Summary
La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant soit
Abstract
Introduction
Les cellules souches sont des cellules clonogéniques qui possèdent deux caractéristiques remarquables, appelés multi-activité et l'auto-renouvellement 15. Parmi toutes les cellules souches avec des puissances différentes réplicatifs, les cellules souches dentaires comme les cellules souches postnatales ont attiré l'attention ces dernières années en raison de leur accessibilité, la plasticité et haute capacité de prolifération en comparaison avec d'autres cellules souches adultes 16. De façon caractéristique, similaire aux cellules souches mésenchymateuses, cellules souches dentaires de pâte à papier sont adhérentes des cellules clonogéniques qui ont la capacité de différenciation multiple dans le mésenchyme et / ou non-mésenchyme lignées, à la fois in vitro et in vivo. 1-8,17,18 DPSC sont identifiés par leur expression négative d'antigènes hématopoïétiques (par exemple, CD45, CD34, CD14), et l'expression positive de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 et STRO-1. 19,20
Facile potentiel obtenu avec un minimum de douleur et de morbidité faire DPSC de l'homme comme un précieuxsource de pouvoir des CSM par rapport aux sources ordinaires, telles que les cellules souches de la moelle osseuse mésenchymateuses 21. En général, DPSC ont été isolés par les deux méthodes conséquence, c'est à dire, la migration des cellules souches à partir d'explants de tissu pulpaire (DPSC-OG) 22-24, et / ou par digestion enzymatique (DPSC-ED) 4,6,25. Des études antérieures ont montré que la méthode d'isolement et des conditions de culture peut induire différentes populations ou lignées en vertu passages in vitro 26,27. Dans le cas des dents permanentes (pDPSCs), Huang et al révélé que enzymatiques pDPSCs digérés ont un potentiel plus élevé par rapport à la prolifération des DPSC trop grands. 26 En outre, dans le cas des dents de lait (dDPSCs), il a été démontré que STRO-1 et CD34 marqueurs exprimés plus dDPSC-ED en comparaison avec dDPSC-OG. En outre, dDPSC-ED affiché taux plus élevé de minéralisation dans définis ostéo / odonto moyen 27. Par conséquent, en raison du potentiel exceptionnel de DPSC dans regenerative médecine, d'autres études seront nécessaires pour mieux comprendre les éventuelles différentes populations qui sont issus de différentes méthodes d'isolement.
Ici, c'était tentative d'introduire facilement de l'extraction de la pâte, à l'aide d'un disque diamanté étape dentaire afin de faciliter le processus d'extraction de la pâte. En outre, après l'isolement des cellules souches dérivées de la pâte en appliquant les méthodes ED ou OG, les propriétés générales et la capacité de différenciation entre les deux groupes ont également été étudiés.
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Protocol
1. Préparer la solution enzymatique et moyennes prolifération (PM)
- Assurez-collagénase de type I Solution: Peser la collagénase de type I (12 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um seringue. Puis placez-le tube de 15 ml et le garder à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Assurez-dispase Solution: Peser dispase (16 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um seringue. Puis placez-le tube de 15 ml et le garder à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
- Assurez solution enzymatique: Ajouter 1 ml de collagénase de type I des solutions (12 mg / ml) et 1 ml des solutions dispase (16 mg / ml) dans le PBS stérile 2 ml contenant 100 mg / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine. Concentration totale de dispase et collagénase I dans le volume final est de 4 mg / ml et 3 mg / ml, réceptive. Ensuite, ce volume aliquote à quatre tube de 15 ml, contenant chacun 1 ml de solution enzymatique. Chaque tube peut être utilisé pour une digestion pâtes.
- Assurez solution de lavage: ajouter 100 mg / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine dans le PBS.
- Sensibiliser les médias de base: Alpha modification du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS et 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine.
- Faire les médias prolifération (PM): modification Alpha du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 uM acide L-ascorbique 2-phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,25 mg / ml d'amphotéricine B.
- Sensibiliser les médias odontogènes: modification Alpha du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 uM acide L-ascorbique 2-phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 0,01 uM dexaméthasone, 5 mM β-glycérol phosphate, 1,8 mM de phosphate monopotassique.
