Summary
屏幕使用一个斑马鱼原地肿瘤模型的黑色素瘤的改性剂是一种快速的方式。它利用的miniCoopR允许候选黑色素的黑素细胞中的基因表达的载体。黑色素瘤生存率曲线，入侵检测，协议规模的黑素细胞抗体染色和黑色素瘤移植试验的方法获得。
Abstract
的人类癌症基因组学研究已经取得了丰富的信息改变的基因，在肿瘤1,2,3。从这些研究中所产生的一个挑战是，许多基因被改变，它可以开车从那些在转换过程中偶然产生的肿瘤的遗传改变，很难区分。作出这样的区分是有好处的分析，可以定量衡量一个改变基因在肿瘤的发生和流程，使肿瘤的坚持和传播的效果。在这里，我们提出了一个快速的方法来筛选大量的候选黑色素瘤修饰符在斑马鱼黑色素瘤的启动和维护所需的步骤，包括一个土生土长的肿瘤模型4。在此分析是一个关键试剂的miniCoopR载体，这对新人的mitfa黑素细胞的规范因素的野生型拷贝到网关重组盒候选人梅尔阿诺马基因可重组5。 miniCoopR矢量具有mitfa的的抢救小基因的其中包含的的野生型mitfa的基因的启动子，开放阅读框和3'-非翻译区的。它使我们能够使用全长度的开放阅读框的候选人黑色素瘤修饰符的结构。个人可以被注入单细胞TG（mitfa：BRAF V600E）p53蛋白（LF）; mitfa（LF）斑马鱼胚胎克隆。矢量被集成miniCoopR TOL2介导的转基因6和救援黑色素细胞。因为它们被物理地连接至的mitfa挽救小基因，候选基因的表达在获救的黑素细胞，其中的一些将改造，并发展成肿瘤。对黑色素瘤的启动和黑色素瘤细胞属性的候选基因的效果，可以使用无黑色素瘤生存曲线，入侵检测，抗体染色和移植试验测定。
Protocol
1。筛选黑色素瘤的发病修饰符
- 创建网关中间条目的克隆，通过PCR扩增全长的感兴趣的基因（GOI）的开放阅读框和重组到pDONR 221中使用BP克隆酶II（Invitrogen公司）。使用多地点Gateway技术（Invitrogen）中，以重组p5E_mitfa，pME_GOI，Tol2kit＃302 p3E_SV40polyA 6和miniCoopR 5放置在miniCoopR载体（ 图1A）根据mitfa启动子基因的兴趣。
- 随着25的皮克TOL2转座表达注入25皮克的每个克隆到一个细胞TG（mitfa：BRAF V600E）; p53蛋白（LF）; mitfa（LF）三重纯合子斑马鱼胚胎如前所述7。孵育注射的胚胎在28.5°C。删除任何死胚在24 HPF。
- 选择转基因动物获救的黑素细胞在72 HPF放置在培养皿注入胚胎解剖microscopE根据入射光在白色背景（ 图1A）。
- 3 L罐中转移动物的斑马鱼设施，幼儿园的4 DPF如前所述8。
- 在2个月，与黑素细胞的救援大于4毫米2（ 图1A）的至少一个区域中选择的动物。黑素细胞拯救的程度在72 hpf时，在2个月的黑素细胞的救援程度之间有很强的相关性。当胚胎与黑素细胞拯救拾取72 hpf时，它们的大部分（约80％），将至少有一个面积大于4毫米2在2个月的黑素细胞的救援。
- 屏幕上所选择的动物，每周肿瘤的存在下（ 图1B）。病理组织学和形态学变化之间有很强的相关性。从良性到恶性的过渡是公认的形态学变化时，病变成了提高表面的动物。隔离荷瘤灵魂LS的研究。
- 绘制黑色素瘤生存曲线的横坐标和纵坐标％的黑色素瘤生存率随着年龄的增长在几周内。动物黑素细胞表达基因的利益相比，控制动物的黑素细胞表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）（ 图1C）。动物注射与miniCoopR-EGFP的肿瘤发病中位数大约是18周。使用数秩检验，确定两条曲线显着差异。
2。肿瘤侵袭实验
- 选择孤立的斑马鱼，背面，肿瘤的发展中的背鳍（ 图2A），后脑和前缘后边界之间的区域。
- 两个星期后，黑色素瘤发病安乐死的鱼的指引由美国兽医医学协会面板上的“安乐死”，并经大学，马萨诸塞州医学院宏titutional动物管理和使用委员会（IACUC）。具体而言，鱼被放置成菜与0.6毫克/毫升三卡因直至鳃运动停止。
- 做一个切口，用解剖刀鱼的腹膜腔中，然后在4％多聚甲醛（PFA）的鱼放置在4℃下过夜进行固定。
- 治疗用0.5M EDTA过夜，在4℃下脱钙。
- 在录像带福尔马林固定过夜，脱水1小时，二甲苯3次，每次1小时，然后用石蜡治疗2次，每次2小时，在60°C。
