EB genereras i V-formade brunnar i 96-brunnars plattor överfördes till U-formade ultralåga fäste 96-brunnars plattor, för att initiera bildning neuroectoderm i suspension. Fyra dagar senare, kunde EBS pläteras ut ger upphov till terminalt differentierade neuroner med hög effektivitet och homogenitet. Alternativt, var dag-4 EB dissocieras till enskilda celler och ströks ut som sådan, vilket resulterade i låg densitet monoskikt av humana neuroner. Sammanhängande resultat hittills erhållits med två oberoende derived hESC linjer, HuES6 och NCL3.
Som en förutsättning, var framgångsrik EB bildning strikt beroende av användningen av en syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), tillsammans med ROCK hämmare Y-27.632 känt för att gynna överlevnad hESC 13-14. Som ett resultat, bildad homogenitet EBS i 96-V-plattorna förbättras avsevärt jämfört med bildningen av EBS som massa odlingar baserade på slumpmässiga dela tekniker. Detta system tillhandahåller således en betydligt förbättrad plattform för neuroectoderm bildning i suspensionsodling, följt av höggradigt kontrollerad neuron formation under vidhäftande betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Matrigel-belagda plattor och media
- Framställning av Matrigel-belagda plattor Matrigel har befunnits vara ett föredraget substrat för fastsättning av differentiering EBS och även främjar effektiv utväxt av neuroner från dessa 10.
- Tina 10 ml Matrigel över natten på is.
- Nästa dag, späd den geléliknande Matrigel med två volymer iskall DMEM/F-12 och förbereda portioner om 1 ml i förkyld 15 ml koniska rör som kan frysas vid -20 ° C.
- Besluta om en platta format för neuronal differentiering. Till exempel, som en utgångspunkt, rekommenderar vi att utföra en första omgång av differentiering i en 12-brunnsformat. Förkyla fyra 12-brunnars plattor vid 4 ° C. Lös en alikvot av fryst Matrigel genom tillsats 9 ml av pre-kylda DMEM/F-12 följt av pipettering upp och ned tills all förspädda Matrigel har tinat och löstes.
- Sedan, Överför innehållet till en ny 50 ml rör innehållande 15 ml DMEM/F-12 på is (slutlig Matrigel utspädning: 1:75). Tillsätt 0,5 ml utspädd Matrigel till varje brunn av den nedkylda 12-brunnsplattor. Wrap plattor med Parafilm och låt stå i rumstemperatur över natten.
- Nästa dag, överföra plattorna till 4 ° C. Belagda plattor kan lagras under flera veckor före användning.
- Media
EB-bildning medium (~ 15 ml som behövs för att utföra differentiering i en 96-brunnsplatta - se tabell 1 och schema i figur 2):
DMEM/F-12 med 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 iM Y-27.632
1x PenStrepGln
Differentieringsmedium (~ 30 ml för att utföra differentiering i en 96-brunnsplatta, följt av neuron-bildning i en Matrigel-belagda 12-brunnars platta, se tabell 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 pM PD0325901
15 iM SB431542
0,5 pM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Tvingad EB Bildning
- Odla hPSCs under dina önskade matare-fria förhållanden. Vi använder MEF-konditionerat medium på Matrigel-belagda 6-brunnsplattor 15. Bör dock andra kultur system såsom hemgjord eller kommersiellt definierade medier fungerar också. Vid tidpunkten för att starta en differentiering experimentet bör hPSCs vara sub-sammanflytande och aktivt växande.
- Mekaniskt bort spontant differentierade kolonier med en steril plast pipettspets under ett stereomikroskop.
- Tvätta återstående odifferentierade kolonier med PBS och smälta till enskilda celler med hjälp Accutase innehåller 1X Y-27.632. Pelletera enstaka celler genom centrifugering vid 200 x g under 2 minuter, återsuspendera i en liten volym av EB-bildning medium och bestämma cell-titer med användning av en hematocytometer.
- Tillsätt en mängd av celler tillden återstående EB bildningen mediet för att resultera i en titer mellan 40.000 och 80.000 celler per ml.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett 100 pl per brunn till en 96V-bottenplatta, vilket resulterar i 4.000 till 8.000 celler per brunn. Spin 96-brunnsplatta i en swing-out plåt centrifug vid 400 xg under 1 min för att uppsamla celler på botten av brunnarna, och överföring till cellodling inkubator. EB bildar natten, såsom visas i figur 1.
