Summary
Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu tarif
Abstract
Introduction
Kök hücreler, çok kudret ve kendini yenileme 15 olarak bilinen iki önemli özellik, sahip clonogenic hücrelerdir. Farklı replikatif potenslerine Tüm kök hücreler arasında, postnatal kök hücreler olarak diş kök hücreleri nedeniyle erişilebilirlik, esneklik, ve diğer yetişkin kök hücreleri 16 ile karşılaştırıldığında yüksek proliferatif yeteneği son yıllarda dikkat çekmektedir. Karakteristik olarak, mezenkimal kök hücreler ile benzer şekilde, diş özü kök hücrelerinin farklılaşmasını çoklu mezenşim içine kapasitesi ve / veya in vitro ve in vivo hem de non-mezenşim soy sahip yapışık clonogenic hücrelerdir. 1-8,17,18 DPSCs ile tanımlanır olumsuz hematopoetik antijenlerin ekspresyonu (örneğin, CD45, CD34, CD14) ve CD90 pozitif ifadesi, CD29, CD73, CD105, CD44 ve STRO-1. 19,20
Minimum ağrı ve morbidite ile kolay elde potansiyeli valu olarak insan DPSCs yapmakMKH yapabiliyor kaynağı kemik iliği mezenkimal kök hücre 21 olarak sıradan kaynaklarına kıyasla. Genel olarak, DPSCs ya akıbet yöntemi, yani, pulpa dokusu eksplantlar (DPSC-OG) 22-24, ve / veya enzimatik sindirim (DPSC-ED) 4,6,25 kök hücrelerin göç ile izole edilmiştir. Önceki çalışmalar izolasyon yöntemi ve kültür koşullarında in vitro pasajlar 26,27 bölgesindeki altında farklı popülasyonlarda veya soy neden olduğunu göstermiştir. Kalıcı dişlerin (pDPSCs) söz konusu olduğunda, Huang ve ark enzimatik sindirimi pDPSCs geçmek DPSCs kıyasla daha yüksek çoğalma potansiyeli olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca 26, dişlerin (dDPSCs) söz konusu olduğunda, bu gösterilmiştir ki STRO-1 ve CD34 belirteçleri dDPSC-OG ile karşılaştırıldığında dDPSC-ED daha dile getirdi. Buna ek olarak, dDPSC-ED tanımlanan osteo / odonto ortam içinde daha yüksek bir mineralizasyon hızı görüntülenir. Bu nedenle 27 sebebiyle r DPSCs olağanüstü potansiyeliegenerative tıp, daha fazla çalışmaları farklı izolasyon yöntemleri türetilmiştir olası çeşitli popülasyonlarda daha iyi anlaşılması için gerekli olacaktır.
İşte, bu hamuru çıkarma sürecini kolaylaştırmak için bir adım diş elmas disketini kullanarak, hamuru ekstraksiyon kolay bir şekilde tanıtmak için bir girişimdi. Ayrıca ED veya OG yöntemleri uygulayarak insan pulpa kaynaklı kök hücrelerin izolasyonu sonra, iki grup arasında genel özellikleri ve farklılaşma kapasitesi de incelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enzim Çözüm ve Çoğalma Orta (PM) hazırlayın
- Kollajenaz Tip I olun Çözüm: kollajenaz tip I (12 mg / ml) tartılır ve bir 0.2 mikron şırınga filtresi kullanarak 1 ml PBS ve filtre içinde çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirin ve gerektiği kadar -20 ° C'de saklayın.
- Çözelti dispase edin: dispase tartılır (16 mg / ml) ve 1 ml PBS ve filtre bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirmek ve gerektiğinde ° C ye kadar 4 başında tutmak.
