Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Published: November 24, 2012 doi: 10.3791/4372
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות אחת

Abstract

Introduction

תאי גזע הם תאי clonogenic אשר מחזיקים שתי תכונות יוצאות דופן, הידועים כ- עצמה רבה והתחדשות עצמית 15. בין כל תאי גזע עם פוטנציות replicative שונות, תאי גזע שיניים כתאי גזע לאחר הלידה יכולים לעורר תשומת לב בשנים האחרונות בגלל הנגישות שלהם, הפלסטיות, ויכולת שגשוג גבוהה בהשוואה לתאי גזע בוגרים אחרים 16. אופייני, בדומה לתאי גזע mesenchymal, תאי גזע הם תאי עיסת שיני clonogenic חסיד שבו יש יכולת המרובה בידול לmesenchyme ו / או שושלות אינן mesenchyme, היא במבחנת in vivo. 1-8,17,18 DPSCs מזוהים על ידי הביטוי שלהם השלילי של אנטיגנים hematopoietic (למשל, CD45, CD34, CD14), וביטוי חיובי של CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 וstro-1. 19,20

פוטנציאל להשיג קל עם כאבים ותחלואה מינימאליים לעשות DPSCs אדם כvaluמקור של תאי גזע מסוגל בהשוואה למקורות הרגילים, כגון תאי מח עצם mesenchymal גזע 21. באופן כללי, DPSCs היה מבודד על ידי אף אחת משיטות תולדה, כלומר, הגירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה (DPSC-OG) 22-24, ו / או על ידי עיכול אנזימטי (DPSC-ED) 4,6,25. המחקרים קודמים הראו כי תנאי תרבות שיטת בידוד ויכולים לגרום לאוכלוסיות או שושלות שונות תחת במעברי המבחנה 26,27. במקרה של שיניים קבועות (pDPSCs), הואנג ואח' גילה כי pDPSCs מתעכל אנזימטית יש פוטנציאל התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לDPSCs נחלץ מהם. 26 יתר על כן, במקרה של שיניים נשירות (dDPSCs), היא ההוכחה שstro-1 & CD34 סמנים הביעו יותר בdDPSC-ED בהשוואת dDPSC-OG. בנוסף, dDPSC-ED מוצג שיעור מינרליזציה גבוהה במדיום מוגדר osteo / odonto 27. לכן, בשל הפוטנציאל יוצא הדופן של DPSCs בrרפואת egenerative, מחקרים נוספים תידרש להבנה טובה יותר של אוכלוסיות שונות אפשריות אשר נגזרות משיטות בידוד שונות.

הנה, זה היה ניסיון להציג את הדרך קלה להפקת עיסה, באמצעות דיסק יהלום שיני צעד אחד כדי להקל על התהליך של מיצוי עיסה. יתר על כן, לאחר הבידוד של תאי גזע המופקים מעיסת אדם על ידי שימוש בשיטות ED או OG, תכונות כלליות ויכולת הבחנה בין שתי קבוצות היו גם נחקרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכן את פתרון אנזימים ובינוני הפצה (PM)

