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मानव दंत लुगदी स्टेम सेल के अलगाव विशेषता, और तुलनात्मक भेदभाव दो अलग अलग तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से व्युत्पन्न

Published: November 24, 2012 doi: 10.3791/4372
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

विधि या तो का उपयोग करके और मानव दंत लुगदी स्टेम सेल (hDPSCs) के अलगाव के लक्षण वर्णन वर्णित

Abstract

Introduction

स्टेम सेल किसी क्लोन से उत्पन्न होने वाला अथवा उससे बना हुआ है जो कोशिकाओं दो उल्लेखनीय विशेषताएं, बहु - शक्ति और आत्म नवीकरण 15 के रूप में जाना जाता है के अधिकारी कर रहे हैं. अलग replicative potencies साथ सभी स्टेम कोशिकाओं के अलावा, प्रसवोत्तर स्टेम कोशिकाओं के रूप में दंत स्टेम कोशिकाओं को उनकी पहुंच, plasticity, और अन्य वयस्क स्टेम कोशिकाओं 16 के साथ तुलना में उच्च proliferative क्षमता की वजह से हाल के वर्षों में ध्यान आकृष्ट किया है. दिलचस्प है, mesenchymal स्टेम सेल करने के लिए समान है, दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं अनुयायी किसी क्लोन से उत्पन्न होने वाला अथवा उससे बना हुआ है जो कोशिकाओं में एकाधिक भेदभाव mesenchyme क्षमता और / या गैर mesenchyme प्रजातियों, दोनों इन विट्रो में और vivo में हैं 1-8,17,18 DPSCs द्वारा की पहचान कर रहे हैं. उनके नकारात्मक hematopoietic प्रतिजनों की अभिव्यक्ति (जैसे, CD45, CD34, CD14), और CD90 की सकारात्मक अभिव्यक्ति, CD29, CD73, CD105, CD44 और stro 1 19,20.

न्यूनतम दर्द और रुग्णता के साथ आराम से प्राप्त संभावित एक valu के रूप में मानव DPSCsMSCs के लिए सक्षम स्रोत अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम 21 कोशिकाओं के रूप में आम सूत्रों का कहना है, की तुलना में. सामान्य में, DPSCs या तो परिणाम विधि, यानी, लुगदी ऊतक explants (डीपीएससी ओग) 22-24, और / या एंजाइमी (डीपीएससी ईडी) पाचन 4,6,25 द्वारा स्टेम कोशिकाओं के प्रवास से पृथक किया गया है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि अलगाव विधि और संस्कृति शर्तों के तहत इन विट्रो 26,27 मार्ग में विभिन्न आबादी या प्रजातियों को प्रेरित कर सकते हैं. , स्थायी दांत (pDPSCs) के मामले में हुआंग एट अल से पता चला है कि enzymatic पचा pDPSCs पार कर दी DPSCs की तुलना में उच्च प्रसार की क्षमता है 26 इसके अलावा, पर्णपाती दांत (dDPSCs) के मामले में, यह प्रदर्शन किया गया. कि stro-1 और CD34 मार्करों dDPSC-ओग के साथ तुलना में अधिक dDPSC प्रवर्तन निदेशालय में व्यक्त की है. इसके अलावा, dDPSC प्रवर्तन निदेशालय परिभाषित मध्यम / osteo odonto में उच्च खनिज दर प्रदर्शित 27 इसलिए r में DPSCs की बकाया संभावित कारण,egenerative दवा, और अधिक अध्ययन संभव विभिन्न आबादी है जो अलग अलगाव तरीकों से प्राप्त कर रहे हैं की बेहतर समझ के लिए आवश्यक हो जाएगा.

यहाँ, यह लुगदी निकासी की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए एक कदम दंत हीरे डिस्क का उपयोग करने के लिए लुगदी निकासी का आसान तरीका, शुरू करने का प्रयास किया गया था. इसके अलावा, मानव लुगदी व्युत्पन्न प्रवर्तन निदेशालय या ओग तरीकों को लागू करने से स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के बाद, सामान्य और दो समूहों के बीच भेदभाव क्षमता गुण भी जांच की गई.