3. Neuroectoderm Induktion
- Nästa dag (dag 0), samla EB från 96V platta under en stereo mikroskop och överföring i en liten volym i en 3,5 cm bakteriell skål innehållande 2 ml differentiering medium. Skaka försiktigt skålen i flera sekunder för att tvätta EBS.
- Tillsätt 100 | il av differentiering medium per brunn i en ultra-låg-fastsättning U-botten 96-brunnars platta. Under ett stereomikroskop, överlåtelse EB i små volymer från tvätt skålen i 96U-brunnar (en EB per vill). Placera 96U plattan i cellkultur inkubator under 4 dagar för att möjliggöra neuroectoderm bildas.
4. Neuron Bildning
- På dag 4, förbereda en tvätt skål som i steg 3,1 och dessutom ersätta DMEM/F-12 i en förvärmd Matrigel-belagda 12-brunnar genom differentiering medium (1 ml per brunn).
- Utstrykning av EB
- Samla EB från 96U platta, tvätta dem enligt ovan, och försiktigt frö dem en efter en i brunnar i Matrigel-belagda 12-brunnar (ca 8 EB per brunn): EBS jämnt ska fördelas mellan brunnarna så att ostört utväxt av nervceller under de närmaste dagarna (se "dag 5" bilden i figur 2).
- Före överföring av den 12-brunnars plattan tillbaka i inkubatorn, låt EB att löst fästa i cirka 10 minuter vid RT. Sedan försiktigt överföra 12-brunnar till cellodling inkubator. Nervceller växer ut från pläterade EB i radiell sätt inom de närmaste 4 dagarna, shown i figur 2 ("dag 8" bilden till höger).
5. Neuron Bildning som Monoskikt
- Som ett alternativ till stegen punkt 4), vid dag 4 av förfarandet, samla EBs i en 3,5 cm bakteriell skål innehållande 2 ml differentieringsmedium, sedan överföra EBs i en liten volym till en PBS-innehållande skålen, och sedan in i annan skålen innehåller Accutase.
- Låt smälta till enstaka celler, centrifugera vid 200 x g under 2 minuter, återsuspendera i en liten volym av differentiering medium och bestämma cell-titer med användning av en hematocytometer. Justera titer till 1-2x10 6 celler per ml med differentiering medium (utan Y-27.632).
- Plate celler ut i förvärmda Matrigel-belagda 12-brunnar (1 ml per brunn), och överföring till cellodling inkubator. Neuron-bildning som monoskikt observerades mellan dag 7 till 8 (figur 3C). Det bör noteras, emellertid, att denna monoskikt variant avproceduren är inte helt optimerad med avseende på cellöverlevnad och mest lämpligt substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår förra rapport, i linje med många andra, kan EBs från hPSCs genereras genom att helt enkelt replating aggregat vid rutinmässig uppdelning av hPSCs till låg-bilagor rätter 10. Detta resulterar oftast i en bred fördelning av resultatet EB storlekar (Figur 1C, överst). Ett annat problem som följer av detta är att EBS hålls suspenderade tenderar att aggregera med varandra, vilket leder till en ännu högre heterogenitet EB storlekar. För att kringgå dessa problem, försökte vi därför att generera EB genom plätering enstaka hPSCs till låg infästning brunnar i multititre plattor (Figur 1A). Detta resulterade inte i någon EB bildning och celldöd (Figur 1B, nederst till höger). Tillämpa en känd överlevnad molekyl för hPSCs gav Y-27.632, liknande resultat. Likaså tenderade tillämpa polyvinylalkohol (PVA) som tidigare har visat sig förstärka EB bildning av hESCs 16, att "samla" de hPSCs vid botten av 96V-Brunnar men ledde inte till EB bildas. Men vid kombination Y-27.632 med PVA tillskott, kunde vi lätt generera EB från encelliga suspensioner av hESCs, under kemiskt definierade villkor (Figur 1B). Lämpligen kan EB storlekar i denna multititre plattformat kontrolleras noggrant genom ympning olika antal celler per brunn, i motsats till användning av konventionella tekniker (Figur 1C, botten).