2. Préparer tissus humains pâtes dentaires pour les pâtes Isolatio cellules souches dentairesn
- Humains normaux troisièmes molaires ont été recueillies auprès des adultes (21-29 ans) à la clinique dentaire de l'imam Ali en vertu Conseil a approuvé Institutional Review (CISR).
- Les dents ont été placés dans le milieu basique (α-MEM supplémenté avec 10% de FBS) et ont été transférés dans le laboratoire à 4 ° C.
- Sous l'état stérile, travaillant dans une hotte à flux laminaire biohazard, set-up a été fait une des boîtes de Pétri de 100 mm pour chaque dent à traiter. Les surfaces des dents ont été nettoyés par l'éthanol à 70%.
- Tout en travaillant dans l'une des boîtes de Pétri, la dent a été conservé par davier et une lame de scalpel a été utilisé pour nettoyer les débris et ligament parodontal sur les racines.
- Jonction émail-cément a été lentement coupé à l'aide de stériliser disque dentaires pour révéler la chambre pulpaire. Il doit être considéré que le processus de coupe doit être effectuée lentement pour réduire la surchauffe des tissus dentaires.
- Tissu pulpaire a été légèrement séparée de la couronne et la racine. Tissu pulpaire a été découpé en petits morceaux à l'aide d'une lame de scalpel.
3. Isolation de la pulpe dentaire humaine
- Tissus de pâtes a subi soit la dissociation enzymatique du tissu pulpaire ou excroissance directe de la cellule à partir d'explants de tissus de pulpe pour l'isolement de hDPSCs.
- Dissociation enzymatique du tissu pulpaire:
- De petits morceaux de tissus de pulpe ont été transférés dans la solution enzymatique pendant 1 heure à 37 ° C. Vortex toutes les 30 minutes pour aider à briser le tissu.
- Par la suite, des agrégats de cellules grandes ont été enlevés et simple des suspensions de cellules ont été obtenues par le passage des cellules à travers un tamis cellulaire de 70 uM.
- Unicellulaires suspensions ont été centrifugées à 1200 rpm pendant 5 min à température ambiante.
- Les surnageants ont été soigneusement prélevé à la pipette et le culot est remis en suspension dans 1 ml de milieu de prolifération (PM). (Remarque: FBS en milieu de prolifération fin enzymatique dissociation.)
- Simple suspensions de cellules de la pulpe dentaire a été ensemencé en 25 flacon de culture cm 2 avec PM et ensuite incubées à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Le milieu de culture est changé tous les trois jours jusqu'à la confluence cellulaire a été atteint.
- Conséquence directe de la cellule à partir d'explants de tissus de pulpe:
- Tissu pulpaire a été réduit en 1-2-mm fragments, et chaque pièce a été placée dans 25 cm 2 flacons de culture avec le Premier ministre et ensuite incubées à 37 ° C dans 5% de CO 2. Il faut considérer que le volume total de la PM pour excroissance de cellules doit prendre en charge la saisie des pièces de pâte pour conséquence d'autres cellules (2-3 ml par flacon).
- Le milieu a été changé après excroissance a été observée.
- Les cellules à confluence trop grands ont été repiquées à un ratio de 1:4 (passage 1).
4. Immunophénotypage
- 250.000 cellules /tube de deux types de cellules dans le passage 3 ont été incubées en PE ou FITC-conjugués anticorps anti-humains avec leurs isotypes pendant 30 min à 4 ° C dans un endroit sombre. (Remarque:. La concentration d'anticorps a été appliqué selon le protocole de fabrication)
- Après le temps d'incubation, 100 pi de PBS ou de solution de dilution FACS a été ajouté à chaque tube et centrifugée à 1200 rpm pendant 5 min dans un endroit sombre.
- Les surnageants ont été retirés et culots ont été remis en suspension dans 100 ul de PBS ou de dilution FACS dans un endroit sombre.
- Marqueurs de surface spécifiques ciblés (marqueurs CD) ont été évalués par BD FACSCalibur.
5. L'induction de la différenciation de la DPSC dans les cellules minéralisées et quantifiés test rouge d'alizarine S
- DPSC qui ont été obtenus soit par dissociation enzymatique du tissu pulpaire (connu sous le nom DPSC-ED) ou excroissance directe de la cellule à partir d'explants de tissu pulpaire (DPSC-OG) ont été repiquées pendant 3 passages.