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Protocol

1. एनजाइम समाधान और प्रसार मध्यम (प्रधानमंत्री) तैयार

  1. Collagenase प्रकार मैं समाधान: बाहर कोलैजिनेज प्रकार मैं वजन (12 मिग्रा / मिली) और 1 मिलीलीटर पीबीएस और फिल्टर में भंग एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग. तो यह 15 मिलीलीटर ट्यूब जगह है और यह -20 डिग्री सेल्सियस पर रखने की जरूरत तक.
  2. Dispase समाधान: बाहर dispase वजन (16 मिग्रा / मिली) और 1 मिलीलीटर पीबीएस और फिल्टर 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर में भंग. तो यह 15 मिलीलीटर ट्यूब जगह है और यह 4 में रखना ° C जरूरत तक.
  3. एंजाइम समाधान करें: 2 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस युक्त में 100 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन 1 मिलीलीटर कोलैजिनेज प्रकार मैं (12 मिग्रा / मिली) समाधान और 1 मिलीग्राम dispase समाधान (16 मिग्रा / मिली) जोड़ें. अंतिम मात्रा में dispase और मैं Collagenase की कुल एकाग्रता 4 मिलीग्राम / मिलीग्राम और 3 मिलीग्राम / एमएल, ग्रहणशीलतापूर्वक होना चाहिए. फिर, अशेष भाजक चार 15 मिलीलीटर ट्यूब, जिनमें से प्रत्येक में 1 मिलीग्राम एंजाइम समाधान में इस मात्रा. प्रत्येक ट्यूब एक लुगदी पाचन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. समाधान धोने: 100 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिग्रा / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन पीबीएस में जोड़ें.
  5. बुनियादी मीडिया: ईगल मध्यम अल्फा संशोधन (α के सदस्य) 10% FBS और 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
  6. बनाओ ईगल मध्यम (α के सदस्य) 10% FBS, 100 सुक्ष्ममापी एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट, 2 मिमी एल glutamine, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल के साथ पूरक की अल्फा संशोधन: प्रसार मीडिया (प्रधानमंत्री) स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.25 मिलीग्राम मिलीग्राम / amphotericin बी
  7. Odontogenic मीडिया बनाओ: ईगल मध्यम अल्फा संशोधन (α - सदस्य) 10% FBS, 100 सुक्ष्ममापी एल ascorbic एसिड 2 - फॉस्फेट, 2 मिमी एल glutamine, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.01 सुक्ष्ममापी के साथ पूरक Dexamethasone, 5 मिमी फॉस्फेट β ग्लिसरॉल, 1.8 मिमी monopotassium फॉस्फेट.

2. चिकित्सकीय पल्प स्टेम सेल Isolatio के लिए मानव दंत लुगदी ऊतक तैयारn

  1. सामान्य मानव तीसरे molars मंजूरी दे दी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के तहत इमाम अली की डेंटल क्लिनिक में वयस्कों (उम्र के 21-29 वर्ष) से ​​एकत्र किए गए.
  2. दांत बुनियादी मध्यम (α - सदस्य 10% FBS साथ पूरक) में रखा गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला में स्थानांतरित
  3. बाँझ शर्त के तहत, एक biohazard लामिना का प्रवाह हुड के भीतर काम कर रहे हैं, सेट प्रत्येक संसाधित करने के दांत के लिए एक 100 मिमी पेट्री डिश किया गया था. दांत सतहों 70% इथेनॉल से साफ कर रहे थे.
  4. जबकि एक पेट्री व्यंजन में काम कर रहे हैं, दांत दंतनिष्कर्षक द्वारा रखा गया था और एक स्केलपेल ब्लेड के लिए रवाना मलबे और जड़ों पर periodontal बंधन को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  5. Cemento - तामचीनी जंक्शन धीरे निष्फल दंत डिस्क का उपयोग कर गूदा कक्ष प्रकट द्वारा काट दिया गया. यह माना जा सकता है कि काटने की प्रक्रिया धीरे - धीरे किया जाना चाहिए दंत ऊतक के overheating को कम करना चाहिए.
  6. पल्प ऊतक धीरे ताज और जड़ से अलग हो गया था. पल्प ऊतक एक स्केलपेल ब्लेड की सहायता से छोटे टुकड़ों में काट दिया गया.

