Summary
のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法
Abstract
Introduction
幹細胞は、マルチ効力と自己再生15として知られている2つの顕著な特徴を持っているクローン原性細胞である。異なる複製効力を持つすべての幹細胞のう ち、生後幹細胞などの歯科幹細胞は、それらのアクセシビリティ、可塑性、および他の16の成体幹細胞と比較して高い増殖能力を近年注目を集めている。特徴的には、間葉系幹細胞と同様に、歯髄幹細胞は、複数の分化間充織に能力および/ または in vitro および in vivo の両方において非間葉系統を持って付着クローン原性細胞である。1-8,17,18 DPSCsが特定される彼らの造血抗原の陰性発現（ 例えば 、CD45、CD34、CD14）、およびCD90、CD29、CD73、CD105、CD44およびSTRO-1の陽性発現。19,20
最小痛み＆罹患率との容易な得られた電位は貴重として人間DPSCsを作るMSCのできる源は、骨髄間葉系幹細胞21として普通のソースに比べて。一般的に、DPSCsは伸長法、 すなわち 、歯髄組織外植片からの幹細胞の遊走（DPSC-OG）22から24、および/ または酵素消化によって（DPSC-ED）の4,6,25のいずれかの方法で単離されている。これまでの研究では、単離法と培養条件は 、in vitro の通路26,27 内で異なる集団または系統を誘導できることが示されている。永久歯（pDPSCs）の場合では、Huang らは、酵素消化pDPSCsが手狭DPSCsに比べて高い増殖能力を持っていることを明らかにした。また26は 、乳歯（dDPSCs）の場合、それが実証されたそのSTRO-1とCD34マーカーはdDPSC-OGと比較してdDPSC-EDの続きを表明した。また、dDPSC-EDは、定義された骨/ odonto培地で高い無機化速度が表示されていましたので27によりrのDPSCsの傑出した電位にegenerative薬は、より多くの研究は、異なる分離方法に由来している可能性のある様々な集団をよりよく理解するために必要となります。
ここでは、パルプ抽出のプロセスを容易にするためのワンステップデンタルダイヤモンドディスクを使用することにより、パルプ抽出の簡単な方法を紹介する試みであった。また、EDまたはOGの方法を適用することにより、ヒト歯髄由来幹細胞を単離した後、両群間の一般的なプロパティと分化能についても検討した。
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Protocol
1。酵素溶液及び増殖培地（PM）を準備
- コラゲナーゼI型溶液を作る：コラゲナーゼI型（12 mg / ml）を秤量し、0.2μmのシリンジフィルターを用いて1mlのPBSとフィルターで溶解する。それを15 mlチューブを配置し、必要になるまで-20℃で保管してください。
- ディスパーゼ溶液を作る：ディスパーゼを秤量（16 mg / ml）と1mlのPBSとフィルターが0.2μmのシリンジフィルターを使用して溶かす。それを15 mlチューブを配置し、必要になるまで4℃で保管してください。
- 酵素液を作る：1 mlのコラゲナーゼI型溶液（12 mg / ml）と100 mg / mlのペニシリンを含む2 mlの滅菌PBSに1ミリリットルディスパーゼ溶液（16 mg / ml）を、100 mg / mlのストレプトマイシンを追加します。最終体積ディスパーゼとコラゲナーゼIの合計濃度がreceptively 4 mg / mlおよび3 mg / mlであるべきです。次に、4つの15 mlチューブ、それぞれ含む1 mlの酵素液の中でアリコートこのボリューム。各チューブは1パルプ消化を使用することができる。
- PBSに100 mg / mlのペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシンを追加：洗浄液を作る 。
- 10％のFBS＆100単位/ mlペニシリンイーグル培地（α-MEM）、100 mg / mlのストレプトマイシンのアルファ改：基本的なメディアを作成します 。
- 10％のFBS、100μMのL-アスコルビン酸-2 -リン酸、2mM L-グルタミン、100ユニット/ mlペニシリン、100 mg / mlのを補ったイーグル培地（α-MEM）のアルファ改：増殖メディア（PM）を作るストレプトマイシン、0.25 mg / mlのアムホテリシンB
- イーグル培地のアルファ改質（α-MEM）、10％FBS、100μMのL-アスコルビン酸-2 -リン酸、2mM L-グルタミン、100ユニット/ mlペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシン、0.01μMで補足：歯原性メディアを作るデキサメタゾン、5mMのβ-グリセロールリン酸、1.8 mMのリン酸一カリウム。
2。歯髄幹細胞Isolatio用ヒト歯髄組織を準備N
- 正常ヒト第三大臼歯が承認治験審査委員会（IRB）の下でイマーム·アリの歯科医院で大人（年齢21〜29歳）から収集された。