- At Passage 3, les cellules ont été la semence dans une plaque à 6 puits à 5.000 cellules / puits.
- A confluence de 60%, moyen odontogène ont été remplacés par heure conventionnelle. Trois puits ont été resté comme un contrôle négatif en ajoutant un milieu de croissance.
- Moyen changer tous les 3 jours jusqu'à 21 jours.
- Au jour 21, les cellules ont été lavées avec du PBS et ont été fixés par 1 ml / puits paraformaldéhyde 10% pendant 15 min à température ambiante.
- Puis paraformaldéhyde a été prélevé à la pipette, avec soin et les cellules ont été lavées 3 fois (5-10 min à chaque fois) à l'eau distillée H 2 O. (Remarque: Eviter de perturber la monocouche.)
- Après le lavage, 1 ml / puits de rouge d'alizarine S ont été ajoutés pendant 20 min à température ambiante.
- Les cellules ont été lavées par H 2 O déminéralisée quatre fois (5 min à chaque fois avec doux balancement) pour éliminer toute rouge Alizarine supplémentaire.
- 1 ml / puits H 2 O sont ajoutés pour empêcher les cellules de séchage.
- Les plaques ont été supposés ins visuelspection et / ou d'acquisition d'images.
- Pour le dosage de quantification Rouge d'alizarine S, H 2 O ont été remplacés par 1 ml d'acide acétique à 10% dans chaque puits de la plaque à 6 puits et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation.
- Puis, monocouche de cellules / puits étaient gratter et à la fois l'acide acétique et les cellules ont été transférées dans les 1,5 ml séparés micro-centrifugeuse tubes. (Remarque:. Chaque puits devraient être transférées dans un puits séparés soit trois tubes à essai et trois puits de contrôle pour chaque groupe ED & OG)
- Les tubes ont été vortexé vigoureusement pendant 30 secondes.
- La chaleur à 85 ° C pendant 10 min. (Remarque: pour éviter l'évaporation, les tubes ont été scellés avec du parafilm.)
- Après chauffage, les tubes ont été transférés dans la glace pendant 5 min. (Remarque: Les tubes doivent pas être ouvert jusqu'à devenir refroidi.)
- Les suspensions ont été centrifugées à 20.000 xg pendant 15 min. Alors que la centrifugation, l'alizarine rouge normes ont été faitesvers le haut.
Norme Rouge d'alizarine S ont été préparées en diluant d'abord le tampon de dilution et utilisé pour la fabrication de 2 dilutions d'après le tableau.
| Concentration de colorant High Range | Plage basse concentration de colorant | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 uM | 250 pM | 125 um | 62,5 uM | 31,3 uM | 15,6 uM | 7,8 uM | 3,9 uM | 1,9 uM | 0,9 um | 0,4 uM | Vide |
- Après la centrifugation, 1 ml de surnageant / tube ont été transférées dans de nouveaux séparés de 1,5 ml de micro-centrifugation des tubes.
- Le pH a été neutralisé avec ~ 375 ul de 10% D'hydroxyde d'ammonium par tube. (Remarque: la rage pH doit être 4.1 à 4.5.)
- 150 pl de la norme et des échantillons (y compris les tests distincts et contrôles) ont été ajoutés dans une paroi opaque, fond transparent plaque de 96 puits.
- L'absorbance a été lue à 405 nm et les valeurs de DO des échantillons ont été comparés avec terrain standard pour une analyse plus approfondie.
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Representative Results
- DPSC qui ont été obtenus par dissociation enzymatique (DPSC-ED) sont présentés ici au jour 10, 15,18 (figure 1). Les colonies engagées à se former sur près de 3 à 5 jours après l'isolement.
- DPSC trop grands (DPSC-OG) sont présentés dans la figure 2 au jour 5, 10, 13 et 18. Fibroblast-like cellules ont commencé à migrer à partir de pulpe dans le ballon par commande parallèle de près de 5 jours après le semis.
- DPSC au passage 3 en utilisant les deux méthodes sont présentés dans la figure 3. Ces deux types de DPSC étaient presque de la même taille et la morphologie.