3. मानव दंत लुगदी अलगाव

  1. पल्प ऊतकों गूदा या गूदा hDPSCs के अलगाव के लिए ऊतक explants से प्रत्यक्ष सेल परिणाम ऊतक के या तो enzymatic पृथक्करण लिया.
  2. लुगदी ऊतक के enzymatic पृथक्करण:
    1. लुगदी ऊतकों के छोटे टुकड़े एनजाइम समाधान में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित कर दिया गया है भंवर ऊतक को तोड़ने में मदद करने के लिए हर 30 मिनट.
    2. बाद में, बड़े सेल समुच्चय को हटा रहे थे और एक 70-सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजर द्वारा एकल कक्ष निलंबन प्राप्त किया गया.
    3. एकल कक्ष निलंबन 1200 rpm पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifuged थे.
    4. ध्यान Supernatants बंद pipetted गया और गोली 1 मिलीलीटर प्रसार मध्यम (प्रधानमंत्री) में फिर से निलंबित कर दिया. (नोट: प्रसार माध्यम में FBS को समाप्त जिले enzymaticएसोसिएशन.)
    5. दंत लुगदी का एकल कक्ष निलंबन 25 सेमी 2 प्रधानमंत्री के साथ संस्कृति फ्लास्क में वरीयता प्राप्त किया गया था और तब से 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated.
    6. संस्कृति के माध्यम हर तीन दिन में बदल गया था जब तक सेल confluency हासिल किया गया था.
  3. लुगदी ऊतक explants से प्रत्यक्ष सेल परिणाम:
    1. 1-2-मिमी टुकड़ों में पल्प ऊतक कीमा किया गया था, और प्रत्येक टुकड़ा 25-2 सेमी प्रधानमंत्री के साथ संस्कृति बोतल में रखा गया था और फिर 37 पर incubated डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में. यह माना जा सकता है कि सेल के परिणाम के लिए PM की कुल मात्रा आगे सेल परिणाम के लिए लुगदी टुकड़े (फ्लास्क प्रति 2-3 मिलीग्राम) की कुर्की का समर्थन चाहिए.
    2. मध्यम परिणाम के बाद मनाया गया बदल गया था.
    3. संगम पर पार कर दी कोशिकाओं 01:04 के अनुपात (1 मार्ग) पर उप सुसंस्कृत थे.

4. Immunophenotyping

  1. 250.000 कोशिकाओं /3 मार्ग में कोशिकाओं के दोनों प्रकार के ट्यूब पीई या FITC संयुग्मित उनके आइसोटाइप के साथ विरोधी मानव एंटीबॉडी द्वारा 4 ° C जगह अंधेरे में 30 मिनट के लिए incubated रहे थे. (नोट: एंटीबॉडी की एकाग्रता निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार लागू किया गया था.)
  2. ऊष्मायन समय के बाद, 100 μl पीबीएस या FACS कमजोर पड़ने समाधान प्रत्येक ट्यूब को जोड़ा गया है और जगह अंधेरे में 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर centrifuged.
  3. Supernatants हटा दिया और छर्रों 100 μl पीबीएस या अंधेरी जगह में FACS कमजोर पड़ने में फिर से निलंबित कर दिया गया.
  4. लक्षित सतह मार्कर (सीडी मार्कर) बी.डी. FACSCalibur द्वारा मूल्यांकन किया गया.

