Summary
Wir stellen ein neues Verfahren für die Pflege der menschlichen Darmschleimhaut in Kultur und Überwachung der Reaktion auf verschiedene Arten von Stimuli über mindestens 24 Stunden. Mit unserer Methode wird die Polarität des Gewebes aufrechterhalten wird, so dass für eine physiologische Stimulation über die apikale Route.
Abstract
Wenige Modelle existieren derzeit realistisch zu simulieren, die komplexe menschliche Darm Mikro-Umgebung, in der eine Vielzahl von Interaktionen stattfinden. Proper Homöostase hängt direkt von dieser Wechselwirkungen, wie sie eine ganze Immunantwort induzieren Toleranz gegen Nahrungsmittel-Antigene zu gestalten, während gleichzeitig Montage effektive Immunantwort gegen pathogene Mikroben versehentlich mit der Nahrung aufgenommen.
Intestinale Homöostase wird auch durch verschiedene komplexe Wechselwirkungen zwischen dem microbiota (einschließlich Lebensmittel-assoziierte positive Bakterienstämme) und der Gastgeber, die die Anlage / Abbau von Schleim regulieren erhalten, die Produktion von antimikrobiellen Peptiden durch die epithelialen Barriere, und die "Erziehung" der Epithelzellen Bevölkerungen, die die tolerogenen oder immunogen Phänotyp der einzigartigen, gut-resident Lymphoidzellen steuert ". Diese Wechselwirkungen sind bisher sehr schwierig, mit in-vitro-Assays zu reproduzieren gewesenentweder mit kultivierten Zelllinien oder peripheren mononukleären Blutzellen. Darüber hinaus unterscheiden sich im Wesentlichen in Mausmodellen Komponenten der Darmschleimhaut (Schleimschicht Organisation, symbiotischer Bakterien Gemeinde) in Bezug auf den menschlichen Darm. So haben Studien von einer Vielzahl von Anwendungen in der Klinik für wichtige stressbedingten oder pathologischer Zustände, wie Reizdarmsyndrom, entzündliche Darmerkrankung oder Darmkrebs gebracht schwierig durchzuführen.
Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein neues System, das uns zu den Explantaten der menschlichen Darmschleimhaut, die ihre in situ Konditionierung behalten durch den Host Mikroflora und Immunantwort zu stimulieren, in einer polarisierten Mode ermöglicht. Polarized apikalen Stimulation ist von großer Bedeutung für das Ergebnis der ausgelösten Immunantwort. Es hat sich wiederholt gezeigt, dass die gleichen Reize können ganz unterschiedliche Reaktionen hervorrufen, wenn sie das Gesicht der apikalen Darm epi umgehenEndothel, anregend Epithelzellen basolateral oder in direkten Kontakt mit Lamina propria Komponenten, Schalt den Phänotyp von tolerogenen um immunogen und unnötige und exzessive Entzündung in der Umgebung.
Wir erzielten polarisierten Stimulation durch Kleben eine Höhle Zylinder begrenzt die Fläche der Stimulation auf der apikalen Seite der Schleimhaut im Protokoll beschrieben. Wir haben dieses Modell zu prüfen, unter anderem, unterschiedliche Auswirkungen von drei verschiedenen Laktobazillen-Stämme. Wir zeigen, dass dieses Modell sehr leistungsfähiges System, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von Probiotika bei gesunden und Krankheitszuständen beurteilen.
Protocol
1. Beziehen und Vorbereiten des Tissue
- Tissue (gesund oder IBD Schleimhaut) wird während der Operation erhalten. Sobald die Probe Transfer zum Labor herausgeschnitten so bald wie möglich, indem sie es in Ca + + / Mg + +-freiem HBSS-Puffer mit Pen / Strep bei 4 ° C oder auf Eis ergänzt.
* Die Größe der Probe hängt von der Verfügbarkeit des Gewebes: die Teil des Gewebes erhalten, ist streng, was nicht für die Diagnose benötigt und kann stark variieren zwischen gesund und IBD Themen. Gesundes Gewebe wird von Patienten, die operiert für Darmkrebs ausgeschnitten.