  1. הפוך סוג collagenase פתרון: תשקול את collagenase סוגי (12 מ"ג / מ"ל) ולהתמוסס במ"ל PBS 1 ומסנן באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. ואז למקם אותו צינור מ"ל 15 ולשמור אותו ב -20 ° C עד צורך.
  2. הפוך פתרון dispase: תשקול את dispase (16 מ"ג / מ"ל) ולהתמוסס ב1 המ"ל PBS וסינון באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. ואז למקם אותו צינור מ"ל 15 ולשמור אותו ב 4 ° C עד צורך.
  3. הפוך פתרון אנזים: הוסף מסוג 1 שפתרוני מ"ל collagenase (12 מ"ג / מ"ל) ופתרוני 1 מ"ל dispase (16 מ"ג / מ"ל) לתוך 2 המ"ל סטרילי PBS המכיל 100 מ"ג / המ"ל פניצילין, 100 מ"ג / המ"ל סטרפטומיצין. ריכוז כולל של dispase וcollagenase אני בנפח סופי צריך להיות 4 מ"ג / מ"ל ​​ו 3 מ"ג / מ"ל, בפתיחות. ואז, aliquot זה בנפח 4 לצינור 15 מ"ל, כל פתרון אנזים המכיל 1 מ"ל. כל צינור יכול לשמש לעיכול עיסה 1.
  4. הפוך כביסת פתרון: הוסף 100 מ"ג / המ"ל פניצילין, 100 מ"ג / המ"ל סטרפטומיצין לתוך PBS.
  5. הפוך תקשורת הבסיסית: שינוי אלפא של המדיום של הנשר (α-MEM) בתוספת 10% FBS & 100 יחידות / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ"ג / מ"ל.
  6. הפוך הפצת מדיה (PM): שינוי אלפא של המדיום של הנשר (α-MEM) בתוספת 10% FBS, 100 חומצת L-אסקורבית מיקרומטר 2-פוספט, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות / המ"ל פניצילין, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מ"ג / מיליליטר amphotericin B.
  7. הפוך תקשורת Odontogenic: שינוי אלפא של המדיום של הנשר (α-MEM) בתוספת 10% FBS, 100 חומצת L-אסקורבית מיקרומטר 2-פוספט, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות / המ"ל פניצילין, 100 מ"ג / סטרפטומיצין מ"ל, 0.01 מיקרומטר דקסאמתאזון, 5 פוספט mM β-גליצרול, פוספט Monopotassium mM 1.8.

2. הכן את רקמות שיניים זולות אנושיות לתאי הגזע Isolatio הזול שינייםn

  1. טוחנות שלישיות אדם נורמליות נאספו ממבוגרים (21-29 שנים) במרפאת השיניים של האימאם עליי תחת מועצה לביקורת מוסדית מאושרת (IRB).
  2. שיניים הונחו לתוך המדיום הבסיסי (α-MEM בתוספת 10% FBS) והועברו למעבדה ב 4 ° C.
  3. בתנאים סטריליים, עובד בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית biohazard, הגדרה נעשתה 1 100 מ"מ צלחות הפטר לכל שן לעיבוד. משטחי שן נוקו על ידי אתנול 70%.
  4. בזמן שעבד באחד מפטרי-המנות, שן נשמר על ידי מלקחי שיניים ולהב אזמל שמש לנקות את הפסולת ורצועת חניכיים על השורשים.
  5. צומת Cemento-אמייל נחתכה לאט באמצעות דיסק שיניים מעוקרות לחשוף קאמרי עיסה. זה צריך לקחת בחשבון שתהליך חיתוך חייב להתבצע באיטיות להפחתת התחממות יתר של רקמות שיניים.
  6. רקמת עיסה הופרדה בעדינות מהכתר והשורש. רקמת עיסה נחתכה לחתיכות קטנות בעזרת להב סכין מנתחים.

3. בידוד זול שיניים אנושי

  1. רקמות עיסה עברו או ניתוק האנזימטית של רקמת עיסה או תולדה ישירה מתא explants רקמות העיסה לבידודה של hDPSCs.
  2. דיסוציאציה אנזימתי של רקמת עיסה:
    1. חתיכות קטנות של רקמות עיסה הועברו לפתרון אנזים לשעה 1 ב 37 ° C. מערבולת בכל 30 דקות כדי לעזור לשבור את הרקמות.
    2. לאחר מכן, אגרגטים סלולריים גדולים הוסרו והשעיות תא בודד התקבלו על ידי תאים עוברים דרך מסננת תא 70-מיקרומטר.
    3. השעיות תא בודד היו centrifuged ב1200 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. Supernatants היה pipetted זהירות ומגלולה מחדש הושעתה-מ"ל בהתפשטות בינונית 1 (PM). (הערה: במדיום FBS התפשטות לסיים האנזימטית דיסהתאגדות.)
    5. השעיות תא בודד של עיסת שיניים נזרעו לתוך בקבוקון 25 סנטימטר 2 תרבות עם ראש ממשלה ולאחר מכן הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2.
    6. מדיום התרבות שונה בכל שלושה ימים עד confluency התא הושג.
  3. תולדה ישירה מתא explants רקמות עיסה:
    1. רקמת עיסה טחונה לרסיסי 1-2-מ"מ, וכל פיסה הונחה בצלוחיות התרבות 2 סנטימטר עם 25-PM ולאחר מכן הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2. זה צריך לקחת בחשבון שהנפח כולל של ההודעות לתולדה של תא חייב לתמוך בחיבור של חתיכות עיסה לתולדת תא נוספת (2-3 מ"ל לבקבוק).
    2. המדיום השתנה לאחר התולדה נצפתה.
    3. התאים שכבר הקטנים במפגש היו תת תרבות ביחס של 1:4 (קטע 1).

