Summary

SNARE蛋白介导的膜融合酶的细胞融合含量的分析

Published: October 19, 2012
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Summary

我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。

Abstract

T-SNARE蛋白的相互作用的SNARE(oluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子一个的重整 ttachment蛋白受体)的目标膜蛋白在囊泡(V-SNARE蛋白)和()催化细胞内的囊泡融合1-4。重组分析是必不可少的解剖机制和调节SNARE蛋白介导的膜融合5。在细胞融合实验6,7中 ,异位SNARE蛋白表达在细胞表面。这些“翻转”SNARE蛋白驱动细胞与细胞融合,展示,网罗足够细胞膜融合。由于测定是基于微观分析的细胞融合,它是低效率的,使用时,多个的v-叔SNARE相互作用定量分析。

在这里,我们描述了一种新的检测的量化β-半乳糖苷酶的活性表达的SNARE蛋白介导的细胞融合。二在Tet-关基因表达系统9的组件被用作读出系统:四环素控制的反式激活(tTA的)和四环素反应元件(TRE-LacZ的)的控制下,编码的LacZ基因的报道质粒。我们tTA的转染到COS-7细胞表达翻转的v-SNARE蛋白在细胞表面(的v-细胞)和TRE-LacZ基因转染到COS-7细胞表达翻转叔SNARE蛋白在细胞表面(t细胞) 。 SNAP-依赖的融合的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE,LacZ和β-半乳糖苷酶的表达的转录激活。 β-半乳糖苷酶的活性,使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度进行定量。

囊泡相关膜蛋白(VAMPS),是V-SNARE蛋白驻留在不同的后高尔基体泡状车厢10-15。鞋面1,3,4,5,7和8,在相同的水平表达,我们比较了它们的膜融合活动中使用的酶的细胞融合实验。基于光谱测量,该法提供了一个量化的方法分析SNARE蛋白介导的膜融合,为高通量研究。

Protocol

1。细胞培养和转染补充与4.5克/升葡萄糖和10%牛胎儿血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)中培养COS-7细胞。 根据制造商的说明(Invitrogen公司),与Lipofectamine质粒转染。 2。 SNARE细胞表面表达的荧光显微分析转染前一天,3×10 4个 COS-7细胞接种在无菌的12毫米的盖玻片(Fisher Scientific)的24孔培养板中所载。 对于v-细胞,在各?…

Representative Results

要制定一个定量的细胞融合实验,我们利用强有力的转录激活TTA到TRE的结合。在tTA的的情况下,转录的 LacZ基因在TRE-LacZ的是无声的。 tTA的存在时,它的TRE结合并激活的 LacZ基因的转录, 图1示出了流程图的酶的细胞融合实验。 tTA的转染到v-细胞表达的v-SNARE蛋白在细胞表面,和TRE-LacZ基因转染到t细胞,在细胞表面的表达叔SNARE蛋白。的v-和T-细胞的查询结果中?…

Discussion

原细胞融合实验6荧光显微镜决定SNARE蛋白介导的细胞融合。在这里,我们描述了一个创新的分析,量化SNARE蛋白介导的细胞融合,通过激活β-半乳糖苷酶的表达和光谱测量。使用这个实验中,我们经常分析15 – V-20和T-SNARE组合在一个单一的实验。使用流式细胞仪来测量圈套在细胞表面的表达,我们滴定的鞋面的表达水平,并比较它们的膜融合的能力(图2和图4)。此外,使用的酶的细胞融?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作是支持的大学,路易斯维尔和CA135123从美国国立卫生研究院(CH)的启动资金。

Materials

Name of reagent and equipment Company Catalog number
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

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Cite This Article
Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

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