- 歯は基本培地（α-MEM、10％FBSを添加した）に入れ、4℃で実験室に移した
- 無菌状態の下で、バイオハザード、層流フード内で作業して、セットアップが各歯1 100mmペトリ皿を処理することが行われていた。歯の表面を70％エタノールで洗浄した。
- ペトリ皿の一つで働いている間、歯は抜歯鉗子によって保たれ、手術用メスの刃は、根に破片や歯根膜をきれいにするために使用された。
- セメント質·エナメル接合はゆっくり髄室を明らかにするために滅菌歯科ディスクを使用して切断した。これは、切削加工、歯科組織の過熱を低減するためにゆっくりと実行しなければならないことを考慮すべきである。
- 歯髄組織を穏やか冠と根から分離した。 歯髄組織は、手術用メスの刃の助けを借りて、小さな断片に切断した。
3。ヒト歯髄アイソ
- 歯髄組織は歯髄組織またはhDPSCsの単離のための歯髄組織外植片から直接細胞伸長のいずれかの酵素分解を受けた。
- 歯髄組織の酵素的解離：
- 歯髄組織の小片を37℃で1時間、酵素溶液中に移した組織を壊すのに役立つ渦30分毎。
- その後、大きな細胞凝集体を除去し、単細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーを介して細胞を通過させることによって得られた。
- 単細胞懸濁液を室温で5分間1200 rpmで遠心分離した。
- 上清を慎重にピペットし、ペレットを1mlの増殖培地（PM）に再懸濁した。 （ 注：増殖培地中のFBSは終了DIS酵素基群集。）
- 歯髄の単細胞懸濁液は、PMとの25cm 2の培養フラスコに播種し、次いで、5％CO 2中37℃でインキュベートした。
- 細胞のコンフルエントに達するまで培養培地は3日ごとに変更されました。
- 歯髄組織外植片から直接細胞伸長：
- 歯髄組織が1-2mmの断片にみじん切りされ、各部分がPMと25 cmの2培養フラスコに入れた後、37℃、5％のCO 2インチそれは、細胞の伸長のためのPMの総量はさらに、細胞伸長のためのパルプ片（フラスコあたり2〜3 ml）の添付ファイルをサポートしなければならないことを考慮すべきである。
- 伸長が観察された後に培地を変更しました。
- 合流手狭細胞が1:4の割合（通路1）で継代培養した。
4。免疫表現型検査
- 250,000細胞/通路3内のセルの両方のタイプのチューブを4℃暗所で30分間、PEまたはそれらのアイソタイプとFITC結合抗ヒト抗体でインキュベートした。 （ 注：抗体の濃度は、製造プロトコルに従って適用された）
- インキュベーション時間後、100μlのPBSまたはFACS希釈液を各チューブに添加し、暗所に5分間1,200 rpmで遠心分離した。
- 上清を除去し＆ペレットを100μlのPBSや暗い場所でのFACS希釈液で再懸濁した。
- 標的表面マーカー（CDマーカー）は、BD FACSキャリバーによって評価した。
5。鉱化細胞へDPSCsの分化誘導とは、アリザリンレッドSアッセイを定量化
- 歯髄組織外植片（DPSC-OG）から歯髄組織の酵素的解離（DPSC-EDとも呼ばれます）または直接的な細胞伸長のいずれかによって得られたDPSCsは3継代継代培養した。
- Aトン通路3は、細胞を5000細胞/ウェルで6ウェルプレートに種した。
- 60％の合流点に、歯原性媒体は、従来のPMに取って代わられた。スリーウェルを増殖培地を追加することにより、ネガティブコントロールとして残った。
- 媒体は21日目まで3日ごとに変更します。
- 21日目に、細胞をPBSで洗浄し、1ml /ウェルを室温で15分間、10％パラホルムアルデヒドで固定した。
- その後、パラホルムアルデヒドは、慎重にピペットし、細胞を蒸留H 2 Oで3回（各回5〜10分）を洗浄した（ 注：単層を乱さないようにしてください。）
- 洗浄した後、1ml /ウェルアリザリンレッドSを室温で20分間添加した。
- 細胞は、任意の追加のアリザリン赤を除去するために脱イオンH 2 O 4倍（優しく揺らしながらたびに、5分間）により洗浄した。
- 1ml /ウェルH 2 Oは乾燥から細胞を防ぐために追加されました。
- プレートは視覚insに想定したpectionおよび/または画像取得。
- アリザリンレッドS定量アッセイのために、H 2 Oを振とうしながら室温で30分間、6ウェルプレート＆インキュベーションの各ウェルに1mlの10％酢酸に置き換えられました。
- その後、細胞単層/井戸がスクレープ＆酢酸＆細胞の両方であった別の1.5mlマイクロ遠心管に移した。 （ 注：各ウェルは、3つの試験ウェル＆各ED＆OGのグループでは3つの対照ウェルすなわち別のチューブに転送する必要があります）
- チューブは30秒間激しくボルテックスした。
- 85〜ヒート℃で10分間。 （ 注：蒸発を避けるために、チューブをパラフィルムで密封した。）
- 加熱後、試験管を5分間氷上に移した。 （ 注 ：冷却になるまでチューブは開かないでください。）
- スラリーは、15分間20,000 xgで遠心分離した。遠心分離しながら、アリザリンレッド規格が作られたアップ。