- Waschen Sie das Gewebe schonend und reinigen aller mesenterialen Material. Trennen der Schicht von der Schleimhaut Submukosa mit sterilen Scheren und Zangen, während das Gewebe in HBSS-Puffer in einer Petrischale (nicht getaucht). Berühren Sie die Oberfläche der Schleimhaut mit der Zange so wenig wie möglich.
- Cut Schleimhaut in Streifen mindestens 1 cm breit und so lang wie möglich. Verwenden Sie zwei sterile Skalpelle, viel, als ob Sie Ihre Lebensmittel schneiden wurden.
- Waschen Sie reinigen sanft Schleimhaut in HBSS und erweitern sie auf einer Petrischale mit der apikalen Seite nach oben zeigt.
2. Montage des Tissue
- Bereiten Sie frisches Medium (tisDMEM). Verwenden DMEM mit Glutamin (2 mM) und NaPyr (1 mM) ergänzt, und fügen Sie 15% FBS-Na (Fetal Bovine Serum - North American), 1% ITS-X und 200 ng / ml EGF zum Zeitpunkt der Verwendung.
- Füllen Sie eine 10 cm Petrischale mit dem Rest der FBS-Na (verwenden Sie etwa 30 ml, so dass Metallgitter vollständig untergetaucht werden) und tauchen die Metallgitter. Halten Sie die Platte öffnen und unterstützt die Kunststoff-Zylinder auf seinem Hahn.
* Die Metallgitter sind aus Eisen hergestellt. Das Netz ist quadratisch mit einer Seitenlänge von 0,5 mm.
- Take 3 ul chirurgische Kleber mit einem 10 oder 20 ul Pipette. Wenden Sie es sorgfältig, um eine der Grenzen eines Kunststoff-Zylinder, während es fIRM mit der Pinzette.
- Sanft legen den Zylinder auf der apikalen Seite der Schleimhaut möglichst nahe an einem der Ränder des Streifens wie möglich.
- Um die Zeit zu geben, kleben fest an den Zylinder auf dem Gewebe, bereiten Sie das Zentrum gut Organkultur Platte: Dosieren 850 ul-1 ml Medium im Zentrum gut und unterstützen die Metallgitter an den Kanten der Platte zentralen gut.
- Schneiden Sie überschüssiges Gewebe von den Grenzen des Zylinders mit zwei sterile Skalpelle wie zuvor.
- Heben Sie den Zylinder mit dem beigefügten Gewebe und platzieren Sie den basolateralen Seite auf dem Metallgitter in der Mitte der Platte.
3. Stimulation
- Verwenden Sie die Reize Ihrer Wahl in Ihre bevorzugte Konzentration.
- Tragen Sie geeignete Volumen in der Mitte des Kunststoff-Zylinder ohne die Zylinder oder die Schleimhaut mit der Pipettenspitze. Stellen Sie sicher, dass Ihre gewählte Lautstärke gleichmäßig bedeckt die Oberfläche im Inneren des Zylinders. Indicated Bände:
Große Kunststoff-Zylinder: 200 ul
Medium Kunststoff-Zylinder: 100 ul
Kleine Kunststoff-Zylinder: 50 ul - Inkubieren für 3 Stunden in einem üblichen Brutschrank.
* Wenn Sie sich für längere Zeit Punkte brüten wollen, verwenden Sie unbedingt einen viel kleineren Volumen von Reizen (10-20 ul) und direkt zu platzieren das Gewebe in einer Atmosphäre von 100% O 2 in der Druck von 1 Atm (siehe 3.5) .
- Nehmen Sie das Medium mit den Reizen aus der apikalen Oberfläche des Gewebes und nicht mit frischem Medium REPLACE, weil das Gewebe nicht genug bekommen O 2, wenn eine dicke Schicht des Mediums auf der apikalen Gesicht verhindert Gasaustausch. Cover der Platte.
- Legen Sie das Gewebe in einer Atmosphäre von 100% O 2 in der Druck von 1 Atm.
