Summary
Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.
Abstract
Resposta de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é um rápido em manifestação in vivo da resposta imunitária dependente da célula T a um antigénio exógeno (Ag), de que o sistema imunitário do hospedeiro tem tido no passado recente. Reacções DTH são frequentemente dividido numa fase de sensibilização, referindo-se a experiência inicial de antigénio, e uma fase de desafio, o que geralmente resulta de vários dias após a sensibilização. A falta de uma resposta de hipersensibilidade tardia a um Ag recuperação demonstrada pelo teste de pele é frequentemente considerado como uma evidência de anergia. O ensaio de DTH tradicional tem sido usado eficazmente no diagnóstico de várias infecções microbianas.
Apesar partilhando características imunológicas similares, tais como a infiltração de linfócitos, edema e necrose do tecido, o DTH directa não é uma técnica viável de diagnóstico em doentes transplantados, devido à possibilidade de injecção directa, resultando na sensibilização para antigénios do dador e perda do enxerto. Para evitar este problema, o zumbidoum-para-rato de "trans-vivo" ensaio de DTH foi desenvolvido 1,2. Este teste é, essencialmente, um ensaio de transferência de DTH, em que as células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e antigénios específicos foram injectados por via subcutânea na pata traseira ou pinas de um rato ingénuos e DTH-como inchaço é medido após 18-24 h 3. A apresentação de antigénio por células apresentadoras de antigénios humanos, tais como macrófagos ou células dendríticas para as células T no tecido altamente vascularizado rato desencadeia a cascata inflamatória e atrai as células imunes do rato, resultando em respostas do inchaço. A resposta é específica para o antigénio e requer sensibilização antigénio antes. Uma resposta DTH dador reactivo positivo no ensaio de DTH Tv reflecte que o paciente de transplante desenvolveu uma disposição imunológica pró-inflamatória para aloantigénios de garfo.
A característica mais importante deste ensaio é que ele pode também ser usado para detectar células T reguladoras, que causam a supressão de espectador. Supressão de um espectadorSensibilidade resposta DTH na presença do antigénio do doador é característico dos receptores de transplante com aloenxertos aceites 2,4-14. O monitoramento de pacientes transplantados para alloreactivity e regulação por Tv-DTH pode identificar um subgrupo de pacientes que poderiam se beneficiar de redução da imunossupressão sem risco elevado de rejeição ou de deterioração da função renal.
Uma área promissora é a aplicação do ensaio de DTH em Tv-vigilância da autoimunidade 15,16 e também na área da imunologia tumoral 17.
Protocol
1. Preparação de Linfócitos
- Coletar sangue para ACD (ácido citrato dextrose) tubos.
- Isolar CMSP a partir de sangue periférico humano fresco, utilizando Meio de Separação de Linfócitos de acordo com métodos padrão.
- Lavar as PBMC três vezes com PBS para remover as plaquetas contaminantes. As plaquetas foram encontrados para interferir com o ensaio de trans-DTH in vivo. Máximo permitido de contaminação de plaquetas preparação PBMC é ≤ 1x10 7 / injeção.
- Se houver uma contaminação de glóbulos vermelhos perceptível, realizar a lise de glóbulos vermelhos usando tampão de lise ACK após a primeira lavagem. Remover tampão ACK por lavagem duas vezes com PBS.
2. Preparação de aloantigénio
- Isolar CMSP a partir do sangue periférico de doadores utilizando o procedimento indicado acima.
- Ressuspender o doador de PBMC em PBS a uma concentração de 120x10 6 células / ml (4x10 6 células / 30 ul).
- Adicionar 1 uM de PMSF, à mistura de proteína para evitardegradação.
- Sonicar a suspensão de células utilizando sete impulsos de 1 segundo, com uma sonda de ultra-sons 2 mm. (Nota: Mantenha o material frio e evitar bolhas excessivas Se ocorrer a formação de espuma, deixe a suspensão de células sentar-se no gelo por um 2-3 min.).
- Verifique o rompimento de> 90% das células utilizando um hemocitómetro.
- Centrifugar a mistura a 14000 rpm a 4 ° C durante 20 minutos em microcentrifuga refrigerado.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo ml seguro-lock 2.0 e determinar a concentração de proteína.
