Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion
Summary
Vi har utvecklat en analys cellfusion som kvantifierar SNARE-medierade händelser membranfusion genom aktiverad expression av β-galaktosidas.
Abstract
Samspelet mellan SNARE (s oluble N-etylmaleimid-känslig faktor en ttachment protein re Ceptor) proteiner på vesiklar (v-Snares) och mål membran (t-Snares) katalyserar intracellulär vesikelfusion 1-4. Rekonstituering analyser är väsentliga för dissekera mekanismen och regleringen av SNARE-medierad membran fusion 5. I en cellfusion analys 6,7, är SNARE-proteiner uttrycks ektopiskt vid cellytan. Dessa "vänt" SNARE-proteiner drive cell-cellfusion, vilket demonstrerar att Snares är tillräckliga för att smälta cellmembran. Eftersom cellfusionen analys är baserad på mikroskopisk analys, är det mindre effektivt när det används för att analysera flera v-och t-SNARE interaktioner kvantitativt.
Här beskriver vi en ny analys 8 som kvantifierar SNARE-medierade händelser cellfusion genom aktiverad expression av β-galaktosidas. Tvåkomponenter Tet-Off genuttryck systemet 9 används som ett avläsningssystem: den tetracyklin-kontrollerad transaktivator (tTA) och en reporter-plasmid som kodar för LacZ-genen under kontroll av den tetracyklin-svarselementet (TRE-LacZ). Vi transfektera tTA in i COS-7-celler som uttrycker vänt v-SNARE proteiner vid cellytan (v-celler) och transfektera TRE-LacZ in i COS-7-celler som uttrycker vänt t-SNARE proteiner vid cellytan (t-celler) . SNARE-beroende fusion av V-och T-celler resulterar i bindning av tTA till TRE, den transkriptionella aktiveringen av LacZ och expression av β-galaktosidas. Aktiviteten av β-galaktosidas kvantifieras med användning av en kolorimetrisk metod genom absorbans vid 420 nm.
De vesikel-associerade membranproteiner (Vamps) är V-snaror som finns i olika post-Golgi vesikulära fack 10-15. Genom att uttrycka vamps 1, 3, 4, 5, 7 och 8 på samma nivå, jämför vi deras membranfusionaktiviteter med hjälp av enzymatisk analys cellfusion. Baserat på spektrometrisk mätning, erbjuder denna analys en kvantitativ metod för att analysera SNARE-medierad membran fusion och för hög kapacitet studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ursprungliga cellfusion analys 6 bestämmer SNARE-medierade händelser cellfusion genom fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi en innovativ analys som kvantifierar SNARE-medierade händelser cell fusion genom aktivt uttryck av β-galaktosidas och spektrometrisk mätning. Med användning av denna analys, analyserar vi rutinmässigt 15 till 20 V-och t-SNARE kombinationer i ett enda experiment. Med flödescytometri för att mäta SNARE uttryckning vid cellytan, titreras vi expressionsnivåerna av VAMPS och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av start medel från University of Louisville och CA135123 från National Institutes of Health (till CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