- Enzim çözeltisi edin: 2 ml steril PBS 100 mg / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin içeren içine 1 ml kollajenaz tip bir eriyik (12 mg / ml) ve 1 ml dispase çözeltileri (16 mg / ml) ilave edilir. Nihai hacim içinde dispase ve kollajenaz bir toplam konsantrasyon receptively 4 mg / ml ve 3 mg / ml olmalıdır. Sonra, dört 15 ml tüp, her birinde 1 ml enzim çözeltisi için kısım bu hacim. Her bir tüp, bir kağıt hamuru sindirim için kullanılabilecek.
- Yıkama çözeltisi edin: 100 mg / ml penisilin, PBS içinde 100 mg / ml streptomisin ekleyin.
- Temel ortam edin: Eagle ortamı alfa modifikasyonu (α-MEM)% 10 FBS ve 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ile desteklenmiş.
- % 10 FBS, 100 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml ile desteklenmiş Eagle ortamı (α-MEM) 'in alfa modifikasyonu: Proliferasyon Ortam (PM) yapmak streptomisin ve 0.25 mg / ml amfoterisin B
- Odontojenik medya edin: Eagle ortamı alfa modifikasyonu (α-MEM)% 10 FBS, 100 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 0.01 uM ile desteklenmiş Deksametazon, 5 mM β-gliserol fosfat, 1.8 mM Monopotasyum fosfat.
2. Diş Pulp Kök Hücre Isolatio İnsan Dental Pulpa Dokusu hazırlayınn
- Normal insan üçüncü molar diş onaylı Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) kapsamında İmam Ali'nin Diş Kliniği'nde yetişkin (yaş 21-29 yıl) toplanmıştır.
- Dişler temel ortam (MEM α-% 10 FBS ile takviye edilmiş) içine yerleştirildi ve 4 ° C de laboratuvar aktarıldı
- Steril şartlarda, bir biyolojik tehlike laminer akış kaputu içinde çalışan, set-up işlenecek her diş için bir 100 mm Petri kapları yapıldı. Diş yüzeyleri% 70 etanol ile temizlendi.
- Petri-yemekleri birinde çalışırken, diş diş forseps ile tutuldu ve Bistüri enkaz ve kökleri üzerinde periodontal ligament kapalı temizlemek için kullanılmıştır.
- Mine-sement yavaş hamuru oda ortaya çıkarmak için sterilize diş disk kullanılarak kesildi. Bu kesme prosesi diş dokusu aşırı yavaş yavaş azaltmak için yapılması gereken olduğu göz önünde bulundurulmalıdır.
- Pulp doku hafifçe taç ve kök ayrıldı. Pulp doku bir neşter bıçak yardımı ile küçük parçalar halinde kesilmiş.
3. İnsan Diş Selüloz İzolasyon
- Pulp dokuların hDPSCs izolasyonu için pulpa dokusu eksplantlarından pulpa dokusu veya doğrudan hücre akıbet birini enzimatik ayrışma uygulandı.
- Pulpa dokusunun Enzimatik ayrışma:
- Kağıt hamuru dokuların küçük parçaları 37 ° C sıcaklıkta 1 saat için enzim solüsyonu içine aktarıldı Doku kesiliyor yardım Vorteks her 30 dk.
- Daha sonra, bir 70 uM hücre süzgecinden hücreleri geçirilerek büyük hücre agregatları çıkarıldı ve tek hücre süspansiyonları elde edildi.
- Tek hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 5 dakika için 1200 rpm'de santrifüjlenmiştir.
- Süpernatantlar dikkatle kapalı pipetle alındı ve pelet 1 ml çoğalması orta (PM) yeniden askıya alınmıştı. (Not: yayılması orta FBS sonlandırmak dis enzimatiksociation.)
- Diş hamuru Tek hücre süspansiyonları PM ile 25 cm 2 kültürü şişesi içine ekilmiş ve daha sonra% 5 CO2 içinde 37 ° C de inkübe edildi.
- Hücre konfluense elde edilene kadar kültür ortamı her üç günde bir değiştirildi.