- Immunophénotypage des résultats dans DPSC-ED et DPSC-OG (figure 4). Ces résultats indiquent la présence de marqueurs de cellules souches mésenchymateuses, tels que CD44, CD73, CD105 et CD90, et l'absence de marqueurs hématopoïétiques et endothéliales tels que CD34, CD45 et CD11b . Les expressions de CD105 CD146 & (périvasculaire marqueur) étaient plus DPSC-OG en comparaison avec DPSC-ED.STRO-1 a été négative dans les deux groupes. (Lignes bleues appelé OG groupe, tandis que les lignes rouges visés à l'ED une, lignes jaunes indiqué isotypes.)
- Morphologie Rouge d'alizarine S & résultats de quantification pour l'évaluation de la formation des tissus minéralisés dans DPSC-ED et DPSC-OG au jour 21 sont présentés dans la figure 5. La couleur rouge plus absorbant le dépôt de plus de calcium. Ces résultats indiquent dépôt de calcium dans plus différenciée DPSC-ED (d) par rapport à DPSC-OG (c). (Répétitions en triple techniques) quantification de rouge d'alizarine S a également indiqué l'significatif (*) concentration plus élevée de colorant entre DPSC-ED en comparaison avec les groupes OG. (Concentration Dye a également augmenté de manière significative (**, ***) entre les essais et les contrôles de chaque groupe (ED ou OG) qui sont indiqués le dépôt de calcium après le processus de différenciation)
(Notes: Un test t apparié analyse a été utilisée pour déterminer les différences dans laquantité de minéralisation matrice produite groupes ED et OG après l'induction de la différenciation. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. (Signification supposée pour P <0,05)
- Résultats QPCR de l'expression des gènes odontoblastes et minéralisé lié (DSPP) et (MEPE, ALP), respectivement, dans différenciée DPSC-ED & DPSC-OG sont présentés dans la figure 6. Ces résultats montrent l'importante régulation à la hausse de l'ALP et MEPE après la différenciation des groupes ED et OG. Pendant ce temps, les expressions ALP et MEPE étaient significativement plus élevés dans différenciée DPSC-ED par rapport à la différenciée DPSC-OG. Cependant, il n'ya pas de différence dans l'expression du DSPP dans des cellules différenciées entre les deux groupes (gène de ménage: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase protéine d'activation (YWHAZ)) 28.
(Remarque:. Les données ont été analysées à l'aide QPCR la méthode comparative CT A pa ired t-test d'analyse a été utilisée pour déterminer les différences d'expression génique entre les groupes ED & OG avant et après la différenciation, et aussi entre les cellules différenciées de deux groupes. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. (Importance pris pour P <0,05) (réplications en triple techniques)
Figure 1. Enzymatique dissocié DPSC (DPSC-DE) au jour 10, 15 et 18. Bar Grossissement = 200 um.
Figure 2. Dépassé DPSC (DPSC-OG) au jour 5, 10, 13 et 18. Bar Grossissement = 200 um.
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Figure 3. Dépassé DPSC (DPSC-OG) et enzymatiques (DPSC digérés DPSC-ED) morphologies de passage 3. Bar Grossissement = 200 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Histogramme Overlaid d'immunophénotypage des résultats dans DPSC-ED (rouge foncé) et DPSC-OG (bleu). (Les lignes jaunes représentent isotypes). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Résultats de la coloration Figure 5. Alizarine S en différenciée DPSC-OG (c), et différenciée DPSC-ED (d). (A) et (b) visées aux commandes. Quantification de test rouge d'alizarine S présentent une absorption plus différenciée colorant dans DPSC-ED par rapport à la différenciée groupe OG (e). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6. Résultats QPCR de l'expression des gènes odontoblastes et minéralisé lié (DSPP) et (MEPE, ALP), respectivement, dans différenciée DPSC-ED & DPSC-OG. L'expression de MEPE, ALP, et DSPP dans des cellules différenciées comparer à la commande confirmée la différenciation des deux groupes en odontoblastes (ac). Ces résultats indiqué la régulation à la hausse significative de l'ALP et MEPE après la différenciation des groupes ED et OG (a et b). Pendant ce temps, les expressions ALP et MEPE étaient significativement plus élevés dans différenciée DPSC-ED par rapport à la différenciée DPSC-OG (a et b). Cependant, il n'ya pas de différence dans l'expression du DSPP dans des cellules différenciées des deux groupes (c) (gène de ménage: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase protéine d'activation; YWHAZ). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Ce protocole décrit le processus d'isolement et la caractérisation de hDPSCs de la pulpe dentaire en utilisant deux méthodes, la dissociation enzymatique et excroissance directe de cellules souches à partir d'explants de tissus de pulpe. En outre, la différenciation in vitro de ces cellules en odontoblastes, a été évaluée par dosage quantitatif Rouge d'alizarine S & QPCR.
