Summary
We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.
Abstract
De interacties van SNARE (s oluble N-ethylmaleimide-gevoelige factor een ttachment eiwit re Ceptor) eiwitten op blaasjes (v-snaren) en op doel membranen (t-snaren) katalyseren intracellulaire vesikels fusie 1-4. Reconstitutie testen zijn essentieel voor het ontleden van het mechanisme en de regeling van SNARE-gemedieerde membraanfusie 5. In een celfusie assay 6,7 worden SNARE eiwitten ectopisch tot expressie op het celoppervlak. Deze "omgedraaid" SNARE eiwitten schijf cel-cel fusie waaruit blijkt dat SNAREs volstaan om celmembranen fuseren. Omdat de celfusie test is gebaseerd op microscopische analyse is minder efficiënt bij gebruik van meerdere v-en t-SNARE interacties kwantitatief te analyseren.
Hier beschrijven we een nieuwe assay 8 dat SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase. Tweecomponenten van het Tet-Off genexpressiesysteem 9 gebruikt als uitleessysteem: de tetracycline-gecontroleerde transactivator (tTA) en een reporter plasmide dat het LacZ gen onder controle van de tetracycline-response element (TRE-LacZ) codeert. We transfecteren tTA in COS-7 cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak (v-cellen) en transfecteren TRE-LacZ gedraaid in COS-7 cellen die t-SNARE eiwitten omgedraaid op het celoppervlak (T-cellen) . SNARE-afhankelijke fusie van het v-en T-cellen resulteert in de binding van tTA met TRE de transcriptie-activering van LacZ en expressie van β-galactosidase. De activiteit van β-galactosidase wordt gekwantificeerd met een colorimetrische methode absorptie bij 420 nm.
De blaasjes-geassocieerde membraaneiwitten (vamps) zijn v-SNAREs die zich in verschillende post-Golgi vesiculaire compartimenten 10-15. Uitspreken vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 op hetzelfde niveau vergelijken we de membraanfusieactiviteiten met de enzymatische assay celfusie. Op basis van spectrometrische meting, deze test biedt een kwantitatieve benadering voor het analyseren van SNARE-gemedieerde membraanfusie en voor high-throughput studies.
Protocol
1. Celkweek en transfectie
- COS-7 cellen worden gekweekt in Dulbecco Modified Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 4,5 g / l glucose en 10% foetaal bovine serum (FBS).
- Plasmide transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine volgens de fabrikant (Invitrogen).
2. Fluorescentie microscopische analyse van het celoppervlak SNARE Expression
- De dag voor transfectie, 3 x 10 4 COS-7 cellen worden gezaaid op steriele 12 mm dekglaasjes (Fisher Scientific) in 24-well platen.
- Voor v-cellen in elk putje, 0,25 ug van het plasmide dat codeert tTA (ptet-Off, CLONTECH) wordt gecotransfecteerd met 0,25 ug van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid vamps.
- Voor T-cellen in elk putje wordt 0,25 ug van het plasmide dat codeert TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) gecotransfecteerd met 0,25 ug elk van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid SNAP-25 en syntaxins 1 of 4.
- 24 uur na transfection de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS + + (PBS aangevuld met 0,1 g / l CaCl2 en 0,1 g / l MgCl2) gedurende 10 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 30 minuten.
- De cellen worden geïncubeerd gedurende 1,5 uur met anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 (neat hybridoma supernatant).
- Na vier wasbehandelingen met PBS + + worden de cellen geïncubeerd gedurende 1 uur met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (Jackson Immunoresearch Laboratories) bij een verdunning van 1:500.
- Na vier wasbehandelingen met PBS + +, de gelabelde cellen worden gemonteerd verlengen Gold antifade reagens (Invitrogen).
- Confocale beelden worden verzameld op een Olympus laser scanning confocale microscoop. De beelden worden verwerkt met de Adobe Photoshop-software.
3. FACS-analyse van het celoppervlak SNARE Expression
- De dag voor transfectie, 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen.
- 24 uur na transfection met de gespiegelde SNARE, ptet-Off en pBI-G plasmiden worden cellen gefixeerd met 1% paraformaldehyde in PBS + + gedurende 15 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 15 minuten.
- De cellen worden geïncubeerd met het anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 gedurende 60 minuten.
- Na drie wassingen met PBS + + de cellen gelabeld met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:200 verdunning) gedurende 45 minuten.
- Na drie wassingen met PBS + +, worden de cellen van de platen geschraapt met een celschraper.