- Pulpa dokusu eksplantlarından Doğrudan hücre akıbet:
- Selüloz doku 1-2 mm'lik parçalara kıyılmış edildi ve her bir parça PM ile 25 cm 2 kültür kaplarına yerleştirilir ve daha sonra 37 ° C'de inkübe% 5 CO2 içinde. Bu hücre akıbet için PM toplam hacmi daha fazla hücre akıbet için hamuru parçaları (şişesi başına 2-3 ml) eki desteklemesi gerektiğini dikkate alınmalıdır.
- Filiz gözlenmiştir sonra ortam değiştirilmiştir.
- Izdiham geçmek hücreleri 1:4 oranı (geçit 1) alt-kültür vardı.
4. Immünofeotipleme
- / 250,000 hücrelerpasaj 3'de hücrelerinin her iki türdeki boru 4 ° C karanlık bir yerde, 30 dakika için PE ya da izotipleri ile FITC-konjüge anti-insan antikor ile enkübe edildi. (Not:. Antikorların konsantrasyonu üretimi protokolüne uygun olarak uygulanmıştır)
- İnkübasyon süresinden sonra, 100 ul PBS ya da FACS seyreltme çözeltisi her bir tüpe eklendi ve karanlık bir yerde, 5 dakika için 1200 rpm'de santrifüjlenmiştir.
- Süpernatantlar çıkarıldı ve granül 100 ul PBS veya karanlık bir yerde FACS seyreltme yeniden askıya alındı.
- Hedefli yüzey belirteçleri (CD marker) BD FACSCalibur tarafından değerlendirildi.
5. Mineralize Hücre içine DPSCs Farklılaşma İndüksiyon & Alizarin Red S Assay Sayısallaştırılmış
- Pulpa dokusu eksplantları (DPSC-OG) gelen pulpa dokusunun enzimatik ayrışma (DPSC-ED olarak da bilinir) veya doğrudan hücre akıbet biri tarafından alındı DPSCs 3 geçişleri için alt-kültür vardı.
- At Passage 3, hücre 5.000 hücre / kuyu başında 6 plaka içine tohum edildi.
- % 60 izdiham, odontojenik orta konvansiyonel PM değiştirilmiştir. Üç kuyu büyüme ortamı ilave edilerek bir negatif kontrol olarak kaldı.
- Orta günde 21 kadar 3 gün boyunca her değiştirin.
- 21. günde, hücreler PBS ile yıkandı ve 1 ml / kuyucuk oda sıcaklığında 15 dakika için% 10 paraformaldehit ile fikse edildi.
- Daha sonra paraformaldehid dikkatli bir şekilde, kapalı pipetlendi ve hücreler damıtık H 2 O ile 3 kez (her zaman için 5-10 dk) yıkandı (Not: tek tabaka rahatsız kaçının.)
- Yıkandıktan sonra, 1 ml / Alizarin kırmızı S oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ilave edildi.
- Hücreler herhangi bir ek Alizarin kırmızı uzaklaştırmak için deiyonize H2O dört kez (nazik sallama ile, her seferinde 5 dakika) ile yıkandı.
- 1 ml / H2O kurumasını engellemek için hücrelerin ilave edildi.
- Plakaları görsel ins kabul edildipection ve / veya görüntü alma.
- Alizarin Kırmızı S miktar tayini için, H2O sallama ile oda sıcaklığında 30 dakika için 6 plaka ve inkübe her bir kuyucuğa 1 ml% 10 asetik asit ile değiştirilmiştir.
- Sonra, iyi hücre monolayer / kazıma ve asetik asit ve hücreler iki ayrı 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine aktarıldı vardı. (Not:. Her iyi her ED ve RG grupları için ayrı bir tüp yani üç test kuyuları ve üç kontrol kuyulara transferi olmalıdır)
- Tüpler 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde vortekslenmiş edildi.
- 85 ° C ısı 10 dakika için. (Not: buharlaşma önlemek için, tüpleri parafilm ile imzalandı.)