5. DPSCs की भेदभाव की के mineralized कोशिकाओं में प्रवेश एवं ऐलिजारिक लाल परख quantified

  1. है कि या तो लुगदी ऊतक के enzymatic पृथक्करण (डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय के रूप में जाना जाता है) या लुगदी ऊतक explants (डीपीएससी ओग) से प्रत्यक्ष परिणाम सेल द्वारा प्राप्त किया गया DPSCs 3 मार्ग के लिए उप सुसंस्कृत थे.
  2. एक3 Passage टी, कोशिकाओं को एक 6 अच्छी तरह से थाली में / अच्छी तरह +५००० सेल में बीज थे.
  3. 60% के संगम पर, odontogenic मध्यम पारंपरिक PM द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है. तीन कुओं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में विकास के माध्यम जोड़कर बनी गया.
  4. मध्यम हर 3 दिन बदल 21 दिन तक.
  5. 21 दिन, कोशिकाओं पीबीएस के साथ धोया गया और 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10% paraformaldehyde द्वारा तय किए गए थे.
  6. तब paraformaldehyde बंद pipetted किया गया था, ध्यान और कोशिकाओं आसुत एच 2 ओ के साथ 3 बार (प्रत्येक समय के लिए 5-10 मिनट) धोया गया (नोट: monolayer परेशान करने से बचने.)
  7. धोने के बाद, 1 / एमएल अच्छी तरह से मजीठ लाल एस कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए जोड़ा गया था.
  8. कोशिकाओं विआयनीकृत एच 2 हे चार बार (सौम्य कमाल के साथ हर बार के लिए 5 मिनट) से धोया गया था किसी भी अतिरिक्त मजीठ लाल हटा.
  9. 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से एच 2 हे सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए जोड़ा गया था.
  10. प्लेटें दृश्य इन करने के लिए मान लिया गयाpection और / या छवि अधिग्रहण.
  11. मजीठ लाल मात्रा का ठहराव परख के लिए एच 2 हे 1 मिलीग्राम 6 अच्छी तरह से और झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए थाली सेते के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10% एसिटिक एसिड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया.
  12. फिर, सेल / monolayer परिमार्जन और दोनों एसिटिक एसिड और कोशिकाओं को अलग 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया था. (नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से हस्तांतरण एक अलग ट्यूब यानी तीन टेस्ट और प्रत्येक समूहों के लिए प्रवर्तन निदेशालय ओग कुओं नियंत्रण तीन कुओं में होना चाहिए.)
  13. ट्यूब सख्ती से 30 सेकंड के लिए vortexed थे.
  14. 85 करने के लिए गर्मी ° C 10 मिनट के लिए. (नोट: वाष्पीकरण से बचने के लिए, ट्यूब parafilm साथ सील किया गया है.)
  15. गर्म करने के बाद, ट्यूब बर्फ में 5 मिनट के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. ट्यूब (नोट: ठंडा तक बनने के नहीं खोला जाना चाहिए.)
  16. slurries 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifuged थे. जबकि centrifuging, मजीठ लाल मानकों किए गए थेऊपर.

मजीठ लाल मानक पहले कमजोर पड़ने बफर गिराए और 2 गुना धारावाहिक तालिका के आधार पर dilutions बनाने के लिए इस्तेमाल किया द्वारा तैयार किए गए थे.

डाई के उच्च श्रेणी एकाग्रता डाई की कम दूरी की एकाग्रता
2 मिमी 1 मिमी 500 सुक्ष्ममापी 250 सुक्ष्ममापी 125 सुक्ष्ममापी 62.5 सुक्ष्ममापी 31.3 सुक्ष्ममापी 15.6 सुक्ष्ममापी 7.8 सुक्ष्ममापी 3.9 सुक्ष्ममापी 1.9 सुक्ष्ममापी 0.9 सुक्ष्ममापी 0.4 सुक्ष्ममापी रिक्त
  1. Centrifugation के बाद, तैरनेवाला / ट्यूब के 1 मिलीलीटर नए अलग 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया.
  2. पीएच ~ 375 10 μl के साथ neutralized किया गया था% ट्यूब प्रति अमोनियम हाइड्रॉक्साइड. (नोट: पीएच क्रोध 4.1-4.5 होना चाहिए.)
  3. मानक और नमूने (अलग परीक्षणों और नियंत्रण भी शामिल है) की 150 μl एक अपारदर्शी दीवारों, पारदर्शी 96 अच्छी तरह से थाली नीचे में जोड़ा गया था.
  4. absorbance 405 एनएम पर पढ़ा था और नमूनों से आयुध डिपो मूल्यों आगे के विश्लेषण के लिए मानक साजिश के साथ तुलना की गई.