Vid ytterligare inkubation i 96V plattorna tenderade emellertid EBS att fastnar på botten av brunnarna. Därför dagen efter EB-bildning, var skyldig att överföra EBS till ultralåg bilagor 96U plattor (Figur 1A). Neuroectoderm sedan induceras i detta format med hjälp av en liten molekyl cocktail bestående av PD0325901 (FGF / ERK-hämmare), SB431542 (TGFβ/SMAD2-hämmare), och dorsomorphin (BMP/SMAD1 hämmare), som beskrivs 10. Efter neuroectoderm bildandetanvändning av denna lilla molekyl cocktail, kan EBS pläteras ut för att ge upphov till neuroner på valfritt format, förutsatt att ytor belagda med Matrigel, (figur 2). Genom att initiera EB formation med olika antal celler (Figur 1C, botten), fann vi att EBS genereras cirka 8000 celler tenderar att ge den bästa neuronal differentiering kapacitet. Denna kännetecknas av uttalade neuronala utväxter från pläterade EBS minskad nekrotiska EB centra efter plätering och högt uttryck av sensoriska och pan-neuronala markörer såsom BRN3A och β-III tubulin (figur 2 och 3A, B). De övergripande neuronal differentiering effektivitet tycks vara jämförbar med det ursprungliga förfarandet (~ 70%) (figur 3), som var tillämplig både hESCs och hiPSCs 10. Vi har hittills använt två oberoende hESC linjer, HuES6 och NCL3, i multibrunnsplatta förfarandet, medan cellinje-beroende variation i differentiation effektivitetsvinster kan i allmänhet inte uteslutas.
Flera tillämpningar av HPSC-härledda nervceller kommer att kräva monoskikt av differentierade celler i stället för pläterad EBS. Vi har därför också undersökt om förmodade neuroektodermala celler sfärer i dag 4 i protokollet (Figur 2, mitten) kan dissocieras till enskilda celler med hjälp Accutase, för att sedan ströks ut som monoskikt. Faktum vid utstrykning av enstaka celler på dag-4 neuroektodermala celler, uttalade neuronal differentiering av dessa celler återpläterade erhålles vid effektiviteter av ungefär 60% (Figur 3C).
Figur 1. EB-bildning förfarande. A) Schematisk bild av EB formationen proceduren. En dag före initiering av differe ntiation (d-1), en suspension av hESCs innehållande flera tusen celler per 100 | il ympas in 96V brunnar, följt av centrifugering. EB bildade natten överförs sedan till ultralåga fastsättning 96U brunnar för vidare behandling. B) Testa effekten av PVA och Y-27.632 på EB-bildning. EB-bildning kunde endast observeras i medium innehållande både PVA och Y-27.632 (se pil huvud) C) Upp:. EB bildas med konventionella medel är oftast heterogena i storlek. Botten: EBS bildas med "spin EB" teknik som visas i A. Genom att använda olika antal ingångar celler kan EB storlekar kontrolleras noggrant och var mycket jämn. Klicka här för att se större bild .
35fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Neuron bildande flödesschema. En dag före initiering av differentieringen (d-1), är EB genereras i 96V plattor med den angivna mediet EB bildas. Vid överföring av EBS i 96U plattor, är neural induktion initieras med differentiering medium. 4 dagar senare EB ströks ut i Matrigel-belagda brunnar i en önskad flera brunnar format. Representativa morfologier visas för varje steg. Bilden till höger visar typiska neuronala utväxter från pläterad EBS - hög celltäthet område på mycket höger är en del av pläterade EB centrum från vilken nervceller tenderar att växa ut i en radiell sätt. Alternativt på dag 4, kan EB dissocieras till enskilda celler och ströks ut för terminal differentiering som monoskikt (text och figur 3C för detaljer). Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Karakterisering av nervceller. A) i realtid RT-PCR karakterisering av dagen 8 bulk neuronala kulturer. Observera att i differentierade prover neurallist och pan-neuronala markörgener var starkt uppregleras jämfört med odifferentierade kontrollceller. Även prover inletts med 16.000 celler visade de högsta neuronala expressionsnivåerna (notera den logaritmiska skala), EBS mellan 4.000 till 8.000 celler visade mest användbara utifrån morfologiska kriterier. B) De flesta celler som växer ut från pläterade EB är neuroner färgning positiva för beta- III tubulin (röd) och sensoriska neuron markören BRN3A (grön). C) Neuroner bildades efter en enda cell plätering istället för plätering EBS. På dag 4 i protokollet (Figur 2), Var flytande EB dissocierade med Accutase och såddes ut som enstaka celler för att sedan terminalt differentiera som monoskikt. Såsom visas till vänster, celler med typisk neuronal morfologi som färgades positiva för beta-III-Tubulin erhålles lätt, medan cellöverlevnad verkade vara något minskade jämfört med EB plätering. Höger: Immunocytokemi-baserad kvantifiering av neuronal avkastning (n = 3 representativa sektioner analyserade + / - SD). Klicka här för att se större bild .