- 15.000 cellen worden geanalyseerd met een FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk monster wordt verkregen met de CellQuest Pro software.
4. Enzymatische celfusie Assay
- De dag voor transfectie, 1,2 x 10 6 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elke 100 mm weefselkweekplaat en 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen.
- Voor v-cellen, 0,5 - 5 ug elk Flipped VAMP plasmide wordt gecotransfecteerd met 5 ug ptet-Off in de cellen in elke 100 mm kweekschaal. Controle cellen gecotransfecteerd met de lege vector pcDNA3.1 (+) en ptet-Off. De N-glycosylering van vamps 1, 4, 5, 7 en 8, tunicamycine voorkomen (10 ug / ml) opgenomen in celkweekmedium gedurende transfectie.
- Voor T-cellen in elk putje van de 6-well platen, 1 ug omgedraaid SNAP-25 plasmide en pBI-G worden gecotransfecteerd met 0,5 ug omgedraaid syntaxin1 plasmide of 0,05 ug plasmide syntaxin4 omgedraaid.
- 24 uur na transfectie worden de v-cellen losgemaakt van de kweekschalen enzymvrije Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Losgemaakte cellen worden geteld met een hemacytometer en geresuspendeerd in HEPES gebufferde DMEM aangevuld met 10% FBS, 6,7 ug / ml tunicamycine en 0,67 mM DTT.
- 4,8 x 10 5 geresuspendeerd v-cellen toegevoegd aan elk putje reeds de T-cellen.
- Na 6, 12 of 24 uur rat 37 ° C in 5% CO2
- Na 90 min wordt de colorimetrische reactie gestopt door toevoeging van 1 M natriumcarbonaat.
- Absorptie bij 420 nm gemeten met een HITACHI 100-40 spectrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een kwantitatieve celfusie test te ontwikkelen, wij profiteren van de sterke transcriptionele activering door de binding van tTA aan TRE. In afwezigheid van tTA, transcriptie van het lacZ gen in TRE-LacZ zwijgt. Wanneer tTA aanwezig is, bindt aan het TRE en activeert de transcriptie van LacZ. Figuur 1 toont een stroomdiagram van de enzymatische assay celfusie. tTA getransfecteerd in v-cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak en TRE-LacZ getransfecteerd in t-cellen die t-SNARE eiwitten aan het celoppervlak. Fusie van de v-en T-cellen resulteert in de binding van tTA met TRE de transcriptie-activering van LacZ, en de expressie van β-galactosidase.
Figuur 2A toont de domeinstructuur van omgedraaid SNARE constructen. De preprolactin signaalsequentie gefuseerd aan de N-termini van SNAREs. Deze geconstrueerde SNAREs worden 'omgedraaid'SNAREs omdat de oriëntatie van hun SNARE motieven tegen cellulaire membranen wordt omgedraaid. Wanneer COS-7 cellen getransfecteerd met plasmiden SNARE omgedraaid, gespiegeld SNARE eiwitten tot expressie op het celoppervlak (Figuur 2B). Flowcytometrie wordt gebruikt om de expressie van eiwitten SNARE meten op het celoppervlak (Figuren 2C en D). Om hun membraanfusie vermogen vergelijken vamps moeten worden uitgedrukt op hetzelfde niveau. Daarom hebben we getitreerd en geoptimaliseerd de concentratie van elke omgedraaid SNARE plasmide transfectie gebruikt. Omgedraaid SNARE plasmiden worden getransfecteerd bij de volgende concentraties (per 10 cm2 groeigebied, dwz per putje in 6-well platen): VAMP1, 0,2 ug, VAMP3, 0,5 ug, VAMP4, 0,5 ug, VAMP5, 0,05 ug; VAMP7, 1,0 ug; VAMP8, 0,1 ug, syntaxin1, 0,5 ug, syntaxin4, 0,05 ug. tTA, TRE-LacZ en bladerde SNAP-25 werden gecotransfecteerd bij 1 ug per 10 cm 2 groeigebied. Onder such voorwaarden vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 worden uitgedrukt op hetzelfde niveau, terwijl syntaxins 1 en 4 zijn uitgedrukt op hetzelfde niveau aan het celoppervlak (Figuur 2D). Zoals getoond door confocale en fasecontrastbeeld analyse (Figuur 2E) is 80% van de COS-7 cellen getransfecteerd met plasmiden SNARE omgedraaid. Dual labeling beeldanalyse (figuur 2F) blijkt dat 70% van de getransfecteerde cellen zowel v-tTA expressie en omgekeerd VAMP eiwitten. Omdat het LacZ gen in TRE-LacZ niet uitgedrukt voor celfusie, we niet in staat om het percentage getransfecteerde t-cellen die zowel TRE-LacZ expressie en omgekeerd t-SNARE eiwitten te bepalen.
