Summary
通过使用所描述的方法分离和鉴定人牙髓干的细胞（hDPSCs）
Abstract
Introduction
干细胞是细胞克隆细胞具有两个显着的特点，被称为多潜能和自我更新15。在所有的干细胞不同的复制效力，牙齿干细胞的产后干细胞引起的关注，近年来，因为其可访问性，可塑性强，高增殖能力比较与其他成体干细胞16。典型地，类似的间充质干细胞，牙髓干细胞粘附的克隆形成有多个成间充质细胞的分化能力和/或非间充质细胞谱系，无论是在体外和体内的细胞，这些细胞。1-8,17,18稳干细胞鉴定阴性表达造血抗原（ 如 CD45，CD34，CD14），阳性表达的CD90，CD29，CD73，CD105，CD44和STRO-1。19,20
容易获得潜在的疼痛和发病率最低，作为一个有价值的人DPSCS能源间充质干细胞相比普通的来源，如骨髓间充质干细胞21。在一般情况下，稳干细胞已被分离由任何生长的方法， 即 ，从的牙髓组织外植体（DPSC-OG）22-24，和/或酶消化4,6,25（DPSC-ED）的干细胞的迁移。以往的研究表明，隔离方法和培养条件下，可以吸引不同的人群或谱系体外通道26,27。在的箱子恒牙（pDPSCs），Huang 等人透露，酶消化pDPSCs超越全部牙髓之中相比，有较高的增殖潜力，26此外，在箱子乳牙（dDPSCs），它表明一个STRO-1及CD34的标记表示在比较更多的dDPSC-ED与dDPSC-OG。此外，dDPSC-ED显示定义的骨/ odonto介质的高矿化率在27因此，由于出色的潜力DPSCS在regenerative药，将有更多的研究，以更好地了解可能来自不同的隔离方法不同人群的需要。
在这里，它是尝试引入纸浆提取的简单的方法，通过使用一步牙科金刚石盘以方便处理纸浆提取。此外，在申请ED或OG方法的人牙髓源性干细胞的分离，两组间的一般特性及分化能力进行了调查。
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Protocol
1。准备的酶液和增殖培养基（PM）
- 车型胶原酶类型I解：称出I型胶原酶（12毫克/毫升），并溶解在1ml PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在-20℃，直到需要。
- 使分散酶解：称取分散酶（16毫克/毫升），并溶解在1毫升的PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在4℃直至需要。
- 酶溶液：加入到2毫升无菌PBS中含有100毫克/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素1毫升胶原酶I型溶液（12毫克/毫升）和1毫升分散酶解决方案（16毫克/毫升）。最终成交量为纯净和胶原酶我总含量应为4毫克/毫升和3毫克/毫升，容易接受。然后，分装到4个15毫升的试管，每片含1毫升酶溶液。此卷每个管可以用于一个纸浆的蒸解。
- 使清洗溶液：加入100毫克/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素的PBS中。
- 车型基本培养基：阿尔法修改的Eagle培养基（α-MEM），补充有10％FBS及100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素。
- 设为的扩散介质（PM）：阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）辅以10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升0.25毫克/毫升链霉素，两性霉素B。
- 车型牙源性媒体：阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）补充有10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素，0.01μM地塞米松，5mM的β-甘油磷酸，1.8 mM的磷酸二氢钾。