| Namn på gen | Fwd primersekvens | Rev primersekvens |
| ACTB (housekeeping-gen) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (housekeeping-gen) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPt | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tabell 2. Primrar som används för RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta differentiering protokoll där EB bildning från hPSCs, inklusive vår tidigare publicerade proceduren 10, bygger på manuell eller enzym-assisterad skörd av hESCs som aggregat, vilket oundvikligen leder till heterogenitet i EB storlekar. Detta faktum leder till variationer i differentiering effektivitet med vissa cellinjer, varigenom systematiska analyser svårt, särskilt på ett medium genomströmning skala. Dessutom är manuell dissektion arbetsintensiv som i sig äventyrar skalbarhet.
I motsats, är den metod som beskrivs här bygger på EB bildning från enstaka celler, vilket underlättar cell-hantering och minimerar variabiliteten mellan prover. Det är viktigt att vi visar att den totala differentiering kapacitet i nervceller verkar inte påverkas av att initiera protokollet med spin EBS. Vidare håller de enskilda EB separerade från varandra med hjälp av att använda 96-brunnars plattor fjädring förhindrar tfåll från att aggregera med varandra i suspension - som presenterar ytterligare en nackdel med det konventionella förfarandet 10. Som ett resultat, är mängden av ingående hPSCs krävs för att initiera ett givet experiment låg i att ungefär en brunn av 6-brunnsplatta med subkonfluenta HPSC kolonier är vanligen tillräcklig för att initiera differentiering i två 96-brunnars plattor. Slutligen möjliggör spinn EB tekniken strikt kontroll över EB storlekar. Enligt våra observationer uttrycket nivåerna av neuronala markörer tenderar att öka i viss mån med ökande storlekar av pläterad EBS (Figur 3A). Å andra sidan, alltför stor EB tenderar att visa nekrotiska centra efter plätering. Därför, som en kompromiss, vi hittade EBs av 4.000 till 8.000 celler vara ett lämpligt område.
På grund av dess höga effektivitet, enkelhet, snabbhet och kostnadseffektivitet, räknar vi med den beskrivna metoden för att vara en användbar plattform för funktionella studier, sjukdom-modellering kräver mänsklig sensory neuroner eller medium genomströmning cellbaserade farmakologiska analyser kräver nervceller av något slag. När det gäller den senare tillämpningen skulle kompatibilitet med automatiserad analys såsom hög-halt avbildning vara önskvärt. Detta kan emellertid äventyras av det faktum att endast växa snabbare neuroner i periferin av det pläterade EB kunde analyseras. För att kringgå detta hinder, försökte vi också att generera monolager av nervceller genom dissociation EBs på dag 4 i protokollet och plätering ut enstaka celler. Faktum är att data i figur 3C antyder att neuroner bildade vid rimlig effektivitet av ca 60%. Men observerade vi en minskning i cellöverlevnad under dessa förhållanden, vilket tyder på att denna variation av protokollet kan ytterligare undersökas och optimeras, exempelvis genom att använda en annan bilaga substrat. (Tillägg av Y-27.632 vid plätering ut dag-4-celler i steg 5,2 gjorde främja cellöverlevnad efter plätering men också verkade störa wed efterföljande neuronal differentiering och därför bör tas bort.) Dessutom kommer det också intressant att undersöka om andra typer av nervceller skulle kunna genereras med denna plattform, genom att variera mediet sammansättningen i den andra etappen av protokollet. Dessutom, när det gäller överföring av EBS från 96V till 96U-formade brunnar vid dag 0, vore det önskvärt att utforma ett förfarande baserat på flerkanalig pipettering, för att slutligen uppnå hög genomströmning kompatibilitet beskrivna metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
