我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。
T-SNARE蛋白的相互作用的SNARE(oluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子一个的重整 ttachment蛋白受体)的目标膜蛋白在囊泡(V-SNARE蛋白)和()催化细胞内的囊泡融合1-4。重组分析是必不可少的解剖机制和调节SNARE蛋白介导的膜融合5。在细胞融合实验6,7中 ,异位SNARE蛋白表达在细胞表面。这些“翻转”SNARE蛋白驱动细胞与细胞融合,展示,网罗足够细胞膜融合。由于测定是基于微观分析的细胞融合,它是低效率的,使用时,多个的v-叔SNARE相互作用定量分析。
在这里,我们描述了一种新的检测的量化β-半乳糖苷酶的活性表达的SNARE蛋白介导的细胞融合。二在Tet-关基因表达系统9的组件被用作读出系统:四环素控制的反式激活(tTA的)和四环素反应元件(TRE-LacZ的)的控制下,编码的LacZ基因的报道质粒。我们tTA的转染到COS-7细胞表达翻转的v-SNARE蛋白在细胞表面(的v-细胞)和TRE-LacZ基因转染到COS-7细胞表达翻转叔SNARE蛋白在细胞表面(t细胞) 。 SNAP-依赖的融合的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE,LacZ和β-半乳糖苷酶的表达的转录激活。 β-半乳糖苷酶的活性,使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度进行定量。
囊泡相关膜蛋白(VAMPS),是V-SNARE蛋白驻留在不同的后高尔基体泡状车厢10-15。鞋面1,3,4,5,7和8,在相同的水平表达,我们比较了它们的膜融合活动中使用的酶的细胞融合实验。基于光谱测量,该法提供了一个量化的方法分析SNARE蛋白介导的膜融合,为高通量研究。
原细胞融合实验6荧光显微镜决定SNARE蛋白介导的细胞融合。在这里,我们描述了一个创新的分析,量化SNARE蛋白介导的细胞融合,通过激活β-半乳糖苷酶的表达和光谱测量。使用这个实验中,我们经常分析15 – V-20和T-SNARE组合在一个单一的实验。使用流式细胞仪来测量圈套在细胞表面的表达,我们滴定的鞋面的表达水平,并比较它们的膜融合的能力(图2和图4)。此外,使用的酶的细胞融?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的大学,路易斯维尔和CA135123从美国国立卫生研究院(CH)的启动资金。