Summary
Biz potansiyel greft reddi yüksek riski olmadan nakli sonrası immünsüpresyonun sonlandırmaya karar için kullanılabilecek değerli bir tanı testi açıklar. Tahlil Gecikmeli Tip Aşırı duyarlılık ilkelerini kullanır ve alıcılar tarafından monte hem donör özel efektör ve düzenleyici immün yanıtın doğru bir değerlendirme sağlar.
Abstract
Gecikmiş tip hipersensitivite cevabı (DTH) konak bağışıklık sistemi son geçmişte sahip olduğu, bir yabancı antijen (Ag), T hücre-bağımlı bağışıklık tepkisini in vivo tezahürü bir hızlıdır. DTH reaksiyonlar genellikle genellikle hassasiyete birkaç gün sonra aşağıdaki ilk antijen deneyim ve bir meydan okuma faz, atıfta, bir hassasiyete faz ayrılır. Deri testleri gösterdiği bir geri çağırma Ag için bir gecikmiş tip aşırı duyarlılık yanıt eksikliği genellikle anerji bir kanıtı olarak kabul edilir. Geleneksel DTH tahlilinde etkili birçok mikrobik enfeksiyonların teşhis kullanılmıştır.
Bu lenfosit infiltrasyonu, ödem ve doku nekrozu gibi benzer bağışıklık özellikleri paylaşan rağmen, doğrudan DTH çünkü donör antijenleri ve greft kaybına hassasiyete neden direkt enjeksiyon olasılığı nakli hastalarında uygun bir tanı yöntemidir değildir. Bu sorunu önlemek için, uğultubir-ile-fare "trans-vivo" DTH tahlilinde 1,2 geliştirilmiştir. Bu test, insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve özgül antijen memelerine harici deri altından enjekte edilmiş ya da saf bir fare ve DTH benzeri şişme ayak tabanına 18-24 saat sonra ölçülür 3 edildiği, esas olarak bir transfer DTH deneyidir. Makrofajlar ya da son derece vasküler dokuda fare T hücrelerine DC'ler gibi insan hücreleri tarafından antijen sunan antijen sunumu inflamatuar kademeli tetikler ve şişme yanıta sebep fare bağışıklık hücrelerinin çekmektedir. Tepkisi antijene özgü olan ve daha önceki antijen sensitizyonundan gerektirir. Tv-DTH tayininde pozitif donör-reaktif DTH yanıt nakli hasta organ antijenlerdir doğru bir pro-inflamatuar immün eğilim geliştirdiği yansıtır.
Bu testin en önemli özelliği, aynı zamanda bir seyirci baskılamaya neden düzenleyici T hücreleri tespit etmek için kullanılabilir olmasıdır. A seyirci bastırmaDonör antijen varlığında DTH hatırlama yanıt kabul allogreftler 2,4-14 ile nakli özelliğidir. Tv-DTH tarafından alloreaktivitesini ve düzenleme için nakli takibi reddine veya bozulan böbrek fonksiyonlarının yüksek riski olmadan immünsüpresyonun azalma yararlanabilecek hasta alt tanımlayabilir.
Ümit vaad eden bir alan otoimmünite 15,16 izlenmesi ve aynı zamanda tümör immünoloji 17 TV-DTH testinin uygulanmasıdır.
Protocol
1. Lenfositlerin hazırlanması
- ACD (Asit Sitrat Dekstroz) tüplere kan toplayın.
- Standart yöntemlere göre, lenfosit ayırma ortamı kullanılarak taze insan periferal kandan PBMC izole edin.
- Kirlenmesine trombosit çıkarmak için PBS ile PBMC üç kez yıkayın. Trombositler trans-vivo DTH tahlilinde müdahale bulunmuştur. PBMC hazırlık maksimum izin verilen trombosit kirlilik ≤ 1x10 7 / enjeksiyon.