2。准备人牙髓组织中牙髓干细胞Isolatio的Ň
- 正常的人类第三磨牙的成年人（21-29岁）下认可的机构审查委员会（IRB）的伊玛目阿里在牙科诊所。
- 牙齿被置于基本培养基（α-MEM培养基补充有10％FBS），在4℃下，并转移到实验室
- 在无菌条件下，一个生物危害的层流罩内工作，设置被完成一个100毫米的培养皿中，以被处理的每个齿。齿面，用70％乙醇清洗。
- 虽然工作在一个培养皿，牙齿保持的牙科镊子和一个手术刀，清洁碎片和牙周膜的根上。
- 釉牙骨质交界处慢慢减少使用消毒的牙科盘揭示牙髓腔。它应该被认为必须缓慢进行，切割过程中的牙齿组织，以减少过热。
- 轻轻分开的牙冠和牙根的牙髓组织。 牙髓组织切成小块与援助的手术刀刀片。
3。人牙髓隔离的
- 牙髓组织进行的hDPSCs隔离的牙髓组织的外植体牙髓组织或细胞直接产物无论是酶解。
- 牙髓组织的酶分解：
- 牙髓组织的小片的酶溶液在37℃下1小时，转移到涡，每30分钟到分手组织。
- 后来被拆除，大细胞聚集和单细胞悬浮液，通过细胞通过一个70μM细胞的过滤器。
- 单细胞悬浮液，在1,200 rpm下离心5分钟，在室温下。
- 上清液仔细移液和沉淀物重新悬浮在1ml的增殖培养基（PM）的。 （ 注：FBS增殖培养基终止酶的显示解离）。
- 单细胞悬浮液接种到25cm 2的培养瓶中用PM牙髓，然后在5％CO 2在37℃下孵育。
- 培养基中被改变，直到细胞汇合实现每三天。
- 直接从牙髓组织的外植体细胞的产物：
- 牙髓组织切碎成1-2毫米的碎片，每片被放置在个25-cm 2培养瓶中用PM，然后温育在37℃下在5％CO 2。它应被视为细胞产物，总体积的PM必须支持进一步的细胞生长（2-3毫升按每烧瓶）的纸浆片的安装。
- 换液后的产物观察。
- 超越在汇合的细胞子的比率为1:4（通道1）培养。
4。免疫表
- 250,000细胞/管的这两种类型的细胞在通道3由PE或FITC标记的抗人用自己的同种型的抗体温育30分钟，于4℃下在黑暗的地方。 （ 注：施加的抗体浓度根据制造协议。）
- 的孵育时间后，加入100μlPBS或FACS稀释液加入到每个试管中，并在1,200 rpm下离心5分钟，在黑暗的地方。
- 除去上清液与沉淀物重新悬浮于100μl的PBS或FACS稀释在黑暗的地方。
- 有针对性的表面标志物（CD标记）BD FACSCalibur进行了评价。
5。矿化细胞诱导分化的DPSCS量化的茜素红S含量
- 牙髓组织任酶解（称为作为DPSC-ED）或直接的细胞生长自牙髓组织的外植体（DPSC-OG），通过以下方式获得的全部牙髓之中子培养第3代。
- 一吨第3代，将细胞种子到6孔板中，以5,000细胞/孔。
- 在60％的汇合，牙源性介质取代以往的PM。三个孔作为阴性对照，加入生长培养基中保持。
- 换液，每3天至21天。
- 在第21天，将细胞用PBS洗涤，1ml /孔，在室温下的15分钟的10％多聚甲醛固定。
- 然后，多聚甲醛，用移液管关闭，仔细和细胞洗涤3次（每次5-10分钟）用蒸馏水，H 2 O。 （ 注：避免干扰单层。）
- 在洗涤后，1ml /孔茜素红S中加入在室温下20分钟。
- 由去离子H 2 O 4次（每次5分钟，用温和的摇摆）洗涤细胞以除去任何额外的茜素红。
- 1ml /孔中加入H 2 O，以防止细胞干燥。
- 板被假定为视觉插件pection和/或图像采集。
- 茜素红S的定量测定对于由1毫升10％乙酸到6孔板与在室温下振摇孵育30分钟的各孔中，H 2 O取代。
- 然后，单层细胞/孔分别为刮＆醋酸及细胞被转移到单独的1.5毫升微量离心管。 （ 注：每口井应该转移到一个单独的管即三个测试井和三个控制井为每个ED＆OG组。）
- 管被涡旋大力，持续30秒。
- 加热至85℃，持续10分钟。 （ 注：为避免蒸发，管密封，封口膜）。
- 加热结束后，将试管转入冰浴5 min。 （ 注 ：管不应该被打开，直至成为冷却）。
- 浆料在20,000 xg离心15分钟，离心分离。在离心过程中，茜素红的标准了。