- Isıtmadan sonra, tüp 5 dakika için buz içine transfer edildi. (Not: soğutmalı hale gelene kadar Tüpler açılmamalıdır.)
- Bulamaçları 15 dakika için 20,000 x g'de santrifüjlenmiştir. Santrifüj iken, Alizarin Kırmızı standartları yapılmıştırkadar.
Alizarin Kırmızı S standart ilk seyreltme tamponu seyreltilmesi ve tablosuna göre 2-kat seri seyreltiler yapmak için kullanılan ile hazırlanmıştır.
| Boya Yüksek Oranda konsantrasyonu | Boya Düşük Aralığı konsantrasyonu | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 uM | 250 uM | 125 mcM | 62.5 uM | 31.3 uM | 15.6 uM | 7.8 uM | 3.9 uM | 1.9 uM | 0.9 uM | 0.4 uM | Boş |
- Santrifüj sonra süpernatant / tüp 1 ml yeni ayrı 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine aktarıldı.
- PH ~ 375 ul 10 ile nötralize edildi;Tüp başına% amonyum hidroksit. (Not: öfke pH 4.1-4.5 olmalıdır.)
- Standart ve numune (ayrı testler ve kontroller dahil) 150 ul 96-plaka opak-duvarlı, şeffaf alt içine ilave edildi.
- Absorbansı 405 nm'de okunmuştur ve örnekleri OD değerleri, daha fazla analiz için standart arsa ile karşılaştırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Enzimatik ayrışma (DPSC-ED) ile elde edildi DPSCs günde 10, 15,18 (Şekil 1) burada gösterilir. Dışlanmasının ardından yaklaşık 3 ila 5 gün oluşmaya başlayan koloniler.
- Geçmek DPSCs (DPSC-OG) günlük 5, 10, 13 ve 18, Şekil 2'de gösterilmiştir. Hücreleri paralel tohumlama sonra yaklaşık 5 gün tarafından sipariş ederek hamuru doku balonun içine göç etmeye başladılar Fibroblast benzeri.
- Her iki yöntem kullanılarak pasaj 3'de DPSCs Şekil 3 'de gösterilmiştir. DPSCs Her iki tip de aynı boyut ve morfoloji açısından hemen hemen edildi.
- DPSC-ED ve DPSC-OG (Şekil 4) sonuç immünofeotipleme. Bu sonuçlar CD44, CD73, CD105 ve CD90 olarak mezenkimal kök hücre belirteçlerinin varlığı, ve bu CD34, CD45 ve CD11b gibi hematopoietik ve endotel işaretleri olmaksızın belirtilen . CD105 ve CD146 (perivasküler belirteci) ifadeleri DPSC-ED ile karşılaştırıldığında DPSC-RG daha vardı.STRO-1 her iki grupta da negatif idi. (ED birine sevk kırmızı çizgiler, sarı çizgiler izotiplerinin gösterdiği halde Mavi çizgiler OG grubu olarak anılacaktır.)
- Alizarin Kırmızı S morfoloji ve 21. günde DPSC-ED ve DPSC-OG mineralize doku formasyonu değerlendirme ölçümü için sonuçlar Şekil 5 de gösterilmiştir. Daha fazla emici kırmızı renk daha fazla kalsiyum birikimi. Bu sonuçlar, DPSC-OG (c) ile karşılaştırıldığında farklı DPSC-ED (d) 'de daha fazla kalsiyum birikimi göstermektedir. (Üç kopya teknik tekrarlamalı) Alizarin Kırmızı S miktarının da OG grupları ile karşılaştırıldığında DPSC-ED arasındaki boya anlamlı (*) daha yüksek bir konsantrasyonu belirlenmiştir. (Boya konsantrasyonu da farklılaşma süreci sonrasında kalsiyum birikimi gösterilmiştir her grubun testleri ve kontrolleri (ED veya RG) arasındaki (**, ***) anlamlı bir artış)
(Notlar: Eşleştirilmiş t-testi analizi farklılıkları belirlemek için kullanılanmineralize matriks miktarı diferansiyasyon indüksiyonu sonrası ED ve RG grupları üretilmektedir. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edildi. (P için kabul anlamlılık <0.05)
- DPSC-ED ve DPSC-OG Şekil 6 'da gösterilmiştir farklı olarak sırasıyla odontoblast ve mineralize ile ilişkili genlerin ekspresyonunu (DSPP) ve (MEPE, ALP), ve QPCR sonuçlanır. Bu sonuçlar, ALP ve MEPE arasında önemli yukarı-düzenleme gösterilir ED ve OG gruplarının farklılaşma sonra. Bu arada, ALP ve MEPE ifadeler farklılaştırılmış DPSC-OG göre farklılaştırılmış DPSC-ED anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Ancak, her iki grupta (Housekeeping gen: Tirozin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase aktifleştirme proteini (YWHAZ)) arasındaki farklılaşmış hücrelerde DSPP ifadesi hiçbir fark yoktur. 28.