- Farkedilir bir kırmızı kan hücresi kontaminasyon varsa, ilk yıkamadan sonra ACK lizis tamponu kullanarak kırmızı hücre parçalanma. PBS ile 2 kez yıkanarak ACK tamponu çıkarın.
2. Alloantigen hazırlanması
- Yukarıda gösterilen prosedür kullanılarak donör periferal kandan PBMC izole edin.
- 120x10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda (4x10 6 hücre / 30 ul) PBS içerisinde yeniden süspanse donör PBMC.
- Protein önlemek için karışıma 1 uM PMSF eklemebozulması.
- 2 mm-prob sonikatör ile yedi 1 saniyelik bakliyat kullanarak hücre süspansiyonu sonikasyon. (Not: Malzemenin soğuk tutun ve aşırı kabarcıkları önlemek köpük oluşursa, hücre süspansiyonu 2-3 dakika buz üzerinde bekletin..)
- Hemasitometre kullanarak hücrelerin>% 90 bozulma doğrulayın.
- Soğutulmuş mikrofüj içinde 20 dakika boyunca 4 ° C'de 14,000 rpm'de karışım santrifüjleyin.
- Yeni bir 2.0 ml güvenli kilit tüp süpernatant aktarın ve protein konsantrasyonu belirler.
3. Enjeksiyonlar için Hücre Hazırlık
- 2.0 ml güvenli kilit tüpleri içine her enjeksiyon kısım 7x10 6 PBMC için.
- Mikrofuge'ye bir dakika 6.000 rpm'de santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
- PBS içinde veya antijen olmaksızın süspansiyon hücreleri. PBS ile 35 ul enjeksiyon ses seviyesini ayarlayın. Aşağıdaki şema enjeksiyon için kullanılır:
Negatif Kontrol: PBMC + PBS
Pozitif Kontrol: PBMC + TT / DT (25 & mu, G / enjeksiyon)
Deneysel Antijen Özgül Tepki: PBMC + testi Ag (4-8 mg / enjeksiyon)
Deneysel Antijen Özgül Düzenleme: PBMC + testi Ag + TT / DT
4. Ön ölçüm, Enjeksiyon ve sonrası ölçüm
- Izofluran ile CB17 SCID fare anestezisi. Yaylı bir kumpas kullanarak arka haydut kalınlığını ölçün. Ölçüm sitesi tutarlı tutmak için bir kriter sağlamak için, bir kenar ayak son yürüyüş alanına basıldığında ile, ayak tabanına merkezinde yer kumpas koyun. Göstergesi okuma stabilize olduğunda Kapkaççı kalınlığı kaydedilir.
- Yavaş yavaş 28-gauge iğne ile yarım cc insülin şırıngası kullanılarak farelerin deri altından ayak yastıklarından hücre süspansiyonları enjekte edilir. Iğne ayak doğru bakacak ve konik yukarı bakacak şekilde enjeksiyon yapın. (Not: herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun).
- Enjeksiyondan sonra 18-24 saat, haydut şişlik izofluran ve tekrar ölçüm ile fare uyutmak.
- Subtrayak tabanına şişme değeri elde etmek için enjeksiyondan değerinden daha sonra enjeksiyondan önce her bir ayak desteği kalınlığı hareket, 10 -4 inch verileri ifade eder. Tedaviler (hücre + donör alloantigen, TT / DT, ya da donör alloantigen + TT / DT) elde edilen ayak yastığı şişme değerlerinden kontrolü haydut şişme (hücre + PBS) çıkarılarak antijen spesifik net şişme hesaplayın. PBS arka plan yanıt üzerinde ≥ 25x10 -4 inç antijen TT / DT çağırmak için bir pozitif kontrol yanıtı geçerli dikkate alınması gereken test için gereklidir.