Les protocoles existants pour isoler le tissu pulpaire de la dent humaine avait été utilisé divers instruments tels que des pinces (forceps osseuse) 9, l'extirpation d'aiguilles 29, curette Gracey 30, fraises fissures dentaires 4, etc Ces méthodes prennent beaucoup de temps, tout en tenant compte du faible niveau surchauffe de la pâte par addition d'eau en continu. Toutefois, dans la technique actuelle, disque diamanté dentaire est utilisée pour l'isolement de pulpe, ce qui est un moyen rapide pour couper la dent avec une contamination minimale en une seule étape, et minimise l'échauffement de la pâte au cours d'une opération de coupe. En outre, un hDPSCsêtes enfin différencier en odontoblastes qui ont été comparés jamais dans le cas de l'homme par les dents permanentes but discuté. Évaluation comparative des hDPSCs différenciées (groupes ED & OG) par dosage quantitatif Rouge d'alizarine S indique le potentiel de minéralisation à haute hDPSC-ED en comparaison avec OG groupe. Ces résultats ont également confirmé par QPCR. DSPP, ALP et MEPE que la minéralisation marqueurs régulée à la hausse après la différenciation des odontoblastes dans les deux groupes. D'autre part, les expressions de MEPE et ALP ont été plus élevés dans différenciée hDPSC-ED par rapport au témoin. En accord avec l'étude précédente sur les dents de lait 27, les cellules souches obtenues à partir des dents permanentes à l'aide de méthodes d'isolement ou ED OG présentent également des comportements de différenciation similaires dans les mêmes conditions. De plus, pour une meilleure évaluation comparative, dans cette étude, à la fois hDPSC-ED & hDPSC-OG ont été isolés à partir des mêmes personnes.
Expressions de MSC Marqueurs und 'absence de marqueurs heamatopietic / endothéliale identifier les deux types de hDPSCs que les cellules souches mésenchymateuses. D'autre part, CD 105/146 CD ont été plus élevés dans DPSC-OG par rapport aux groupes ED. Malgré les preuves existantes en fonction de la présence de STRO-1 dans DPSC 31, nos résultats n'ont montré aucune expression de STRO-1 dans les deux groupes. Toutefois, la diversité significative de l'expression des marqueurs de surface dans différentes études pourrait être due aux conditions de culture, soit comme nombre de passages, composition des milieux, etc, ou variations interindividuelles entre les différents bailleurs de fonds. L'absence de STRO-1 dans les deux groupes peut indiquer que l'expression de ce marqueur pourrait ne pas affecter directement le potentiel de différenciation des odontoblastes (non représentée sur la vidéo).
Différentes conditions d'isolement hDPSCs pourrait apporter capacité de différenciation différent. Ces différences pourraient être dues à l'existence de différentes populations dans le tissu pulpaire. Ainsi, en sélectionnant le mig isolement méthodesht être utile pour la réparation des tissus ciblés, spécifiques et de régénération pour les futures approches cliniques. Nos résultats indiquent la plus grande capacité de minéralisation des DPSC digéré enzymatique par rapport à ceux trop grands. Cependant, des études supplémentaires, telles que l'évaluation de la formation de la structure tubulaire in vivo et in vitro, sont nécessaires pour déterminer laquelle de ces deux procédures est applicable pour la dentine fonctionnelle / thérapies de régénération des tissus de pulpe.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei pour leur discussion critique et M. Mohammad Reza Khadem Sharif pour ses appuis techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
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