4. Ernten
- Nach 24 Stunden der gesamten Kulturzeit (± 2,5 Stunden) vorsichtig den Zylinder von the Gewebe mit Hilfe eines Skalpells leichtem Schaben Klebstoff aus und speichert sie in Abhängigkeit von der gewünschten Analyse (fix für die Immunhistochemie und / oder Immunfluoreszenz oder Schnellfrostmedium in flüssigem N2 für die RNA-Reinigung und Genexpressionsanalyse oder Proteinreinigung und Western-Blot-Assays ).
- Ernten Sie die basolateralen Medium für Cytokinsekretion Profilierung. Zentrifuge bei 8.000 rpm für 7 min zur Pelletierung Schutt, den Überstand in ein Eppendorf-Röhrchen (alternativ Aliquot) und sofort bei -20 ° C lagern
* Wenn Sie Überstände länger behalten möchten, speichern Sie sie bei -80 ° C
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Representative Results
Es gelang uns bei der Erhaltung gesunder und IBD menschlichen Darmschleimhaut in Kultur für mindestens 24 Stunden die Erhaltung des Wohlbefindens des Gewebes. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen 1 war dies nur möglich, wenn die Mehrheit der Kultur der Zeit (mindestens 85% der Gesamtmenge) fand im O 2, wenn das Gewebe nicht für 24 Stunden in herkömmlichen Inkubatoren (Abbildung 2) zu überleben. Wir haben auch gezeigt, dass die verschiedenen Reaktionen der Explantate auf diesem Modell in Abhängigkeit von der Polarität der Stimulation (apikalen vs basolateralen) und die Immunogenität der Reize 2,3 beobachtet werden kann.
Über dieses Protokoll, zeigen wir, dass verschiedene probiotische Stämme können unterschiedliche Reaktionen auf das Gewebe ist Teil entlocken. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 erwies sich als überraschend immunogen auf gesundes Gewebe. Im Gegensatz zu den beiden anderen Laktobazillen-Stämme, nicht nur sie induzieren die Migration von lymphatischen Zellen Stationen die oberste Oberfläche der Schleimhaut, sondern auch deutlich ein Chemokin relevant zu dieser Migration CCL4 sowie IL-1b, ein Zytokin traditionell pro-inflammatorische Aktivität bezogen hochreguliert. Zu unserer Überraschung, obwohl wir zuvor eine präventive Wirkung von L. beobachtet paracasei in einem Mausmodell der Colitis 4, hat dies nicht zu einer Heilwirkung übersetzen, wenn lebenden Bakterien dieses Stammes auf die entzündete Gewebe aufgebracht IBD wurden. Vielmehr erwiesen sich alle drei Stämme nachteilig, wenn es auf IBD Schleimhaut in der akuten Phase der Krankheit 2 verwendet.
Weiterhin zeigten wir, dass das Stoffwechselprodukt eines probiotischen, genannt postbiotic, fähig Abschirmung gesunden Epithel gegen eine eher invasive Salmonella-Stamm (FB62) ist, während gleichzeitig zu einer signifikanten Verminderung Entzündung wenn auf IBD Schleimhaut 2 aufgebracht.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Set-up und Fotos. Ein. Schematische Darstellung der Einrichtung von der Seite betrachtet, b. Schematische Darstellung der Einrichtung von oben, c angesehen. Foto der Metallgitter als Unterstützung für verwendet das Explantat. Wenn richtig eingesetzt, wird nur der basolateralen Seite in Kontakt mit dem zentralen Medium Kammer, d. Foto des gesamten Ensembles. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Das Gewebe nur überlebt Kultur in O 2. Ein. Uncultured Gewebe, bei der Ankunft aus dem Operationssaal fixiert,
Abbildung 3 Die Wirkung einer pro-inflammatorischen Reiz auf den Explantaten C-: Unstimulierte Gewebe für den angegebenen Zeitpunkten kultiviert; Sal:.. Tissue mit Salmonella herausgefordert und kultiviert für den angegebenen Zeitpunkten. Die Zerstörung der oberen Schicht des Epithels bereits sichtbar 2 Stunden. Das Explantat präsentiert umfangreiche Degeneration nach 24 Stunden. Original-Vergrößerung: 10x.