- Aşağıdaki formül kullanılarak her enjeksiyon arasında net şişme karşılaştırarak donör antijen varlığında hatırlama yanıtını inhibisyonunu belirlemek:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Tv-DTH testi kullanılarak donör antijen-spesifik yanıt için böbrek nakli Değerlendirilmesi
Böbrek nakli donör-reaktif hücresel bağışıklık test etmek için donör antijenleri tek başına ya da bir geri çağırma antijen tetanoz toksoid (TT) ile bu hastaların PBMC enjekte. Bir pozitif kontrol hücreleri TT tek başına enjekte edilmişlerdir. Biz nakli gecikmiş tip aşırı duyarlılık üç ana desenleri (Şekil 1) gözlemlemek. Tüm hastalar Ag (TT) Akla güçlü yanıt verdi. Hasta # 62 donör antijen ve donör antijen mevcudiyetinde antijen yanıtı geri çağırmak için belirgin bir bağlı bastırma (% 67), zayıf bir yanıt ile karakterize olan düzenleyici deseni gösterir. Bu organ, allogreft toleransı ile ilişkili olduğu bulunmuştur modelidir. Hasta # 48 sergiler donör için, zayıf bir yanıt fakat mevcut herhangi bir bağlantılı bastırma (veya bağlı bastırma <% 50) sahip bir nonregulatory şablonudur. Budesen sıklıkla immünsüpresif ilaç alan hastalarda gözlenmiştir. Ancak, yine de transplantasyon sonrası immünsüpresif ilaç alan bazı hastalar DTH yanıt donör antijen bağlantılı bastırma görüntüleyebilir. Hasta 8. sergiler verici antijene yüksek bir tepki ve hiçbir bağlı bastırma ile karakterize donör-duyarlı desen,. Bu yanıt, klinik vaka çalışmaları nakilin reddedilmesi 8 ile ilişkilidir.
2. Böbrek nakli klinik izleme donör özel düzenleme Rolü
PBMC ITN507ST gözlemsel çalışma kayıtlı bireylerden, ("Kimlik ve Toleranslı Böbrek nakli Hastaların mekanizma çalışmalarına") Tv-DTH tahlil ve donör (veya donör kullanarak donör özgü dolaylı yolu T efektör ve T düzenleyici yanıtları için test edildi HLA- uyumlu vekil) antijen. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, verici antijenlere karşı dolaylı yolu efektör T tepkileri ortaya çıkarırkayıt gruplar arasında ayrı bir spektrum; kronik reddetme olanlar için hoşgörülü olanlar gelen hastaların klinik durumu aralıkları olarak haydut şişme artar. Hoşgörülü alıcılardan PBMC'ler azaltılabilir veya reddetme bireylerden PBMC'ler ise hiçbir DTH yanıtları güçlü şişme tepkilere yol açtı uyarılmıştır.
Bağışıklık düzenleme böbrek allogreft kabulü için önemli bir mekanizma olduğunu. Şekil 2B gösterir ara ile en aralığında üzerinde düzenleyici yanıtlarda azalma (Tol) göstermiştir bağlantılı bastırma yöntemi ile anti-donör dolaylı yolu T düzenleyici yanıt ölçümü (Mono ve SI) en hoşgörülü (CR) hasta 14.
3. Tv-DTH testi kullanılarak otoimmünite izlenmesi
Bir umut verici alanı otoimmünite izleme Tv-DTH testinin uygulanmasıdır. BOS, bir süreç içinde küçük hava yollarının tıkanması fibro-obliteratifakciğer nakli, akciğer nakli yetmezliğinin en sık nedenidir.
Bu süreçte kollajen tip V hücre-aracılı bağışıklık rolü test ederek, biz bronşiolit obliterans sendromu (BOS) gelişimi en yüksek rölatif risk kendi kollajen tip V için olumlu Tv-DTH yanıt gelişen hastalarda gözlendi bulundu periferik kan.
Şekil 3 akciğer nakli alıcılardan PBMC'ler, ama sağlıklı veya kollajen IV-reaktif Goodpasture sendromu olgunun böbrek nakli sonra, sık sık kollajen V reaktif 15 olduğunu gösterdi.