4. Immunophenotyping

  1. 250.000 תאים /צינור של שני סוגי תאים בחלוף 3 הודגרו ידי PE או נוגדנים FITC-מצומדות אנטי אנושיים עם isotypes למשך 30 דקות ב 4 ° C במקום חשוך. (הערה:. הריכוז של נוגדנים יושם על פי פרוטוקול הייצור)
  2. לאחר זמן הדגירה, פתרון דילול FACS 100 PBS או μl נוסף לכל צינור וcentrifuged ב1200 סל"ד למשך 5 דקות במקום חשוך.
  3. Supernatants הוסר וכדורים היו מושעים מחדש ב- 100 PBS μl או דילול FACS במקום חשוך.
  4. סמני שטח ממוקד (סמני CD) הוערכו על ידי BD FACSCalibur.

5. אינדוקציה של דיפרנציאציה של DPSCs לתוך תאי Mineralized ולכמת Assay S אליזרין האדום

  1. DPSCs שהתקבלו על ידי שתי דיסוציאציה האנזימטית של רקמת ציפה (המכונה DPSC-ED) או תולדה ישירה מתא explants רקמות עיסה (DPSC-OG) היה תת תרבות במשך 3 קטעים.
  2. מעבר 3 לא, תאי הזרע בצלחת גם 6 בתא 5000 / כן.
  3. במפגש של 60%, בינוני odontogenic הוחלפו PM הקונבנציונלי. שלוש בארות היו נשארה כביקורת שלילית על ידי הוספת מדיום גידול.
  4. בינוני לשנות כל 3 ימים עד 21 יום.
  5. בגיל 21 יום, תאים נשטפו עם PBS ותוקנו על ידי 1 מ"ל / גם 10% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  6. אז paraformaldehyde היה pipetted כבוי, בזהירות ובתאים נשטפו 3 פעמים (5-10 דקות בכל פעם) עם H 2 O. המזוקק (שים לב: הימנע ממפריע monolayer.)
  7. לאחר שטיפה, 1 מ"ל / היטב אליזרין האדום S נוספו במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. תאים נשטפו על ידי H 2 O ארבעה פעמי deionized (5 דקות בכל פעם עם נדנדה עדינה) כדי להסיר אדום אליזרין נוסף.
  9. 1 מ"ל / היטב H 2 O נוסף כדי למנוע את התאים מפני התייבשות.
  10. הצלחות היו להניח לתוספות חזותיותpection ו / או רכישה של תמונה.
  11. עבור assay כימות S אליזרין האדום, H 2 O הוחלף 1 מיליליטר חומצה אצטית 10% לכל אחד גם מצלחת 6-היטב ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם רעד.
  12. ואז, monolayer תא / גם היה שפשוף ושניהם חומצה אצטית ותאים הועברו לתוך צינורות 1.5 מ"ל הנפרדים מייקרו צנטריפוגות. (הערה:. כל באר צריך להיות העברה לשלוש בארות הצינור נפרדות כלומר בדיקה ושלוש בארות בקרה של כל קבוצות ED & OG)
  13. צינורות היו vortexed נמרץ למשך 30 שניות.
  14. חום עד 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (הערה: כדי למנוע אידוי, צינורות היו חתומים בparafilm.)
  15. לאחר חימום, צינורות הועברו לקרח למשך 5 דקות. (הערה: צינורות אין לפתוח עד להיות מקורר.)
  16. את slurries היה centrifuged ב20000 XG במשך 15 דקות. בעוד צנטריפוגה, סטנדרטי אליזרין האדומים נעשועד.