De neuronale SNAREs (v-SNARE VAMP2 en t-SNAREs syntaxin1 en SNAP-25) dat synaptische exocytose bemiddelen worden gebruikt om de haalbaarheid van de assay. Immers, wanneer v-cellen die VAMP2 en t-cellen die syntaxin1/SNAP-25 gecombineerd, robuuste β-Galactosidase expressie wordt gedetecteerd (Figuur 3). Wanneer echter zowel VAMP2 of SNAP-25 niet tot expressie wordt gebracht, slechts basislijn β-galactosidase activiteit gedetecteerd, hetgeen aangeeft dat celfusie en de expressie van β-galactosidase afhankelijk interacties van v-en t-SNAREs. Deze resultaten geven aan dat de enzymatische assay celfusie fusogenische paringen tussen v en t-SNAREs efficiënt identificeert.
Door expressie van eiwitten VAMP op hetzelfde niveau op het celoppervlak (figuur 2D), vergelijken we de membraanfusie activiteiten. Met de t-SNAREs syntaxin1/SNAP-25, vamps 1, 3 en 8 hebben vergelijkbare en de hoogste fusieactiviteiten, dat vamps 4 en 7 hebben 50% en 30% lager fusieactiviteiten respectievelijk (Figuur 4). Wanneer daarentegen VAMP5 wordt gecombineerd met de t-SNAREs wordt alleen basislijn β-galactosidase activiteit gedetecteerd (figuur 4), wat suggereert dat VAMP5 niet membraanfusie rijden met de syntaxin1/SNAP-25.
Figuur 1. Celfusie Enzymatische assay. tTA wordt gecotransfecteerd met omgedraaid v-SNARE plasmiden, en TRE-LacZ wordt gecotransfecteerd met omgedraaid t-SNARE plasmiden. De fusie van v-en T-cellen leidt tot de binding van tTA met TRE en de expressie van β-galactosidase, die wordt gemeten door een colorimetrische methode.
Figuur 2. Expressie van SNAREs omgedraaid op het celoppervlak. (A) Domein structuur van omgedraaid SNAREs. De preprolactin signaalsequentie (SS) is gefuseerd aan de N-termini van SNAREs en een Myc-label wordt ingevoegd tussen de signaalsequentie en het SNARE motieven (coiled-coil). (B) COS-7 cellen gecotransfecteerd met tTA en de lege vector pcDNA3.1 (+) of omgekeerd VAMP5 plasmide. 24uur na transfectie worden unpermeabilized cellen gekleurd met anti-myc monoklonaal antilichaam. Vertegenwoordiger single-slice confocale beelden worden getoond. (C en D) 24 uur na cotransfectie met tTA en pcDNA3.1 (+) of omgekeerd vamps (v-cellen) of 24 uur na cotransfectie met TRE-LacZ, omgedraaid SNAP-25 en syntaxins 1 of 4 (T-cellen ) worden unpermeabilized cellen gekleurd met anti-Myc antilichaam en geanalyseerd door doorstroomcytometrie. (C) Representative FACS profielen van de cellen getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) of omgekeerd VAMP1 plasmide. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk monster bepaald volgens de CellQuest Pro software. (D) In vamps expressie op hetzelfde niveau express syntaxins 1 en 4 op hetzelfde niveau op het celoppervlak, omgedraaid SNARE plasmiden worden getitreerd op concentraties. Getoond worden de gemiddelde fluorescentie intensiteit van kleuring van het celoppervlak de SNARE eiwitten. Foutbalken vertegenwoordigen spreiding van 4 onafhankelijke experimenten. (E en F) 24 uur na cotransfe ction met tTA en omgedraaid VAMP5 plasmide worden cellen permeablized met 0,2% Triton X-100 in PBS + + en (E) gekleurd met het anti-Myc antilichaam of (F) dual gekleurd met anti-myc monoklonaal antilichaam en een polyklonaal antilichaam tegen het Tet-repressor (tTA te detecteren). (E) getoond zijn representatief confocale en fase contrast. Het aantal getransfecteerde cellen die gelabeld door het anti-Myc antilichaam (VAMP5) en het totale aantal cellen in het fasecontrastbeeld kanaal geteld (n = 60 cellen), en transfectie-efficiëntie wordt berekend (80%). (F) Het aantal getransfecteerde cellen die zowel VAMP5 en tTA expressie, en het totale aantal getransfecteerde cellen die VAMP5, tTA of beide geteld (n = 75 getransfecteerde cellen). Het percentage van de getransfecteerde cellen die zowel VAMP5 en tTA expressie wordt berekend (70%). Scale bars, 20 pm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Celfusie afhankelijk van de interacties van v-en t-SNAREs. v-cellen die tTA en VAMP2 geïncubeerd met t-cellen die TRE-LacZ, syntaxin1 en SNAP-25. Na 24 uur worden de cellen gelyseerd en de activiteit van β-galactosidase in de cellysaten wordt bepaald met een colorimetrische methode absorptie bij 420 nm. Alleen basislijn b-galactosidase-activiteit wordt gedetecteerd wanneer ofwel omgedraaid VAMP2 of SNAP-25 plasmide wordt weggelaten uit transfectie.