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Representative Results

  1. Enzymatic पृथक्करण (डीपीएससी ईडी) द्वारा प्राप्त किया गया DPSCs कि यहाँ 10 दिन, 15,18 (1 चित्रा) में दिखाया जाता है अलगाव के बाद लगभग 3 से 5 दिन पर फार्म शुरू कालोनियों.
  2. पार कर दी DPSCs (डीपीएससी ओग) दिन 5, 10, 13 और 18 पर 2 चित्र में दिखाए जाते हैं fibroblast कोशिकाओं की तरह समानांतर बोने के बाद लगभग 5 दिनों से आदेश द्वारा फ्लास्क में लुगदी ऊतक से पलायन शुरू कर दिया है.
  3. चित्रा 3 में 3 बीतने के दोनों तरीकों का उपयोग कर DPSCs दिखाए जाते हैं DPSCs दोनों प्रकार के लगभग एक ही आकार और आकृति विज्ञान में थे.
  4. डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय और डीपीएससी ओग (4 चित्रा) में परिणाम Immunophenotyping इन परिणामों CD44, CD73 CD105, और CD90 के रूप में mesenchymal स्टेम सेल मार्कर की उपस्थिति, और ऐसे CD34, CD45 और CD11b hematopoietic और endothelial मार्करों के अभाव का संकेत . CD105 और CD146 (perivascular मार्कर) के भाव डीपीएससी ओग में डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय के साथ तुलना में अधिक थे.Stro-1 दोनों समूहों में नकारात्मक था. (ब्लू लाइनों ओग समूह को भेजा, जबकि लाल एक प्रवर्तन निदेशालय को भेजा लाइनों, पीले रंग की लाइनों आइसोटाइप संकेत दिया.)
  5. मजीठ लाल आकारिकी और 21 दिन डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय और डीपीएससी ओग में mineralized ऊतक गठन के मूल्यांकन के लिए मात्रा का ठहराव परिणाम चित्रा 5 में दिखाया जाता है अधिक अवशोषित लाल रंग अधिक कैल्शियम बयान. इन परिणामों विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय (घ) में डीपीएससी ओग (ग) के साथ तुलना में अधिक कैल्शियम बयान से संकेत मिलता है. (तीन प्रतियों तकनीकी अनुकरण) ऐलिजारिक लाल एस की मात्रा का ठहराव भी ओग समूहों के साथ तुलना में महत्वपूर्ण (*) डीपीएससी डाई के बीच प्रवर्तन निदेशालय के उच्च एकाग्रता संकेत दिया. (डाई एकाग्रता भी काफी परीक्षण और प्रत्येक समूह के नियंत्रण (ईडी या ओग) के बीच जो भेदभाव की प्रक्रिया के बाद कैल्शियम बयान संकेत कर रहे हैं (** ***) वृद्धि हुई है)

(नोट: एक बनती टी परीक्षण विश्लेषण में मतभेद का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाmineralized मैट्रिक्स की राशि भेदभाव के शामिल होने के बाद प्रवर्तन निदेशालय और ओग समूहों का उत्पादन किया. परिणाम ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त किया गया. (पी के लिए ग्रहण महत्व <0.05)

  1. Odontoblast और mineralized संबंधित जीनों की अभिव्यक्ति (DSPP) और (MEPE, एएलपी) क्रमशः में विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय और डीपीएससी ओग चित्रा 6 में दिखाया जाता है, के qPCR परिणाम है. इन परिणामों महत्वपूर्ण ALP और MEPE के विनियमन संकेत प्रवर्तन निदेशालय और ओग समूहों के भेदभाव के बाद. इस बीच, ALP और MEPE भाव विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय में काफी उच्च विभेदित डीपीएससी-ओग की तुलना में थे. हालांकि, वहाँ DSPP की अभिव्यक्ति में दोनों समूहों (हाउसकीपिंग जीन: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5 monooxygenase सक्रियण प्रोटीन (YWHAZ)) के बीच विभेदित कोशिकाओं में कोई अंतर नहीं है 28.