סטנדרטי S אליזרין האדום הוכנו על ידי דילול 1 חיץ הדילול ומשמש לביצוע דילולים סידוריים 2-קיפול המבוססים על השולחן.

ריכוז טווח גבוה של צבע ריכוז נמוך של טווח צבע
2 מ"מ 1 mM 500 מיקרומטר 250 מיקרומטר 125 מיקרומטר 62.5 מיקרומטר 31.3 מיקרומטר 15.6 מיקרומטר 7.8 מיקרומטר 3.9 מיקרומטר 1.9 מיקרומטר 0.9 מיקרומטר 0.4 מיקרומטר ריק
  1. לאחר צנטריפוגה, 1 מ"ל של supernatant / צינור הועברו ל1.5 צינורות נפרדים חדשים מיליליטר מייקרו צנטריפוגות.
  2. PH נוטרל עם ~ 375 μl 10הידרוקסיד אמוניום% לצינור. (הערה: זעם pH צריך להיות 4.1-4.5).
  3. 150 μl של תקן & דגימות (כולל בדיקות ובקרות נפרדות) נוספו לתחתית קירות אטומים, שקופת צלחת 96-כן.
  4. הספיגה הוקראה ב405 ננומטר וערכי OD מדגימות הושוו עם עלילה סטנדרטית לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. DPSCs שהתקבלו על ידי ניתוק האנזימטית (DPSC-ED) מוצגות כאן ביום 10, 15,18 (איור 1). המושבות יזמו להיוצר על כמעט 3 עד 5 ימים לאחר הבידוד.
  2. DPSCs outgrown (DPSC-OG) מוצג באיור 2 ביום 5, 10, 13 & 18. פיברובלסטים דמויי תאים החלו להגר מרקמות עיסה לתוך הבקבוק על ידי הזמנה מקביל על ידי כמעט 5 ימים לאחר זריעה.
  3. DPSCs במעבר 3 בשתי השיטות מוצגות באיור 3. שני הסוגים של DPSCs היו כמעט באותו הגודל ומורפולוגיה.
  4. Immunophenotyping תוצאות בDPSC-ED וDPSC-OG (איור 4). תוצאות אלו מצביעות על הנוכחות של סמנים של תאי גזע mesenchymal כגון CD44, CD73, CD105 & CD90, והעדר סמני hematopoietic & האנדותל כגון CD34, CD45 & CD11b . הביטויים של CD105 & CD146 (perivascular סמן) היו יותר בDPSC-OG בהשוואת DPSC-ED.Stro-1 היה שלילי בשתי הקבוצות. (קווים כחולים המכונים OG קבוצה, ואילו קווים אדומים התייחסו לבעיות בזקפה אחד, קווים צהובים הצביעו isotypes.)
  5. מורפולוגיה S אליזרין האדום ותוצאות כימות להערכת יצירת רקמת mineralized בDPSC-ED וDPSC-OG על 21 יום מוצגת באיור 5. הצבע האדום יותר המרתק תצהיר יותר סידן. תוצאות אלו מצביעות על תצהיר יותר סידן בבדיל DPSC-ED (ד) בהשוואה לDPSC-OG (ג). (חזרות שלושה עותקים טכניות) כימות של אליזרין האדום S גם מצוין (*) הריכוז הגבוה המשמעותי של צבע בין DPSC-ED בהשוואה בין קבוצות עוג. (ריכוז דיי גם גדל באופן משמעותי (**, ***) בין בדיקות ובקרות של כל קבוצה (ED או OG) אשר צוינו בתצהיר הסיד לאחר תהליך ההתמיינות)

(הערות: ניתוח לזווג מבחן t שמש כדי לקבוע את ההבדלים בכמות mineralized המטריצה ​​מיוצרת קבוצות ED וOG אחרי הגיוס של בידול. התוצאות באו לידי ביטוי כממוצע ± SEM. (משמעות הניחה עבור P <0.05)