茜素红S的标准制备首先通过的稀释缓冲液稀释，及用于基于该表的2 - 倍系列稀释。
| 高浓度范围内的染料 | 低浓度范围内的染料 | ||||||||||||
| 2毫米 | 1毫米 | 500μM | 250μM | 125μM | 62.5μM | 31.3μM | 15.6μM | 7.8μM | 3.9μM | 1.9μM | 0.9μM | 0.4μM | 空白 |
- 离心后，被转移到新的，独立的1.5毫升微量离心管1毫升上清液/管。
- 将pH中和〜375微升10％氢氧化铵，按每管的。 （ 注：pH值的愤怒应该是4.1-4.5）。
- 一个不透明的壁透明底96孔板中加入150μl的标准样品（包括单独的测试及控件）。
- 读出在405nm处的吸光度，并从样品的OD值相比，标准样地，作进一步的分析。
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Representative Results
- 酶解（DPSC-ED）是通过以下方式获得的全部牙髓之中这里示出在第10天，15,18（图1）。发起的菌落上形成几乎为3至5天之后，隔离。
- 超越DPSCS（DPSC-OG），如图2所示。成纤维细胞样细胞开始从牙髓组织迁移到烧瓶平行订购了近5天播种后5天，10日，13日及18。
- 全部牙髓之中使用这两种方法在通道3的图3中所示，这两种类型的稳干细胞几乎相同的大小及形态。
- 免疫DPSC-ED和DPSC-OG（图4）中的结果，这些结果表明的存在的间充质干细胞的标志物，例如CD44，CD73，CD105和CD90，和没有造血及内皮标志物，例如CD34，CD45及CD11b表达的情况下。 DPSC-OG比较DPSC-ED的表达CD105和CD146（血管周围的标记）。STRO-1呈阴性两组。 （蓝线OG组，而红色线，黄线表示简称ED 1亚型）。
- 茜素红S的表面形态，DPSC-ED和DPSC-OG矿化组织的形成，在第21天的评价的定量结果示于图5。红色越吸收更多的钙沉积。这些结果表明，更多的钙沉积在分化DPSC-ED（D）DPSC-OG（三）比较。 （一式三份的技术重复）量化的茜素红S还表示有显着性（*）较高浓度的染料DPSC-ED之间的比较，与OG组。 （染料浓度也增加显着（**，***）之间，各组的测试与控制（ED或OG）表示的钙沉积后的分化过程）
（ 注：一个配对t检验分析来确定的不同之处诱导分化后的矿化基质生产量ED和OG组。结果表示为平均值±标准差。 （的意义假定为P <0.05）
- QPCR成牙本质细胞和矿化有关的基因的表达（DSPP）和（MEPE），碱性磷酸酶（ALP），在有区别的DPSC-ED＆DPSC-OG的是图6中所示的结果，这些结果表明，显着上调ALP＆MEPE分化后的ED和OG组。同时，ALP和MEPE的表达明显有区别的DPSC-ED相比差异化DPSC-OG。然而，没有任何区别表达DSPP在两组（管家基因：酪氨酸3-monooxygenase/tryptophan 5 -单加氧酶激活蛋白（YWHAZ））之间的分化的细胞。28
（ 注：QPCR数据进行了分析比较CT方法。一个PA IRED的t-检验分析是用来确定ED＆OG前和分化后的基团，并且分化的细胞的两组之间的差异之间的基因表达。结果表示为平均值±标准差。 （显着性假设P <0.05）（一式三份技术复制）
图1。酶法分离的，DPSC（DPSC-ED）在10日，15日及18日。放大倍率酒吧= 200微米。
图2。超越牙髓（DPSC-OG）上的第5天，第10，第13和18。放大倍率酒吧= 200微米。
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图3。超越牙髓（DPSC-OG）酶消化DPSCS的（DPSC-ED）形貌第3代。放大倍率酒吧= 200微米。 点击这里查看大图 。
图4。DPSC-ED（暗红色）和DPSC-OG（蓝色）免疫分型结果的重叠直方图。 （黄线代表同种型） 点击此处查看大图 。