アリザリンレッドS標準は、第一希釈緩衝液を希釈＆テーブルに基づいて、2倍希釈系列を作るために使用することにより調製した。
| 染料の高域濃度 | 染料の低域の濃度 | ||||||||||||
| 2mMの | 1mMの | 500μMの | 250μM | 125μMの | 62.5μM | 31.3μM | 15.6μM | 7.8μM | 3.9μM | 1.9μM | 0.9μM | 0.4μMの | ブランク |
- 遠心分離後、上清/管1mlの新しい独立した1.5mlマイクロ遠心管に移した。
- pHは〜375μlの10で中和したチューブあたり％水酸化アンモニウム。 （ 注：pHの怒りは4.1から4.5でなければなりません。）
- スタンダード＆サンプル（別々のテスト＆コントロールが含まれています）150μlを96ウェルプレートに不透明な壁、透明な底に添加した。
- 吸光度を405nmで読み取ったと試料からのOD値をさらに分析するための標準的なプロットと比較した。
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Representative Results
- 酵素的解離（DPSC-ED）により得られたDPSCsは10日、15,18（図1）ここに示されています。分離後約3〜5日に形成するために開始されたコロニーが。
- 手狭DPSCs（DPSC-OG）は5日、10、13＆18ページの図2に示されています。線維芽細胞様細胞は、平行播種後約5日で注文してフラスコに歯髄組織から移行し始めた。
- 両方の方法を使用して通路3でDPSCsを図3に示します。DPSCsどちらのタイプがほぼ同じ大きさと形態にあった。
- DPSC-EDとDPSC-OG（図4）の結果をイムノ。これらの結果は、CD44、CD73、CD105とCD90の間葉系幹細胞のマーカーの存在、そしてそのようなCD34、CD45とCD11bをのような造血＆内皮マーカーが存在しないことを示した。 CD105とCD146（血管周囲のマーカー）の発現はDPSC-EDと比較してDPSC-OGで多かった。STRO-1は両群ともに陰性であった。 （ED 1と呼ばれる赤い線は、黄色の線はアイソタイプを示しながら、青い線はOGグループ、呼ばれています。）
- アリザリンレッドS形態＆21日目DPSC-EDとDPSC-OGにおける石灰化組織形成の評価のための定量結果を図5に示します。もっと吸収赤い色はより多くのカルシウム沈着。これらの結果は、DPSC-OG（c）と比較して差別化されたDPSC-ED（d）の中でより多くのカルシウム沈着を示す。 （三重技術的複製）アリザリンレッドSの定量化はまたOGのグループと比較してDPSC-EDとの間の色素の有意な（*）より高い濃度を示した。 （染料濃度はまた、分化過程の後にカルシウムの沈着が示されている各グループのテスト＆コントロール（EDまたはOG）との間で（**、***）が大幅に増加した）
（ 注：対応のあるt検定分析はの違いを決定するために使用された石灰化マトリックスの量は分化誘導後にEDとOGのグループを作り出した。結果は平均値±SEMとして表した。 （有意性はP <0.05で仮定）
- 分化し、それぞれ象牙、石灰化関連遺伝子の発現（DSPP）と（MEPE、ALP）の定量PCRの結果は、DPSC-ED＆DPSC-OGは、図6に示されており、これらの結果は、ALP＆MEPEの大幅アップレギュレーションを示したEDとOGのグループの分化後。一方、ALPとMEPE式は差別化されたDPSC-OGに比べて差別化されたDPSC-EDで有意に高かった。ただし、両方のグループ（ハウスキーピング遺伝子：チロシン3-monooxygenase/tryptophan 5 -モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（YWHAZ））の間の分化した細胞でDSPPの表現に違いはありません。28
（ 注：QPCRデータを比較CT法を用いて分析したPA IRED t検定分析が分化前後、また、両群の分化細胞の間にED＆OGのグループ間の遺伝子発現の違いを決定するために使用されていました。結果は平均値±SEMとして表した。 （意義は、P <0.05に仮定）（三重技術的複製）
図1 10日目、15＆18で酵素解離DPSC（DPSC-ED）。倍率バーは=200μmである。
図2 5日目、10、13と18日DPSCsを（DPSC-OG）手狭。倍率バーは=200μmである。