Figuur 4. Vergelijking van de fusie activiteiten van vamps. Onder geoptimaliseerde omstandigheden transfectie, vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 worden uitgedrukt op hetzelfde niveau op het celoppervlak van v-cellen. 24 uur na het combineren van de v-cellen met T-cellen die exsyntaxin1/SNAP-25 druk wordt celfusie gekwantificeerd met behulp van de enzymatische assay celfusie. Foutbalken vertegenwoordigen spreiding van 4 onafhankelijke experimenten. ** P <0,01; *** P <0,001 vs VAMP1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De oorspronkelijke celfusie assay 6 bepaalt SNARE gemedieerde fusie events met fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een innovatieve assay die SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase en spectrometrische metingen. Met deze assay, we routinematig analyseren 15-20 v-en t-SNARE combinaties in een experiment. Met behulp van flowcytometrie om SNARE expressie te meten op het celoppervlak, we titreren de expressie niveaus van vamps en vergelijken hun membraanfusie capaciteiten (figuren 2 en 4). Bovendien met de enzymatische assay celfusie bepaalden wij de afhankelijkheid van celfusie activiteit op celoppervlak dichtheid van VAMP1 eiwit en geen waargenomen coöperativiteit van VAMP1 eiwit in de cel fusiereactie 8, wat suggereert dat onderlinge afstemming van meerdere SNARE complexen niet vereist aan de celmembranen fuseren.
Er zijn vermoedelijke N-glycosylering motifs (Asn-X-Ser/Thr) in SNARE eiwitten. Omdat N-glycosylering remt fusieactiviteiten van omgedraaid SNARE eiwitten 6 zijn twee benaderingen zijn gebruikt om de glycosylering van eiwitten te voorkomen SNARE omgedraaid. Eerst worden glycosylering-site mutaties ingebracht in omgedraaid SNARE constructen 6. Tweede, zoals beschreven in de huidige protocol is de N-glycosylering inhibitor tunicamycine (6,7 ug / ml) in de cel fusiereactie. Bovendien is 0,67 mM DTT toegevoegd in de celfusie reactie op de vorming van disulfidebindingen tussen omgedraaid SNARE eiwitten die zou verhinderen SNARE fusieactiviteiten voorkomen. Onze experimenten tonen dat de toevoeging van 6,7 ug / ml tunicamycine en 0,67 mM DTT in celkweekmedium niet interfereert met de proliferatie en overleving van COS-7 cellen. We routinematig beëindigen celfusie reactie op 24 uur na combinatie v-en T-cellen. Echter significant SNARE gemedieerde fusie gedetecteerd 6 uur na het combineren v-and t-cellen 8. Omdat de enzymatische celfusie reactie hangt af van de expressie van β-galactosidase na celfusie de loop van dit uitleessysteem loopt het tijdsverloop van membraanfusie gemedieerd door gedraaid SNARE eiwitten.
De enzymatische celfusie assay heeft een kwantitatieve assay reconstitutie voor de behandeling membraanfusie activiteiten van potentiële v-en t-SNARE interacties in zoogdiercellen. Door co-expressie regulerende eiwitten (bijvoorbeeld Munc18) en SNAREs op het celoppervlak of middels recombinant regulerende eiwitten in de cel fusiereactie kan deze assay worden gebruikt om de regulatiemechanismen van SNARE gemedieerde membraanfusie helderen. Bovendien moet deze test hebben toepassingen in high-throughput screening voor inhibitoren of activatoren van SNARE gemedieerde membraanfusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het opstarten fondsen van de Universiteit van Louisville en CA135123 van de National Institutes of Health (tot CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