(Not:. QPCR verileri karşılaştırmalı CT metodu kullanılarak analiz edildi bir pa IRED t-testi ED ve farklılaşma önce ve sonra, hem de iki grup farklılaşmış hücreleri arasında RG grupları arasında gen ekspresyonu farklılıklarını belirlemek için kullanılmıştır. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edildi. (P <0.05 kabul Önemi) (üç kat teknik tekrarlamalı)
Şekil 1. Gün 10, 15 ve 18 Enzimatik disosiye DPSC (DPSC-ED). Büyütme bar = 200 mikron.
Şekil 2. Günde 5, 10, 13 ve 18 DPSCs (DPSC-OG) geçmek. Büyütme bar = 200 mikron.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Şekil 3. DPSCs (DPSC-OG) ve enzimatik sindirilmiş DPSCs (DPSC-ED) geçiş 3 morfolojileri geçmek. Büyütme bar = 200 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. DPSC-ED (koyu kırmızı) ve DPSC-OG (Mavi) sonuçları immunfenotiplemenin Overlaid Histogram. (Sarı çizgiler izotiplerinin temsil). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
hres.jpg "/>
Farklılaştırılmış DPSC-OG (c), ve farklı DPSC-ED (d) 'de Şekil 5. Alizarin Kırmızı S boyama ile sonuçlanır. (A) ve (b) kontrol anılacaktır. Alizarin Red S tahlil Kantitasyonu farklılaşmış OG grubu (e) göre farklılaştırılmış DPSC-ED daha boya emilim gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. Farklılaştırılmış DPSC-ED & DPSC-OG sırasıyla odontoblast ve mineralize ilişkili genlerin ekspresyonu (DSPP) ve (MEPE, ALP), ve QPCR sonuçlar. Diferansiye hücrelerde MEPE, ALP, & DSPP ifadesi teyit kontrolü karşılaştırmak odontoblast içine iki grubun farklılaşma (ac). Bunlar ronu ç lar (a & b) ED ve RG grupları farklılaşma sonra ALP & MEPE arasında önemli up-regülasyonu gösterilir. Bu arada, ALP ve MEPE ifadeler farklılaştırılmış DPSC-OG (a & b) göre farklılaştırılmış DPSC-ED anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Ancak, her iki gruba (c) (Housekeeping gen: Tirozin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase aktivasyon protein; YWHAZ) farklılaşmış hücrelerde DSPP ifadesinde hiçbir fark yoktur. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol iki yöntem, enzimatik ayrışma ve pulpa dokusu eksplantlar alınan kök hücrelerin direkt sonucudur kullanarak diş hamurundan hDPSCs izolasyonu ve karakterizasyonu süreci anlatılmaktadır. Buna ek olarak, odontoblastlar bu hücrelerin in vitro olarak farklılaşma, kantitatif Alizarin Kırmızı S tahlil ve QPCR ile değerlendirildi.