(नोट: qPCR डेटा तुलनात्मक सीटी विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया गया देहात IRED टी परीक्षण विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति में प्रवर्तन निदेशालय और पहले और बाद में भेदभाव, और भी दो गुटों के विभेदित कोशिकाओं के बीच ओग समूहों के बीच मतभेद का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. परिणाम ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त किया गया. (<0.05 पी के लिए ग्रहण महत्व) (तीन प्रतियों तकनीकी अनुकरण)

चित्रा 1
10 दिन, 15 और 18 में 1 चित्रा Enzymatic dissociated डीपीएससी (डीपीएससी ईडी). बढ़ाई बार = 200 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2
चित्रा 2 दिन 5, 10, 13 और 18 पर DPSCs (डीपीएससी ओग) पार कर दी. बढ़ाई बार = 200 सुक्ष्ममापी.

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चित्रा 3 पार कर दी (डीपीएससी ओग) DPSCs और enzymatic पच (डीपीएससी ईडी) DPSCs 3 मार्ग में morphologies. आवर्धन बार = 200 सुक्ष्ममापी बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय (गहरे लाल) और डीपीएससी ओग (नीला) में परिणाम immunophenotyping के मढ़ा हिस्टोग्राम. (पीला लाइनों आइसोटाइप का प्रतिनिधित्व करते हैं). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 5 मजीठ लाल विभेदित डीपीएससी (ग) - ओग, और विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय (घ) में धुंधला हो जाना परिणाम (क) और (ख) नियंत्रण करने के लिए भेजा. मजीठ एस लाल परख की मात्रा अधिक डाई विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय में विभेदित ओग समूह (ई) की तुलना में अवशोषण दिखा बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
6 चित्रा. Odontoblast और mineralized संबंधित जीनों की अभिव्यक्ति (DSPP) और (MEPE, एएलपी) क्रमशः विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय और में डीपीएससी - ओग qPCR परिणाम है. विभेदित कोशिकाओं में MEPE, ALP और DSPP की अभिव्यक्ति की पुष्टि की नियंत्रण तुलना दोनों समूहों की दंतोत्पादककोशिका में भेदभाव (एसी). इन rप्रवर्तन निदेशालय और ओग समूहों के भेदभाव के बाद esults महत्वपूर्ण ALP और MEPE के विनियमन के संकेत (और एक ख). इस बीच, ALP और MEPE भाव विभेदित डीपीएससी प्रवर्तन निदेशालय में काफी उच्च विभेदित डीपीएससी ओग (एक और ख) की तुलना में थे. हालांकि, वहाँ दोनों समूहों (ग) (हाउसकीपिंग जीन: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5 monooxygenase सक्रियण प्रोटीन, YWHAZ) विभेदित कोशिकाओं में DSPP की अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

इस प्रोटोकॉल और दंत लुगदी से hDPSCs दो तरीकों, enzymatic पृथक्करण और लुगदी ऊतक explants से स्टेम कोशिकाओं का सीधा परिणाम का उपयोग कर के अलगाव के लक्षण वर्णन की प्रक्रिया का वर्णन करता है. इसके अलावा, इन कोशिकाओं के ओडॉन्टोब्लास्ट में इन विट्रो में भेदभाव, मात्रात्मक मजीठ लाल परख और qPCR द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