  1. תוצאות qPCR של הביטוי של odontoblast וmineralized קשור גנים (DSPP) ו( MEPE, ALP), בהתאמה, במובחן DPSC-ED & DPSC-OG מוצגים באיור 6. תוצאות אלו מצביעות על התקנה המשמעותית של ALP & MEPE לאחר ההבחנה בקבוצות ED ועוג. בינתיים, ביטויי ALP וMEPE היו גבוהים יותר משמעותי במבודל DPSC-ED לעומת המובחן DPSC-OG. עם זאת, אין הבדל בביטוי של DSPP בתאים מובחנים בין שתי הקבוצות (גן המשק: 3-monooxygenase/tryptophan טירוזין 5-monooxygenase חלבון שפעול (YWHAZ)) 28.

(הערה:. נתוני qPCR נותחו באמצעות השיטה ההשוואתית CT רשות ניתוח ired מבחן t שמש כדי לקבוע את ההבדלים בביטוי גנים בין קבוצות עוג לפני ואחרי ההבדלה, וגם בין תאים מובחנים של שתי קבוצות ED &. התוצאות באו לידי ביטוי כממוצע ± SEM. (משמעות הניחה עבור P <0.05) (חזרות שלושה עותקים טכניות)

איור 1
איור 1. אנזימתי DPSC ניתק (DPSC-ED) ביום 10, 15 & 18. בר גדלה = 200 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. Outgrown DPSCs (DPSC-OG) ביום 5, 10, 13 ו 18. בר גדלה = 200 מיקרומטר.

load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
איור 3. Outgrown DPSCs (DPSC-OG) וDPSCs אנזימטית מתעכל (DPSC-ED) מורפולוגיות בקטע 3. בר גדלה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. היסטוגרמה מעולף של immunophenotyping תוצאות בDPSC-ED (אדום כהה) וDPSC-OG (הכחול). (קווים צהובים מייצגים isotypes). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

hres.jpg "/>
תוצאות איור 5. אליזרין S האדום בצביעה המובחן DPSC-OG (ג), ובדיל DPSC-ED (ד). () & (ב) התייחסו לבקרות. כימות של assay S אליזרין האדום להראות ספיגת צבע יותר מובחן בDPSC-ED בהשוואה לקבוצה המובחנת OG (ה). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. תוצאות qPCR של הביטוי של odontoblast וmineralized קשור גנים (DSPP) ו( MEPE, ALP), בהתאמה, במובחן DPSC-ED & DPSC-OG. הביטוי של MEPE, ALP, וDSPP בתאים מובחנים להשוות לשליטה אשרה הבידול של שתי הקבוצות לodontoblast (AC). r אלהesults ציין את התקנה המשמעותית של ALP & MEPE לאחר ההבחנה בקבוצות ED וOG (& B). בינתיים, ביטויי ALP וMEPE היו גבוהים יותר משמעותי במבודל DPSC-ED לעומת המובחן DPSC-OG (& B). עם זאת, אין הבדל בביטוי של DSPP בתאים מובחנים של שתי הקבוצות (ג) (גן המשק: 3-monooxygenase/tryptophan טירוזין 5-monooxygenase חלבון הפעלה; YWHAZ). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את התהליך של בידוד ואפיון של hDPSCs מעיסת שיניים באמצעות שתי שיטות, דיסוציאציה האנזימטית ותולדה ישירה של תאי גזע מרקמת explants עיסה. בנוסף, בבידול במבחנה של תאים אלו לתוך odontoblasts, הוערך על ידי assay & S QPCR כמותית אליזרין האדום.