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図3 DPSCs（DPSC-OG）＆酵素消化DPSCs（DPSC-ED）通路3でモルフォロジー手狭。倍率バー=200μmである。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4 DPSC-ED（暗赤色）とDPSC-OG（青）で結果をイムノのオーバーレイヒストグラム。 （黄線はアイソタイプを表します）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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差別化されたDPSC-OG（c）、および差別化DPSC-ED（d）の図5。アリザリンレッドS染色の結果は、（a）と（b）管理に言及した。アリザリンレッドSアッセイの定量化は、差別化されたOGグループ（e）に比べて差別化されたDPSC-EDの中でより多くの染料吸収を示す。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6。差別化されたDPSC-ED＆DPSC-OGでそれぞれ象牙、石灰化関連遺伝子の発現（DSPP）と（MEPE、ALP）の定量PCRの結果、。分化した細胞でMEPE、ALP＆DSPPの発現を確認したコントロールと比較して象牙芽細胞に両群の分化（AC）。これらのresultsはEDとOGのグループ（A＆B）の分化後、ALP＆MEPEの大幅なアップレギュレーションを示した。一方、ALPとMEPE式は差別化されたDPSC-OG（A＆B）と比較して差別化されたDPSC-EDで有意に高かった。ただし、両方のグループの（c）（ハウスキーピング遺伝子：チロシン3-monooxygenase/tryptophan 5 -モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質; YWHAZ）の分化細胞におけるDSPPの表現に違いはありません。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
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Discussion
このプロトコルは、2つの方法、酵素的解離と歯髄組織外植片からの幹細胞の直接の伸長を用いて歯髄からhDPSCsの単離および特性のプロセスについて説明します。また、象牙芽細胞へのこれらの細胞のインビトロ分化に 、定量的なアリザリンレッドS＆QPCRアッセイにより評価した。
人間の歯から歯髄組織を分離するための既存のプロトコルは、プライヤー（骨鉗子）9、摘出針29、グレイシーキュレット30、歯科裂溝バリ4などの低レベルを考慮しながら、これらの方法は、時間がかかるなど、様々な楽器を使用していた継続的に水を添加することによりパルプの過熱。しかし、現在の技術では、歯科用ダイヤモンドディスクをワンステッププロセスで最小汚染で歯をカットするための迅速な方法であり、切削加工時にパルプの過熱を最小限に歯髄組織の分離のために使用されます。また、hDPSCs再ようやく議論目的によるヒト永久歯の場合に比べて決してされている象牙芽細胞に分化した。量的アリザリンレッドSアッセイによる差別化hDPSCsの比較評価（ED＆OGグループ）OG群と比較してhDPSC-EDの高い無機化ポテンシャルを示した。また、これらの結果は、定量PCRで確認した。 DSPP、ALPとMEPEは鉱化マーカーとして両群における象牙芽細胞分化後にアップレギュレート。一方、MEPE＆ALPの表現は、対照と比較して差別化されたhDPSC-EDで高かった。乳歯約27以前の研究と一致して、EDまたはOG単離法を用いて、永久歯に由来する幹細胞はまた、同じ条件で同じような差別行動を示す。また、より良い比較評価のために、本研究では、hDPSC-ED＆hDPSC-OGの両方が同じ個体から単離された。
MSCのマーカーの表現D heamatopietic /内皮マーカーの不在は、間葉系幹細胞としてhDPSCsの両方のタイプを識別します。一方、CDの105/146のCDは、ED群に比べDPSC-OGの方が高かった。 DPSCs 31でSTRO-1の存在によると、既存の証拠にもかかわらず、我々の結果は、両群でSTRO-1は発現は認められなかった。ただし、別の研究では、表面マーカー発現の有意な多様性は、このような継代数、培地の組成等又は異なるドナー間の個体間変動など栽培条件のいずれかが原因であるかもしれません。両群でSTRO-1の不在は（ビデオには示されていない）このマーカーの発現が直接象牙芽細胞への分化能に影響を与えない可能性があることを示している場合があります。
異なるhDPSCs分離条件が異なる分化能をもたらすかもしれない。これらの違いは、歯髄組織内の異なる集団の存在が原因であるかもしれません。したがって、分離方法は、MIG選択htは、今後の臨床アプローチのための標的化組織特異修理·再生するために有用である。我々の結果は、手狭になったものに比べて酵素消化DPSCの高い石灰化能力を示した。しかし、このような生体内で＆in vitroにおける管状構造の形成の査定など、追加の研究は、機能性象牙質/歯髄組織再生療法に適用され、これらの2つの手順のどちらかを判断する必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は感謝し、彼の技術的支援のための彼らの重要な議論とモハマド·レザ·カデムシャリフ博士のレイラShakeri＆博士アレフDournaeiを認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
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