3. Preparação de células para Injectáveis
- Para cada alíquota injeção 7x10 6 PBMC em ml tubos seguro-lock 2.0.
- Centrifugar a 6000 rpm, durante um minuto, em microcentrifuga e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células em PBS com ou sem antigénios. Ajustar o volume de injecção de 35 ul com PBS. O esquema a seguir é usado para injeções:
Controle Negativo: PBMC + PBS
Controlo positivo: PBMC + TT / DT (25 e mu, G / injecção)
Experimental Antigénio Específico da resposta: teste de CMSP + Ag (4-8 ug / injecção)
Antígeno Experimental Regulamento Específico: PBMC + teste Ag + TT / DT
4. Pré-medição, Injection, e Pós-medição
- Anestesiar CB17 rato SCID com isoflurano. Medir a espessura da pata traseira usando uma mola paquímetro. Coloque o cursor no centro da almofada da pata, com uma borda de tocar no último andar da almofada do pé, para proporcionar um ponto de referência para manter o local de medida consistente. Espessura da pata é registrado quando a leitura calibre estabilizou.
- Lentamente injetar suspensões de células por via subcutânea em coxim plantar de camundongos usando ½ cc seringas de insulina com agulha de calibre 28. Realize injeção com a agulha apontando para os dedos dos pés, e o bisel voltado para cima. (Nota: verifique se não há nenhum vazamento).
- 18-24 horas após a injeção, anestesiar rato com medição isoflurano e repetição da pata inchaço.
- Subtractuar a espessura de cada almofada da pata antes da injecção, a partir do valor pós-injecção para se obter o valor de inchaço da almofada da pata, expressa os dados em unidades de 10 polegadas -4. Calcular o antigénio específico do líquido inchaço subtraindo o inchaço da almofada da pata de controlo (CMSP + PBS) a partir dos valores de inchamento coxins plantares obtidos a partir dos tratamentos de (PBMC + dador aloantigénio, TT / DT ou dador aloantigénio + TT / DT). A resposta de controle positivo para recordar antígeno TT / DT de ≥ 25x10 -4 polegadas sobre a resposta de fundo à PBS é necessário para que o teste seja considerado válido.
- Determinar a inibição de respostas de recolha, na presença de antigénios do dador através da comparação do inchaço líquido de cada injecção com a seguinte fórmula:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Avaliação dos receptores de transplante renal para a resposta antígeno-específica de doadores usando ensaio Tv-DTH
Para testar o doador reactivo imunidade celular em pacientes transplantados renais foram injetados PBMC de pacientes com estes antigénios do dador, isoladamente ou com um antigénio de toxóide do tétano (TT). Como um controlo positivo de células foram injectadas com o TT por si só. Observamos três padrões principais de tipo de hipersensibilidade retardada em receptores de transplante (Figura 1). Todos os pacientes responderam fortemente a Recall Ag (TT). Paciente # 62 mostra o padrão de regulação, caracterizada por uma fraca resposta ao antigénio do doador e uma supressão acentuada ligada (67%) para chamar a resposta do antigénio na presença de antigénios do doador. Este é o padrão que foi encontrado para ser associado com a tolerância do enxerto do órgão. Paciente # 48 exibe um padrão nonregulatory, que tem a característica de uma resposta fraca ao doador, mas sem supressão ligada (ligada ou supressão <50%). Estepadrão tem sido freqüentemente observada em pacientes que tomam medicamentos imunossupressores. No entanto, alguns pacientes ainda recebem pós droga imunossupressora transplante pode exibir doador supressão antígeno-linked de sua resposta DTH. Paciente # 8 exposições o padrão doadores sensibilizados, caracterizada por uma alta resposta ao antígeno do doador e sem supressão ligada. Esta resposta está associada à rejeição do enxerto em estudos de casos clínicos 8.
2. Papel da regulamentação específica do doador em acompanhamento clínico em transplante renal
PBMC de indivíduos inscritos no ITN507ST julgamento observacional, ("Identificação e Investigações mecanicistas de tolerantes Transplante renal pacientes") foram testados para o doador específico via indireta T efetoras respostas regulatórias e T utilizando o ensaio e doador Tv-DTH (ou doador HLA- substituto correspondente) antigénio. Como mostrado na Figura 2A, as respostas das vias T efectoras indirectos para antigénios do dador revelaum espectro distinto através dos grupos de matrícula; aumenta inchaço coxins plantares como faixas estado clínico dos pacientes daqueles que são tolerantes com aqueles que estão cronicamente rejeitando. PBMCs de destinatários tolerantes induzida reduzida ou nenhuma resposta DTH enquanto PBMCs de rejeitar indivíduos provocou fortes reações inchaço.
A medição da anti-doador caminho T resposta regulatória indireta pelo ensaio supressão linked demonstrado que a regulação imune foi um mecanismo importante para a aceitação do enxerto renal. Figura 2B mostra uma diminuição nas respostas regulatórias sobre a faixa de mais (Tol) através intermediário (Mono e SI) para menos tolerantes pacientes 14 (CR).
3. Monitoramento da autoimunidade usando ensaio Tv-DTH
Uma área promissora é a aplicação do ensaio de DTH em Tv-vigilância da auto-imunidade. BOS, um processo de fibro-obliterante oclusão das vias aéreas pequenas notransplantadas pulmão, é a causa mais comum de falha de transplante de pulmão.
Ao testar o papel da imunidade mediada por células de colagénio do tipo V no presente processo, verificou-se que o mais elevado risco relativo de bronquiolite obliterante síndrome (BOS) desenvolvimento foi observado em pacientes que desenvolveram uma resposta DTH positiva Tv de colagénio do tipo V no seu sangue periférico.
Figura 3 mostrou que PBMCs de pacientes transplantados de pulmão, mas não de controles saudáveis ou em pacientes com síndrome de colágeno IV-reativa Goodpasture após o transplante renal, foram freqüentemente colágeno V reativa 15.
4. Aplicação em imunologia tumor
Trans-vivo DTH está abrindo novas possibilidades na pesquisa do câncer para priorizar pacientes de câncer de próstata para a terapia de vacinação. Uma vez que as células T reguladoras desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão do câncer, usamos Tv-DTH para testar a reatividade do PBMCs a partir de pacientes com cancro tratados com uma vacina que codifica a fosfatase ácida prostática de ADN (PAP). Utilizou-se a supressão da resposta espectador recordar antigénio para determinar se o antigénio actividades reguladoras específicas estão a ser induzida em resposta à vacinação. Descobrimos que as células regulamentares específicas do PAP T surgem espontaneamente em alguns pacientes com câncer de próstata, persistem durante a imunização e evitar a detecção de PAP específicos de respostas efetoras pós-imunização. Em alguns pacientes, identificamos as respostas das células T específicas do PAP-regulados antes da imunização. As células T reguladoras específicas pré-existentes para o PAP pode ser relacionado com a incapacidade de desenvolver respostas imunitárias específicas para o antigénio de tipo Th1 após a vacinação. Alternativamente respostas das células T reguladoras pré-existentes para PAP vai identificar pacientes que possam desenvolver respostas efetoras após imunização múltipla. De qualquer forma, este ensaio fornece uma observação importante, pois pode sugerir um meio de priorizar ou excluir individual pacientes de antigénio específico de avaliação da vacina 17.
Figura 1. Exemplos dos três padrões principais de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) encontrados em receptores de transplante renal. PBMCs dos pacientes foram injetadas nos coxins plantares de CB17 SCID com qualquer antígeno recordação (TT), os antígenos do doador, ou com dador + antígeno recall. Show é a resposta inchaço net sobre o fundo.
Figura 2. . Análise de células T via indireta assuntos inscritos em cinco grupos: gêmeo idêntico, clinicamente tolerante (Tol), a monoterapia com esteróides(Mono), imunossupressão padrão (SI) e rejeição crônica (RC) foram investigadas para respostas efetoras T (A) e T respostas regulatórias (B) por ensaio Tv-DTH. Todos os painéis: os resultados individuais de cada sujeito (símbolos individuais) eo grupo mediana (linha horizontal) com os quartis são mostrados. Diferenças significativas entre os grupos são mostrados; * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001; # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0,008.