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图5。茜素红S染色结果有区别的DPSC-OG（C），和有区别的DPSC-ED（D）（a）及（b）如的控制。茜素红S的量化分析显示更染料的吸收有区别的DPSC-ED相比差异化OG组（E组）。 点击此处查看大图 。
图6。 QPCR结果成牙本质细胞和矿化有关的基因的表达（DSPP）和（MEPE），碱性磷酸酶（ALP），在有区别的DPSC-ED＆DPSC-OG的。MEPE，碱性磷酸酶（ALP），＆DSPP在分化细胞中的表达比较的控制确认这两个群体分化的成牙本质（AC）。这些Results显示了显着的上调后的ALP＆MEPE的分化ED和OG组（A和B）。同时，ALP和MEPE的表达均显着较高的有区别的DPSC-ED相比，有区别的DPSC-OG（A和B）。然而，没有任何区别DSPP的表达在分化的细胞组（C）（管家基因：酪氨酸3-monooxygenase/tryptophan 5 -单加氧酶激活蛋白YWHAZ） 点击此处查看大图 。
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Discussion
该协议描述了hDPSCs牙髓使用两种方法，酶解和牙髓组织的外植体干细胞的直接产物的分离和鉴定。此外， 在这些细胞的体外分化成成牙本质细胞，通过茜素红S的定量测定＆QPCR评估。
现有的协议，用于隔离从人类牙齿的牙髓组织已被用于各种仪器，如钳子（骨镊子）9，摘除手术中，针29，格雷西刮匙30，牙科裂缝毛刺4，等，这些方法是耗时的，而考虑水平低纸浆通过连续加入水过热。然而，在目前的技术中，牙科用金刚石圆盘用于牙髓组织的隔离，这是一种快速的方式来减少一个步骤的过程中以最小的污染的齿，并最大限度地减少的切削过程中纸浆的过热。此外，hDPSCs一个重新最后已从来没有人恒牙讨论的目的的情况下相比的成牙本质细胞分化成。比较差异化hDPSCs评估（ED＆OG组）定量茜素红S的分析表明，较高的矿化潜力的hDPSC-ED与OG组相比。这些结果也证实了QPCR。 DSPP，ALP和MEPE的矿化标记上调后的成牙本质细胞分化在这两个群体。另一方面，MEPE和碱性磷酸酶（ALP）的表达均高于，在分化hDPSC-ED比的控制。在乳牙的27协议与以前的研究中，使用ED OG隔离方法的恒牙干细胞的分化也表现出类似的行为，在同等条件下。此外，为了更好的比较性评价，在这项研究中，无论hDPSC ED＆hDPSC的-OG中分离出从同一个人。
表达式的MSC标记d为没有的heamatopietic /内皮标志物识别两种类型的hDPSCs作为间充质干细胞。另一方面，CD 105/146 CD DPSC-OG中高比教育署基团。尽管现有的证据STRO-1在牙髓31的存在下，根据我们的研究结果表明，STRO-1不表达在两组。然而表面标志物的表达在不同的研究中，显着的多样性可能是由于无论是种植条件，如通道数，媒体组成的，不同的捐赠者或个体之间的差异。 STRO-1的情况下，在这两个群体可能表明该标记物的表达，可能不会直接影响成牙本质细胞的分化潜能（未示出在视频）。
不同hDPSCs隔离条件可能会带来不同的分化能力。这些差异可能是由于不同人群中存在的牙髓组织。因此，选择分离法MIG羟色胺是有用的组织有针对性的具体的修复与再生为今后的临床方法。我们的研究结果表明，高矿化能力的酶消化DPSC的超越。然而，需要额外的研究，如形成管状结构， 在体内和在体外的评估，以确定这两个程序是适用于功能牙本质/牙髓组织再生疗法。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢博士的莱拉Shakeri博士阿雷夫Dournaei的关键铁饼和穆罕默德·礼萨·哈德姆谢里夫先生为他的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
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