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Discussion
Der Bedarf an physiologisch relevanten Modelle, auf denen Behandlungen für den menschlichen Darmschleimhaut wirksam getestet werden seit langem betont. Viele Forscher haben potentielle Artefakte und Defekte in den beiden Zellen 5 und 6 Mausmodellen bisher für diesen Zweck verwendet identifiziert. In der Tat, obwohl vielversprechende präklinische Daten oft erhalten wird, diese nur selten zu signifikanten klinischen Nutzen übersetzen.
Das Verfahren in dieser Arbeit beschriebenen, stellt eine relativ einfache, aber effektive und neuartige Anpassung an vorhandene Protokolle 7, 8 für die Kultur und die Förderung der menschlichen Darmschleimhaut Explantate in einer polarisierten Mode.
Dieses Modell könnte eine ausgezeichnete komplementären Ansatz zur Erzeugung von gültigen präklinische Daten, bevor sie eine mögliche Behandlung jeglicher Art zu den Kliniken bieten. So konnte unglücklichen klinischen Ergebnisse 9 potentiell vermieden werden und Forscher konnten mehrsicher fördern Behandlungen zu den Kliniken für die Behandlung von akuten entzündlichen Erkrankungen.
Die wichtigsten Vorteile des Modells sind die Möglichkeit, polarisiert versus nicht polarisierten Anregung zu vergleichen und das Gewebe die Antwort über eine 24-Stunden-Zeitfenster folgen. Ein sehr wichtiger Parameter ist, dass in jedem Experiment wurden die verschiedenen Behandlungen auf Explantate aus dem gleichen Patienten, die unter Berücksichtigung der Variabilität zwischen Patienten können angewendet werden. Die Tatsache, dass die Explantate von einer relativ großen Größe im Vergleich zu Biopsien sind auch bedeutet, dass eine Vielzahl von Analysen auf der gleichen Explantat durchgeführt werden kann, was bestätigt, ergeben sich viele verschiedene Arten (ELISA-Assays quantitativ rtPCRs, Mikroarray-Analysen, Immunhistochemie und / oder Immunfluoreszenz Daten). Ferner könnten auch andere Arten von Analysen in der Zukunft optimieren, wie z. B. Reinigung von Zellpopulationen von Interesse angeregt Explantate, die Auswertung der Phänotyp durch cytofluorimetric Analysesis.
Es gibt jedoch auch wichtige Einschränkungen berücksichtigt werden. In der vorliegenden Form dieses Modell eignet sich nicht für das Hochdurchsatz-Screening einer großen Anzahl von Anwendungen, da es über die Verfügbarkeit des Gewebes abhängt. Zellkultur-Modelle sind wahrscheinlich besser geeignet für diesen Zweck, da sie einfacher zu handhaben und führen eine große Anzahl von Stimulationen am 10. während das Modell beschreiben wir wäre effizienter genutzt als End-Tests von Kandidaten Behandlungen vor dem Eintritt in die Kliniken sind. Darüber hinaus lässt der Zeitraum, in dem es uns gelungen, die Lebensfähigkeit des Gewebes zu bewahren haben nicht für Versuche, die lange Beobachtungszeiträume, wie RNA-Interferenz zu ermöglichen. Schließlich wird die bakterielle Stimulation in einem regelmäßigen Brutschrank und nicht für den Erhalt oder die Prüfung der Wirkung von anaeroben Bakterien zu ermöglichen. Es ist unsere Absicht, auf diese Probleme in der Zukunft zu arbeiten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Erika Mileti für hervorragende technische Unterstützung und Dr. Antonio Di Sabatino für die Bereitstellung der Sauerstoff Kammern.
Finanzierung: und Fondazione Cariplo zu MR und Unterstützung durch einen internationalen Marie-Curie Training Mobilität Netzwerk (Cross-Talk, Finanzhilfevereinbarung Nr.: 21553-2) an: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 7. EU-Rahmenprogramm (Dendroworld IBDase, ERC) unterstützt KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
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