פרוטוקולים קיימים לבידוד רקמת מוך משן האנושית היו בשימוש מכשירים שונים כגון מלקחיים (מלקחי עצם) 9, 29 עיקור מחט, גרייסי 30 מגרד, burs סדק שיניים 4, וכו 'שיטות אלה הן זמן רבים, תוך התחשבות ברמה נמוכה של התחממות יתר של עיסה על ידי הוספת מים באופן רציף. עם זאת, בטכניקה נוכחית, דיסק יהלום שיניים משמש לבידוד של רקמת מוך, שהיא דרך מהירה לחתוך שן עם זיהום מינימאלי בתהליך צעד אחד, ומצמצם את התחממות היתר של עיסה במהלך תהליך חיתוך. יתר על כן, hDPSCsמחדש סוף הסוף מובחן לodontoblasts שכבר לא בהשוואה במקרה של שיניים קבועות על ידי אדם מטרת דיון. הערכה השוואתית של hDPSCs בדיל (קבוצות ED & OG) על ידי assay S כמותית אליזרין האדום ציינה את הפוטנציאל הגבוה של מינרליזציה hDPSC-ED בהשוואת OG קבוצה. תוצאות אלו גם על ידי QPCR. DSPP, ALP וMEPE כמינרליזציה סמנים מווסתים באחרי בידול odontoblast בשתי הקבוצות. מצד השני, הביטויים של MEPE & ALP היו גבוהים יותר במובחן hDPSC-ED בהשוואה לשליטה. בהסכם עם מחקר קודם על שיניים נשירות 27, תאי גזע שמקורם בשיניים קבועות על ידי שימוש בשיטות בידוד OG ED או גם תערוכת התנהגויות בידול דומות באותם תנאים. יתר על כן, להערכה השוואתית טובה יותר, במחקר זה, הוא hDPSC-ED & hDPSC-OG הייתי מבודד מאותם אנשים.

ביטויים של MSC סמניםד העדר סמני heamatopietic / אנדותל לזהות שני הסוגים של תאי גזע כhDPSCs mesenchymal. מצד השני, תקליטורי 105/146 תקליטורים היו גבוהים יותר בDPSC-OG בהשוואה לקבוצות ED. למרות הראיות הקיימות בהתאם לנוכחות של stro-1 ב31 DPSCs, התוצאות שלנו הראו שום ביטוי של stro-1 בשתי הקבוצות. עם זאת, הגיוון המשמעותי בביטוי סמן משטח במחקרים שונים יכול להיות בגלל התנאים של או הטיפוח כגון מספר מעבר, הרכב של תקשורת וכדומה, או וריאציות interindividual בין תורמים שונים. היעדר stro-1 בשתי הקבוצות עשוי להצביע על כך שהביטוי של סמן זה אולי לא משפיע ישירות על פוטנציאל הבידול odontoblast (לא מוצג בסרטון).

תנאי בידוד hDPSCs שונה עשוי להביא יכולת התמיינות שונה. הבדלים אלה יכולים להיות בגלל קיומו של אוכלוסיות שונות ברקמות העיסה. לפיכך, בחירה במיג שיטות הבידודHT להיות שימושי עבור תיקון ממוקד ברקמה מסוים והתחדשות לגישות קליניות בעתיד. התוצאות שלנו הראו את היכולת הגבוהה של מינרליזציה DPSC מתעכל האנזימטית בהשוואה לאלה שנחלצו מהם. עם זאת, מחקרים נוספים, כגון הערכה של ההיווצרות של מבנה צינורי בחי & במבחנה, נדרשים כדי לקבוע איזה משני הליכים אלה ישימים לדנטין פונקציונלי / טיפולי התחדשות רקמות עיסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מכירים תודה ד"ר ליילה Shakeri & ד"ר עארף Dournaei לדיסקוסם הקריטי ומר מוחמד רזא Khadem שריף לתומך הטכני שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
  3. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
  4. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
  5. Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
  6. Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
  7. Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
  8. Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
  9. Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
  10. de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
  12. Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
  13. Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
  14. Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
  15. Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
  16. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
  17. Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
  18. d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
  19. Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
  20. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
  21. Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
  22. Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
  23. About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
  24. Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
  25. Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
  26. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
  27. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
  28. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
  29. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
  30. d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
  31. Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).

Tags

ביולוגיה של תא גזע גיליון 69 רפואה ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה תאית Bioengineering רקמת מוך שן תאי אדם אדם טוחן 3 שיני עיסת גזע hDPSC Odontoblasts בתאי גזע קטן עליי MSC בידול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B.,… More

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter