Summary
We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.
Abstract
Vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) is een snelle in vivo manifestatie van T-cel-afhankelijke immuunrespons tegen een vreemd antigen (Ag) dat de gastheer immuunsysteem ervaren in het recente verleden. DTH reacties worden vaak verdeeld in een sensibiliseringsfase, verwijzend naar de oorspronkelijke antigen ervaring en een uitdaging fase, die volgt meestal enkele dagen na sensibilisering. Het ontbreken van een vertraagde overgevoeligheid reactie op een recall Ag aangetoond door huidtest wordt vaak beschouwd als een bewijs van anergie. De traditionele DTH assay daadwerkelijk gebruikt bij de diagnose van vele microbiële infecties.
Ondanks die soortgelijke immuun functies zoals lymfocytinfiltratie, oedeem, en weefsel necrose, de directe DTH is geen haalbare diagnostische techniek bij transplantatiepatiënten vanwege de mogelijkheid van directe injectie resulteert in sensibilisatie voor donorantigenen en verlies van het transplantaat. Om dit probleem te voorkomen, de bromeen naar mouse "trans-vivo" DTH assay ontwikkeld 1,2. Deze test is in essentie een transfer DTH assay, waarbij humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en specifieke antigenen werden subcutaan geïnjecteerd in de oorschelpen of voetzool van een naïeve muis en DTH-achtige zwelling wordt gemeten na 18-24 uur 3. Het antigeen presentatie door menselijke antigeen presenterende cellen zoals macrofagen en DCs tot T-cellen in zeer vasculaire muis weefsel activeert de inflammatoire cascade en trekt muis immune cellen resulteert in zwelling reacties. De respons is antigeen-specifiek en vereist vooraf antigeen overgevoeligheid. Een positieve donor-reactieve DTH respons in de Tv-DTH-test weerspiegelt dat de transplantatie patiënt een pro-inflammatoire immuun dispositie richting graft alloantigenen heeft ontwikkeld.
Het belangrijkste kenmerk van deze assay is dat het ook kan worden gebruikt om regulatoire T cellen, die bystander suppressie veroorzaakt detecteren. Omstander onderdrukking van eenDTH respons recall in aanwezigheid van donor antigeen kenmerkend transplantatieontvangers met aanvaarde allografts 2,4-14. De bewaking van transplantatie ontvangers voor alloreactiviteit en regulering door Tv-DTH kan een subset van patiënten die baat kunnen hebben bij vermindering van immunosuppressie zonder verhoogd risico op afstoting of verslechterende nierfunctie te identificeren.
Een veelbelovend gebied is de toepassing van de Tv-DTH assay bewaking van autoimmuniteit 15,16 en ook tumorimmunologie 17.
Protocol
1. Bereiding van lymfocyten
- Verzamel bloed in ACD (zuurcitraatdextrose) buizen.
- Isoleer PBMC van verse humane perifeer bloed lymfocyten met Separation Medium volgens standaardwerkwijzen.
- Was de PBMC drie keer met PBS om verontreinigende bloedplaatjes te verwijderen. Bloedplaatjes bleken te interfereren met de trans-vivo DTH assay. Maximaal toelaatbare bloedplaatjes vervuiling van PBMC voorbereiding is ≤ 1x10 7 / injectie.
- Als er een merkbare rode bloedcel vervuiling, voeren lysis van rode bloedcellen met ACK lysis buffer na de eerste wasbeurt. Verwijder ACK buffer door wassen 2x met PBS.
2. Bereiding van allogeen
- Isoleer PBMC van de donor perifeer bloed met behulp van de bovenstaande procedure.
- Resuspendeer donor PBMC in PBS bij een concentratie van 120x10 6 cellen / ml (4x10 6 cellen / ul 30).
- Voeg 1 uM PMSF het mengsel eiwit voorkomendegradatie.
- Sonificeer de celsuspensie met behulp van zeven 1-seconde pulsen met een 2 mm-sonde sonicator. (Let op: Houd het materiaal koud en het vermijden van buitensporige bubbels Indien schuimvorming optreedt, laat de celsuspensie zitten op het ijs voor een 2-3 min...)
- Controleer de verstoring van> 90% van de cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer het mengsel bij 14.000 rpm bij 4 ° C gedurende 20 minuten in gekoelde microcentrifuge.
- Overdragen supernatant naar een nieuwe 2,0 ml safe-lock buis en bepalen eiwitconcentratie.
3. Cel Voorbereiding voor injecties
- Voor elke injectie hoeveelheid 7x10 6 PBMC in 2,0 ml safe-lock buizen.
- Centrifugeer bij 6000 rpm gedurende een minuut in microfuge en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in PBS met of zonder antigenen. Stel het injectievolume 35 pl met PBS. De volgende schema wordt gebruikt voor injecties:
Negatieve controle: PBMC + PBS
Positieve controle: PBMC + TT / DT (25 & mu; G / injectie)
Experimentele Antigen Specifieke Reactie: PBMC +-test Ag (4-8 ug / injectie)
Experimentele Antigen Specifieke verordening: PBMC + testen Ag + TT / DT
4. Voormeting, Injection, en Post-meting
- Verdoven CB17 SCID muis met isofluraan. Meet achterste voetzool dikte met behulp van een verende remklauw. Zet remklauw in het midden van de voetzool, met een rand aan te raken de laatste wandel bal van de voet, van een benchmark de meetplaats consequent te blijven bieden. Voetzool dikte wordt geregistreerd wanneer meteraflezing is gestabiliseerd.
- Injecteer langzaam celsuspensies subcutaan in de voetzolen van de muizen met behulp ½ cc insuline-injectiespuiten met 28-gauge naald. Voer injectie met de naald in de richting van de tenen, en de schuine kant naar boven. (Let op: zorg ervoor dat er geen lekkage).
- 18-24 uur na de injectie, verdoven muis met isofluraan en herhaal de meting van de voetzool zwelling.
- Subtrtreden de dikte van elke voetzool voorafgaand aan de injectie uit de post injectie waarde aan de voetzool zwelling waarde te verkrijgen, drukt de gegevens in eenheden van 10 -4 centimeter. Bereken de antigeen-specifieke net zwelling door het aftrekken controle voetzool zwelling (PBMC + PBS) van de voetzool zwelling waarden verkregen van de behandelingen (PBMC + donor alloantigen, TT / DT, of donor alloantigen + TT / DT). Een positieve controle reactie op antigeen TT / DT van ≥ 25x10 -4 centimeter over achtergrond reactie op PBS te herinneren is nodig voor de test is geldig wanneer aan.
- Bepaal de remming van recall responsen in de aanwezigheid van donor antigenen door vergelijking van de netto opzwellen van elke injectie volgens de volgende formule:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Evaluatie van niertransplantatiepatiënten voor donor antigeen-specifieke reactie met Tv-DTH-assay
Aan de donor-reactieve cellulaire immuniteit bij niertransplantatiepatiënten testen we geïnjecteerd PBMC van deze patiënten met donorantigenen alleen of met een recall antigeen tetanustoxoïde (TT). Als een positieve controle werden cellen geïnjecteerd met TT alleen. We zien drie belangrijke patronen van vertraagde hypersensitiviteit bij transplantatiepatiënten (figuur 1). Alle patiënten reageerden sterk op Ag (TT) Recall. Patiënt # 62 toont de reglementeringspatroon, gekenmerkt door een zwakke reactie op donor antigeen en een duidelijke gekoppelde onderdrukking (67%) aan antigen respons in aanwezigheid van donor recall-antigeen. Dit is het patroon dat is in verband gebracht met orgel allograft tolerantie. Patiënt # 48 vertoont een nonregulatory patroon, dat het kenmerk van een zwakke reactie op de donor, maar geen verband onderdrukking (of verbonden onderdrukking <50%) heeft. Dezepatroon is vaker waargenomen bij patiënten die immunosuppressiva. Echter, sommige patiënten nog steeds ontvangen na transplantatie immunosuppressivum donor antigeen-linked onderdrukking van hun DTH respons geven. Patiënt # 8 vertoont de donor-gevoelig patroon, gekenmerkt door een hoge respons op donor antigeen en geen gekoppelde onderdrukking. Deze respons is geassocieerd met afstoting in klinische case studies 8.
2. De rol van donor-specifieke regelgeving in klinische controle in niertransplantatie
PBMC van patiënten die deelnamen aan de ITN507ST observationele studie, ("Identificatie en Mechanistische Onderzoeken van Tolerant Niertransplantatie patiënten") werden getest op donor-specifieke indirecte pathway T effector en regulatoire T responsen via het Tv-DTH-test en donor (of donor HLA- geëvenaard surrogaat) antigeen. Zoals getoond in figuur 2A, indirecte route effector T responsen op donorantigenen openbaarteen afzonderlijke spectrum in de inschrijving groepen voetzool zwelling toeneemt naarmate de patiënt klinische status varieert die tolerant zijn voor diegenen die chronisch verwerpen. PBMC van tolerante ontvangers geïnduceerde verminderde of geen DTH reacties terwijl PBMC afstoot individuen veroorzaakt sterke zwelling reacties.
De meting van de anti-donor indirecte route regulatoire T respons door de gekoppelde onderdrukking-test aangetoond dat het immuunsysteem de regelgeving was een belangrijk mechanisme voor donornier acceptatie. Figuur 2B toont een daling van de regulerende reacties over het bereik van de meeste (Tol) via intermediairs (Mono-en SI) naar het minst tolerant (CR) patiënten 14.
3. Controle van auto-immuniteit behulp Tv-DTH-assay
Een veelbelovend gebied is de toepassing van de Tv-DTH assay bewaking van auto-immuniteit. BOS, een proces van fibro-obliteratieve occlusie van de kleine luchtwegen in degetransplanteerde long, is de meest voorkomende oorzaak van longtransplantatie mislukking.
Door het testen van de rol van cel-gemedieerde immuniteit tegen collageen type V in dit proces, vonden we dat de hoogste relatieve risico van bronchiolitis obliterans (BOS) ontwikkeling waargenomen bij patiënten die een positieve Tv-DTH respons op collageen type V in hun volwassen perifeer bloed.
Figuur 3 is gebleken dat PBMC uit longtransplantatie, maar niet van gezonde controles of het syndroom patiënten collageen IV-reactieve Goodpasture na niertransplantatie, waren vaak collageen V reactieve 15.
4. Toepassing in tumorimmunologie
Trans-vivo DTH opent nieuwe mogelijkheden in het onderzoek naar kanker te prioriteren patiënten met prostaatkanker voor vaccinatie therapie. Sinds regulatoire T-cellen spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling en progressie van kanker, hebben we gebruik gemaakt Tv-DTH om de reactiviteit van PBMC testens van kankerpatiënten behandeld met een DNA-vaccin dat codeert prostaat zure fosfatase (PAP). We gebruikten de bystander suppressie van de reactie op recall-antigeen te bepalen of antigeen-specifieke regulerende activiteiten worden opgewekt in respons op vaccinatie. We vonden dat PAP-specifieke regulatoire T cellen spontaan ontstaan in sommige prostaatkankerpatiënten aanhouden gedurende immunisatie en de detectie van PAP-specifieke effector reacties na immunisatie voorkomen. Bij sommige patiënten die we PAP-specifieke gereguleerde T-celresponsen vóór immunisatie. Reeds bestaande regulerende T-cellen specifiek voor PAP kan worden geassocieerd met het onvermogen om antigeen-specifieke Th1 type immune responsen na vaccinatie ontwikkelen. U kunt ook vooraf bestaande regulatoire T-cel responsen op PAP zullen patiënten waarschijnlijk effector antwoorden te herkennen naar aanleiding van meerdere immunisatie. Hoe dan ook, deze test is een belangrijke constatering, aangezien het zou kunnen wijzen op een middel om prioriteiten te stellen of uit te sluiten individual patiënten van antigeen-specifieke vaccin evaluatie 17.
Figuur 1. Voorbeelden van de drie belangrijkste patronen van vertraagde type overgevoeligheid (DTH) gevonden bij niertransplantatiepatiënten. Patiënt PBMCs werden ingespoten in de voetzolen van CB17 SCID muizen met ofwel recall antigeen (TT), donorantigenen of met zowel donor + recall antigeen. Show is de netto zwelling respons over achtergrond.
Figuur 2. . Indirecte route van T-cell analyse onderwerpen ingeschreven in vijf groepen: identieke tweeling, klinisch tolerant (Tol), steroïde monotherapie(Mono), standaard immunosuppressie (SI) en chronische afstoting (CR) werden gedurende effector T reacties (A) en T regelgevingsystemen analyse (B) van Tv-DTH assay. Alle panelen: De individuele resultaten van elk onderwerp (individuele symbolen) en de mediaan (horizontale lijn) met kwartielen worden getoond. Significante verschillen tussen groepen zijn vertegenwoordigd, * p <0,05, ** p <0,01 en *** p <0,001, # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0.008.
Figuur 3. Meting van collageen type V-specifieke auto-immuniteit door Tv-DTH-test. Tv-DTH reacties van PBMC verkregen van normale gezonde controles, niertransplantatiepatiënten met GPS of longtransplantatie. Alle 3 groepen hadden positieve reacties (≥ 25x10 -4 inches net zwelling) aan antigeen te roepen, Col (II), een collageen fibrilar specifiek gewrichtskraakbeen, lokte geen een Tv-DTH respons bij patiënten of controles. Niertransplantatiepatiënten met GPS had verheven betekenen zwelling reacties op Col (IV). Longtransplantatie niet reageren op Col (IV), maar wist reageren op Col (V).
Figuur 4. Gebruik van Tv-DTH assay de tumor geïnduceerde immunoregulation beoordelen. PBMC van patiënten met prostaatkanker werden geïnjecteerd met prostaat zure fosfatase (PAP) alleen of met gevoeligheid antigen TT / DT en als controle prostaat specifiek antigeen (PSA) werd geïnjecteerd met of zonder herinneren antigen TT / DT. Injectie van PAP + TT / DT geïdentificeerd PAP antigeen-specifieke regulerende cellen, als co-toediening van PSA was niet in staat een DTH respons op de TT / DT recall-antigeen onderdrukken.
Figuur 5. Reproduceerbaarheid van Tv-DTH assay. Gecryopreserveerde cellen te verkrijgen door leukaferese op 2007/01/15 werden ontdooid, gewassen met PBS, gemengd met PBS of EBV of p37-TE + EBV (self peptide) of p37-MA + EBV (donor peptide) en geïnjecteerd in voetzolen. Cellen werden getest op volgende tijdstippen: 7/29/2008, 2/23/2010, 9/1/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De trans-vivo assay DTH is een nieuwe diagnostische test met een potentiële klinische toepassing bij de beoordeling van celgemedieerde responsen bij transplantatie, kanker en auto-patiënten. Het is waardevol omdat het niet alleen handig voor het controleren recall T effector reacties, maar ook kan detecteren T regelgevingsystemen. Een betrouwbare manier om de menselijke DTH regelgeving sporen zou de veiligheid van immunosuppressie terugtrekking voorspellen bij patiënten die kandidaat zijn voor monotherapie of tolerantieonderzoeken.
De Tv-DTH is zeer gevoelig voor het detecteren van de indirecte route van allorecognition van MHC. Echter TV-DTH kan worden aangepast om direct alloresponse tegen intacte donor MHC moleculen te detecteren. Om donor antigeen-linked onderdrukking van DTH te detecteren, kan EBV-LCL cellen die enkele donor HLA klasse I of klasse II worden gecoïnjecteerd met de patiënt PBMC. Wanneer EBV-LCL werden gebruikt als bron van antigen in het DTH assay werden cellen gamma-bestraald met 10.000 rad en 200.000 cellen werden gecogeïnjecteerd met PBMC in de voetzool van SCID muizen.
Tijdens het formuleren van de Tv-DTH vinden we dat verschillende voorwaarden deze assay kunnen beïnvloeden. De belangrijkste voorwaarde is voor de detectie van bystander suppressie. We aangetoond dat om remming van een recall DTH zowel de uitdaging terrein en de immunocompetentie van de muis adoptie ontvangende detecteren in reactie op co-gelokaliseerde donor antigeen kritisch factoren die de gevoeligheid van de Tv-DTH-test. PBMC van tolerante transplantatiepatiënten bystander suppressie gemedieerd wanneer PBMC werden geïnjecteerd in de voetzolen en niet oren, en alleen in immunodeficiënte, niet immunocompetente muizen 3.
Zoals alle assays de Tv-DTH-test heeft sterke en zwakke punten. De enorme voordelen van de Tv-DTH-test zijn de volgende: 1) is zeer gevoelig en betrouwbaar kan detecteren menselijke regulatoire T-cellen, 2) het detecteert regulerende T-cellen door hun functie niet door topvolger fenotype, 3) detecteert zowel Th-1 en Th-17 effector respons 4) ruwe cellysaten worden gebruikt regulering detecteren, zonder sensibiliseren de patiënten donor antigeen 5) Deze test geeft hoge reproduceerbaarheid / stabiliteit (Figuur 5). De nadelen zijn: 1) het vereist een relatief groot aantal PBMC per injectie, 2) de techniek vereist uitgebreide training, vooral in de bystander suppressie test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van dit manuscript hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de bijdragen van AM VanBuskirk erkennen aan de ontwikkeling van ons begrip van de gereglementeerde DTH respons in transplantatiepatiënten. Dit werk werd NIH subsidies ondersteund PO1AI084853 en R01AI066219-06, en door de EU-gesponsorde One Study.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