İnsan dişinden pulpa dokusu izole etmek için mevcut protokoller pense (kemik forseps) 9, imha iğne 29, Gracey küret 30, diş fissür frez 4, vb düşük seviyede dikkate alarak bu yöntemler, zaman alıcı gibi çeşitli enstrümanlar kullanılır olmuştu devamlı su ekleyerek hamuru aşırı ısınma. Bununla birlikte, mevcut teknikte, diş elmas disk tek adımlı bir işlemde en az kirlenme ile diş kesmek için hızlı bir şekilde kağıt hamuru doku, izolasyonu için kullanılır, ve bir kesme işlemi sırasında kağıt hamuru aşırı ısınma en aza indirir. Ayrıca, bir hDPSCsson olarak tekrar ele amacı ile, insan kalıcı dişlerin söz konusu kıyasla hiç edilmiştir odontoblastlar ayrışmıştır. Nicel Alizarin Red S assay tarafından farklılaştırılmış hDPSCs karşılaştırmalı değerlendirmesi (ED ve RG grupları) OG grubu ile karşılaştırıldığında hDPSC-ED yüksek mineralizasyon potansiyeli göstermiştir. Bu sonuçlar, aynı zamanda QPCR ile doğrulandı. Mineralizasyon DSPP, ALP ve MEPE iki grupta odontoblast farklılaşma sonrası düzenlenir kadar markers. Öte yandan, MEPE & ALP ifadeler kontrole göre farklılaştırılmış hDPSC-ED yüksek bulunmuştur. Süt dişi yaklaşık 27 önceki çalışmada ile anlaşmaya varılarak, ED veya OG izolasyon yöntemleri kullanılarak kalıcı dişler elde edilen kök hücrelerin de aynı şartlar altında benzer farklılaşma davranışlar sergilemektedir. Ayrıca, daha iyi karşılaştırmalı değerlendirme için, bu çalışmada, hDPSC-ED & hDPSC-OG ikisi de aynı bireylerden izole edilmiştir.
MSC İfadelerin markersd heamatopietic / endotel belirteçleri yokluğunda mezenkimal kök hücreler olarak hDPSCs her iki tip tanımlamak. Diğer taraftan, CD 105 / CD 146 ED grupları ile karşılaştırıldığında, DPSC-OG daha yüksekti. DPSCs 31 STRO-1 varlığına göre Mevcut kanıtlar olmasına rağmen, sonuçlar her iki grupta STRO-1 yok ekspresyonu gösterdi. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalarda yüzey işaretleyici ekspresyonu anlamlı bir farklılık bu tür geçiş sayısı, ortamın kompozisyonu, vs ya da farklı vericilerden arasında bireylerarası varyasyonlar olarak yetiştirme koşulları ya da bağlı olabilir. Her iki grupta da STRO-1 yokluğunda (video gösterilmemiştir) bu işaretleyici ifade doğrudan doğruya odontoblast farklılaşma potansiyeli etki olabilir olduğunu gösteriyor olabilir.
Farklı hDPSCs izolasyon durumu farklı farklılaşma kapasitesi getirebilir. Bu farklılıklar pulpa dokusu farklı nüfus varlığı nedeniyle olabilir. Böylece, izolasyon yöntemleri MIG seçmeht gelecekteki klinik yaklaşımlar için hedeflenen doku belirli onarım ve yenilenme için yararlı olabilir. Bizim sonuçlarımız sığmayacak olanlara göre enzimatik sindirilmiş DPSC daha yüksek mineralizasyon kapasitesi belirtilir. Bununla birlikte, bu gibi in vivo ve in vitro olarak tüp şekilli bir yapının oluşumu değerlendirme gibi ek çalışmalar, fonksiyonel dentin / kağıt hamuru doku yenilenmesi tedavileri için geçerli olan bu iki yöntemden belirlemek için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz minnetle onun teknik destekler için onların eleştirel discus ve Sayın Mohammad Reza Khadem Şerif için Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei kabul ediyorsunuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al.
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