4. Tümör immünoloji Uygulama
Trans-vivo DTH aşı tedavisi için prostat kanserli hastalarda öncelik kanser araştırmalarında yeni olanaklar açıyor. Düzenleyici T hücreleri kanser gelişimi ve ilerlemesinde önemli rol oynar bu yana, PBMC reaktivite test etmek Tv-DTH kullanılanBir DNA aşısı kodlayan prostatik asit fosfataz (PAP) ile tedavi edilen kanser hastalarında, S. Biz antijen spesifik düzenleme faaliyetleri aşı tepki olarak ortaya çıkardı olup olmadığını belirlemek için antijen çağırmak için yanıt seyirci bastırma kullanılır. Biz PAP özgü düzenleyici T hücreleri bazı prostat kanser hastalarında kendiliğinden ortaya çıkan, aşılama sırasında devam ve PAP-özel efektör tepkiler sonrası bağışıklama tespiti önlemek bulundu. Bazı hastalarda; bağışıklık kılmadan önce PAP özgü düzenlenmiş T-hücresi tepkileri belirlenmiştir. PAP spesifik önceden var olan düzenleyici T hücreleri aşılamayı takiben antigen-spesifik Th1-tipi bağışıklık tepkileri geliştirmek için yetersizliği ile ilişkili olabilir. Alternatif olarak PAP için önceden var olan düzenleyici T-hücre yanıtlarını birden fazla aşılamanın ardından efektör tepkiler geliştirme olasılığı hasta belirleyecektir. Bu indiv öncelik ya da dışlamak için bir araç önerebiliriz olarak iki durumda da, bu testte, önemli bir gözlem sağlarantijen-özgü aşı değerlendirme 17 idual hastalar.
Şekil 1. Gecikmiş tip aşırı duyarlılık üç ana desenleri (DTH) örnekleri böbrek nakli bulundu. Hasta PBMC'leri hatırlama antijeni (TT), donör antijenleri ya veya donör + hatırlama antijen hem CB17 SCID farelerin ayak pedleri enjekte edildi. Göster arka plan üzerinde net şişme yanıttır.
Şekil 2. . Dolaylı yolu T-hücre analizi Konuları beş gruba kayıtlı: (Tol) klinik olarak hoşgörülü ikiz, steroid monoterapi(Mono), standart immün (SI) ve kronik rejeksiyon (CR) (B) Tv-DTH yöntemi ile T efektör yanıtları (A) ve T düzenleyici yanıtları araştırılmıştır. Tüm paneller: Her (bireysel semboller) konu ve grup kartiller ile (yatay çizgi) ortanca Bireysel sonuçları gösterilir. Grup arasında anlamlı fark gösterilir; * p <0.05, ** p <0.01 ve *** p <0.001; # p = 0.04, # # p = 0.03, # # # p = 0.008.
Şekil 3,. Tv-DTH yöntemi ile Kollajen Tip V özel-otoimmünite ölçümü. Tv-DTH yanıtları normal sağlıklı kontrol, GPS veya akciğer nakli ile böbrek nakli elde PBMC'ler tarafından. Tüm 3 grup, antijen hatırlamak Col (olumlu tepkiler (≥ 25x10 -4 inç net şişme) vardı benI), eklem kıkırdağı özgü bir fibriller kollajen, hasta ya da kontrol Tv-DTH tepki ortaya çıkarmak değildi. GPS ile böbrek nakli Col (IV) verilen yanıtlar şişme anlamına yüksekti. Akciğer nakli Col (IV) yanıt vermedi, ama Col (V) cevap vermedi.
Şekil 4. Tümör kaynaklı immünoregülasyon değerlendirmek için TV-DTH tahlilinde kullanımı. Prostat kanserli hastaların PBMC, prostat spesifik antijen (PSA) ve prostatik asit fosfatazı (PAP) ile tek başına ya da geri antijen TT / DT ve bir kontrol olarak enjekte edilmiş olan veya olmayan enjekte edildi antijen TT / DT hatırlıyorum. PAP enjeksiyon + PSA birlikte uygulanması TT / DT hatırlama antijene bir DTH yanıt bastırmak mümkün değildi TT / DT, PAP antijen-spesifik düzenleyici hücreleri tespit.