Figura 3. Medição de colágeno tipo V específica autoimunidade por ensaio Tv-DTH. TV DTH respostas por PBMC obtidas de controles saudáveis, transplantados renais com GPS ou receptores de transplante pulmonar. Todos os três grupos tiveram respostas positivas (≥ 25x10 -4 polegadas inchaço da rede) para lembrar antígeno, Col (II), um colagénio fibrilar específica para a cartilagem articular, não induziu uma resposta de DTH Tv em pacientes ou controlos. Transplantados renais com GPS havia elevado significa inchaço respostas para Col (IV). Transplantados de pulmão não respondeu ao Col (IV), mas não respondeu ao Col (V).
Figura 4. Utilização de ensaio Tv-DTH para avaliar a imuno-induzida do tumor. CMSP de pacientes com cancro da próstata foram injectados com fosfatase ácida prostática (PAP) sozinho ou com recordação antigénio de TT / DT e como controlo antigénio específico da próstata (PSA) foi injectado com ou sem recordar antígeno TT / DT. A injeção de PAP + TT / DT identificaram células regulamentares específicas do antígeno PAP, como co-administração de PSA não foi capaz de suprimir a resposta DTH ao antígeno recordação TT / DT.
Figura 5. Reprodutibilidade de ensaio Tv-DTH. Células criopreservadas por obter leukapheresis on 2007/01/15 foram descongeladas, lavadas com PBS, misturado com PBS ou EBV ou p37-TE + EBV (auto-peptide) ou p37-MA + EBV (peptídeo doador) e injetado em coxins. As células foram testadas em momentos: 2008/07/29, 2010/02/23, 2011/09/01, 2011/10/11, 2011/12/15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio de DTH trans in vivo é um teste de diagnóstico de novo com uma aplicação potencial clínico para avaliar as respostas mediadas por células em transplantes, cancro e pacientes auto-imunes. É importante porque não só é útil no monitoramento de recall T efetoras respostas, mas também pode detectar respostas T reguladoras. A maneira confiável para detectar regulação DTH humano pode prever a segurança da retirada da imunossupressão em pacientes que são candidatos à monoterapia ou tolerância ensaios.
A Tv-DTH é muito sensível para detectar a via indireta de aloreconhecimento de MHC. No entanto TV DTH pode ser modificado para detectar alloresponse directa contra moléculas de MHC do doador intactas. Para detectar doadores supressão antígeno-linked de DTH, as células EBV-LCL expressando único doador HLA classe I ou II pode ser coinjected com PBMC paciente. Quando EBV-LCL foram usadas como uma fonte de antigénio no ensaio de DTH, as células foram irradiadas com gama-10000 rad, e 200 mil células foram coinjectados com CMSP na almofada da pata de ratinhos SCID.
Durante o curso do desenvolvimento da Tv-DTH descobrimos que várias condições podem afectar este ensaio. O mais importante é o requisito para a detecção da supressão circunstante. Nós forneceram provas de que a fim de detectar a inibição de uma resposta de DTH em Sensibilidade ao antigénio do doador co-localizado, tanto no local da provocação e a imunocompetência do rato hospedeiro adoptivo são factores críticos que limitam a sensibilidade do teste de TV do DTH. PBMC de pacientes transplantados tolerantes mediada supressão espectador apenas quando PBMC foram injetados em coxim plantar, e não ouvidos, e apenas em ratos imunodeficientes, não imunocompetentes 3.
Como todos os ensaios o teste Tv-DTH tem pontos fortes e fracos. As enormes vantagens do ensaio de Tv-DTH incluem o seguinte: 1) é muito sensível e pode detectar com segurança células humanas T reguladoras, 2) que detecta as células T reguladoras por sua função e não por tfenótipo heir, 3) que detecta tanto Th-1 e Th-17 respostas efectoras 4) Os lisados celulares em bruto pode ser utilizado para detectar regulação sem sensibilizar os pacientes para o antigénio do doador 5) neste ensaio apresenta elevada reprodutibilidade / estabilidade (Figura 5). As desvantagens são: 1) que requer um número relativamente grande de PBMC por injecção, 2) a técnica requer formação extensa, particularmente no ensaio de supressão de espectador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores deste manuscrito não têm conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer as contribuições da AM VanBuskirk para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta DTH regulado em receptores de transplante. Este trabalho foi apoiado bolsas NIH PO1AI084853 e R01AI066219-06 e da UE-patrocinado um estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