मानव दांत लुगदी ऊतक से अलग करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल (अस्थि संदंश) सरौता 9, तबाही सुई 29, Gracey curette 30, दंत विदर burs 4, आदि उन तरीकों समय लेने वाली हैं, जबकि निम्न स्तर पर विचार के रूप में विभिन्न उपकरणों का इस्तेमाल किया गया था पानी लगातार जोड़कर लुगदी के overheating. हालांकि, मौजूदा तकनीक में, दंत हीरा डिस्क लुगदी ऊतक है, जो एक तेजी से करने के लिए एक कदम प्रक्रिया में न्यूनतम संदूषण के साथ दांत काट के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक काटने की प्रक्रिया के दौरान लुगदी के overheating कम से कम है. इसके अलावा, एक hDPSCsफिर अंत में ओडॉन्टोब्लास्ट है कि चर्चा की उद्देश्य से मानव स्थायी दांत के मामले की तुलना में कभी नहीं किया गया है में विभेदित. विभेदित hDPSCs मात्रात्मक मजीठ एस लाल परख द्वारा (प्रवर्तन निदेशालय ओग समूहों) का तुलनात्मक मूल्यांकन hDPSC प्रवर्तन निदेशालय के उच्च ओग समूह के साथ तुलना में खनिज संभावित संकेत दिया. ये परिणाम भी qPCR द्वारा की पुष्टि की है. DSPP ALP, और खनिज के रूप में MEPE विनियमित odontoblast भेदभाव के बाद दोनों समूहों में मार्करों. दूसरी ओर, MEPE और ALP के भाव विभेदित hDPSC प्रवर्तन निदेशालय में उच्च नियंत्रण की तुलना में थे. पर्णपाती 27 दांत के बारे में पिछले अध्ययन के साथ समझौते में, प्रवर्तन निदेशालय या ओग अलगाव तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से निकाली गई स्टेम कोशिकाओं को भी एक ही परिस्थितियों में इसी तरह के भेदभाव व्यवहार दिखा रहे हैं. इसके अलावा, बेहतर तुलनात्मक मूल्यांकन के लिए, इस अध्ययन में, दोनों hDPSC प्रवर्तन निदेशालय और hDPSC ओग एक ही व्यक्ति से अलग थे.

एमएससी के एक्सप्रेशंस मार्करोंघ heamatopietic / endothelial मार्करों के अभाव mesenchymal स्टेम सेल के रूप में hDPSCs के दोनों प्रकार की पहचान. दूसरी ओर, 105 सीडी / 146 सीडी डीपीएससी-ओग में अधिक प्रवर्तन निदेशालय समूहों की तुलना में थे. 31 DPSCs में stro-1 की उपस्थिति के अनुसार मौजूदा सबूत होने के बावजूद, हमारे परिणाम दोनों समूहों में stro-1 का कोई अभिव्यक्ति दिखाया. हालांकि, विभिन्न अध्ययनों में सतह मार्कर अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण विविधता या तो बीतने के नंबर, मीडिया की संरचना, आदि या विभिन्न दाताओं के बीच interindividual बदलाव के रूप में खेती की स्थिति के लिए कारण हो सकता है. दोनों समूहों में stro - एक के अभाव संकेत मिलता है कि इस मार्कर की अभिव्यक्ति सीधे odontoblast भेदभाव की क्षमता को प्रभावित नहीं कर सकते (वीडियो में दिखाया नहीं) हो सकता है.

विभिन्न hDPSCs अलगाव हालत अलग भेदभाव क्षमता लाने के लिए हो सकता है. इन मतभेदों लुगदी ऊतकों में विभिन्न आबादी के अस्तित्व के कारण हो सकता है. इस प्रकार, अलगाव तरीकों मिग का चयनht लक्षित ऊतक विशिष्ट और भविष्य के नैदानिक ​​दृष्टिकोण के लिए मरम्मत के उत्थान के लिए उपयोगी हो सकता है. हमारे परिणाम पार कर दी लोगों की तुलना में उच्च enzymatic पचा डीपीएससी के खनिज क्षमता का संकेत है. हालांकि, vivo में इन विट्रो में ट्यूबलर संरचना के गठन के आकलन के रूप में अतिरिक्त अध्ययन, निर्धारित करने के लिए इन दो प्रक्रियाओं में से एक जो कार्यात्मक dentin / लुगदी ऊतक पुनर्जनन के उपचारों के लिए लागू है करने के लिए आवश्यक हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम कृतज्ञता उनके महत्वपूर्ण और अपने तकनीकी समर्थन के लिए डिस्कस श्री मोहम्मद रजा Khadem शरीफ के लिए डॉ. लीला Shakeri और डॉ. Aref Dournaei को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1

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References

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मानव दंत लुगदी स्टेम सेल के अलगाव विशेषता, और तुलनात्मक भेदभाव दो अलग अलग तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से व्युत्पन्न
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Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B.,… More

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).

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