Şekil 5,. TV-DTH tahlilinde üretilebilirliği. Dondurulmuş hücreler 2007/01/15 üzerinde lökaferezis ile elde edilir, çözülmüş PBS ile yıkandı, PBS veya EBV ya da P37-TE + EBV (serbest peptit) veya P37-MA + EBV (donör peptit) ile karıştırıldı ve ayak yastıklarından içine enjekte edildi. 2008/07/29, 2010/02/23, 2011/09/01, 10.11.2011, 12/15/2011: Hücreler aşağıdaki zaman noktalarında, test edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trans-vivo DTH testi nakli, kanser ve otoimmün hastalarda hücre-aracılı yanıtları değerlendirirken potansiyel bir klinik uygulama ile yeni bir tanı testidir. Bu geri çağırma T efektör yanıtları izlemek yararlı değil, çünkü değerlidir, aynı zamanda T düzenleyici yanıtları algılayabilir. Insan DTH düzenleme algılamak için güvenilir bir yolu tek başına veya tolerans çalışmalar için aday olan hastalarda immün çekilme güvenliği tahmin olabilir.
TV-DTH MHC allorecognition arasında dolaylı yolu tespit etmek için çok hassastır. Ancak TV DTH sağlam donör MHC moleküllerine karşı doğrudan alloresponse tespit etmek için değiştirilebilir. DTH donör antijen bağlantılı bastırma algılamak için, tek donör HLA sınıf I ve sınıf II ifade EBV-LCL hücreler hasta PBMC ile coinjected edilebilir. EBV-LCL DTH deneyde antijen kaynağı olarak kullanıldığı zaman, hücreler 10,000 rad gama ışınlandı ve 200,000 hücre ortak edildiSCID farelerinin ayak yastığı içine enjekte edilmiş PBMC.
Tv-DTH geliştirme sırasında biz çeşitli koşullar bu testte etkileyebilir bulmak. Bunlardan en önemlisi seyirci bastırma tespiti için gerekliliktir. Bu zorluk Alanı ve fare adoptif konağın bağışıklık yeterliliğini de, ko-lokalize verici bir antijene yanıt olarak bir geri çağırma DTH inhibisyonunun saptanması için, TV-DTH testinin hassasiyeti sınırlayıcı kritik faktörler olduğunu kanıtlar sağlamıştır. PBMC ayak pedleri, ve kulak içine enjekte ve sadece bağışıklık sistemi zayıf, bağışıklık sistemi değil fareler 3 zaman hoşgörülü nakli gelen PBMC sadece seyirci bastırma aracılık.
Tüm testleri gibi Tv-DTH testi gücü ve zayıf yönleri vardır. Tv-DTH testinin büyük avantajları şunlardır: 1) çok hassas ve güvenilir bir insan düzenleyici T hücreleri, 2) algılayabilir onların fonksiyonu ile düzenleyici T hücreleri tespit vermeyerek tvarisi fenotip, 3) bu Th-1 ve Th-17 efektör yanıtları 4) ham hücre lizatları donör antijen 5) bu testte yüksek tekrarlanabilirlik / stabilite (Şekil 5) sunuyor için hasta hassasiyet olmadan düzenleme tespit etmek için kullanılabilir hem de algılar. Dezavantajları şunlardır: 1), enjeksiyon başına PBMC, nispeten büyük sayıda gerektirir, 2) teknik, özellikle seyirci bastırma tayininde, geniş eğitim gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazının Yazarlar ifşa etmek hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar nakli düzenlenmiş DTH yanıt anlayışımızın gelişmesine AM VanBuskirk katkıları kabul etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe PO1AI084853 ve R01AI066219-06 destekli ve AB destekli bir çalışma ile oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