- 嵌入在石蜡中的组织在模具中，并使其凝固为30分钟至1小时。
- 进行5μm切片，每50微米。的部分应该是通过横向和入侵最深的点可以被识别，使整个病变。按照苏木精和曙红染色。
- 评估肿瘤的侵袭，通过测量肿瘤细胞是否保持胶原致密层以外，侵入背肌肉组织或侵入到脊柱（ 图2B，C）。确定两个样本集之间的统计学差异。
3。规模的黑素细胞抗体染色
- 化妆PO480毫升的0.1M的Na 2 HPO 4和20毫升0.1M的NaH 2 PO 4缓冲液。确保PH值为7.3。化妆2倍修复缓冲液含有8.0克蔗糖，0.15毫升0.2M的CaCl 2和90毫升0.2M PO 4缓冲液，pH值7.3。如果需要，调整pH值至7.3，用NaOH或HCl，然后弥补与PO 4缓冲液至100毫升。
- 称取300毫克的固体PFA，并添加微量离心管中。添加5毫米的NaOH的体积等于4.5×质量，单位为毫克，PFA（ 例如 450 UL 5毫米的NaOH至100毫克PFA）。热火在60-70°C，偶尔晃动，直到PFA溶解。自旋向下剩下的颗粒物和恢复20％PFA上清液。新鲜的每一次。
- 准备固定的解决方案，其中包含1个网络连接×缓冲液和4％PFA。
- 在0.17毫克/毫升三卡因麻醉的鱼。
- 入射光在解剖显微镜下摘下背鳞使用的是锋利的细尖镊子，小心不要损坏含黑色素细胞一半的规模（ 图3）。将尺度，直接固定到1ml的溶液，在室温下孵育，从钳子同时转动，为≥2小时。转移的鱼成鱼水的鱼和监控，以确认成功恢复。
- 漂白着色的黑素细胞洗固定尺在PBST（1×PBS pH7.4的，0.1％的Triton X-100）的2倍，在室温下5分钟。加入1毫升新鲜配制的漂白剂溶液含有0.4毫升10％的KOH和0.15毫升30％H 2 O 2在5毫升用dH 2 O。 ，放在封口膜或盖锁，以防止气体从破裂的管道开放。继续漂走了，直到颜料（10分钟，是典型的）（ 图3B，C）。在PBST四次清洗，在室温下5分钟erature。
- 块，用于至少30分钟，在方框溶液由1倍的PBS pH值7.4，0.2％的Triton X-100，2毫克/毫升BSA，1％DMSO，0.02％NaN 3的 2％，羔羊血清。发表NaN的3，如果发展中国家与HRP反应。
- 与初级抗体孵育在方框溶液在室温下过夜。您需要有至少400微升的溶液样品，以使他们淹没。
- 鳞洗净3次，在室温下30分钟，在PBST。
- 从2小时至过夜，溶液在室温下在方框的二次抗体孵育。
- 用PBST + 0.1μM的DAPI染色10分钟。
- 5分钟，用PBST洗涤3次。
- 鳞安装在载玻片上在vectashield一滴使得秤的凹面侧朝下向滑动，并放置在他们的玻璃盖玻片。在荧光显微镜下（ 图3D，E，F，G的边缘密封的透明指甲油的幻灯片，并观察幻灯片
4。移植含量
- 准备收件人2-3个月大的casper 9鱼照射25 Gy的γ射线照射前一天，移植10。让鱼在鱼水之恢复。
- 安乐死肿瘤的轴承鱼如前所述（2.2节）。
- 切断肿瘤，并把它放在培养皿中，约5毫升5％FBS过滤消毒的0.9倍PBS。骰子的肿瘤，而在溶液中，用剃刀。
- 在室温下工作，磨碎与P1000的移液管，以得到单一的细胞。化妆用过滤灭菌的0.9倍的PBS的体积至25ml含有5％FBS。
- 通过40μM网过滤器过滤。
- 附带在Eppendorf 5810R台式离心机在1,500 rpm（453相对离心力）10分钟。
- 除去上清液，使细胞悬浮液以大约所需的浓度（假定为100毫米3肿瘤的10 7个细胞）。
- 计算T他确切的细胞数用血细胞计数器，稀释细胞悬浮液，使最终的注射量是约5微升。例如，如果以被注入50,000个细胞，将细胞悬浮液应稀释至最终浓度为10000个细胞/μL。滑动管中，将细胞悬浮液以防止结块的细胞每隔几分钟。
- 用100％乙醇和0.9倍的PBS洗一个26秒计（锥尖）701 N 10微升Hamilton注射器2-3倍。装入注射器5微升细胞悬浮液。
- 在0.17毫克/毫升三卡因麻醉照射收件人鱼。鱼侧放在潮湿的Kimwipe地点（ 图4A）。
- 稳定的鱼，另一只手将针头的斜面朝上，以45°角以上的腹腔后边界之间大约一半的后脑和前缘的背鳍的鱼到侧翼。轻轻压下柱塞（ 图4B）。/ P>
- 让鱼恢复新鲜的鱼水，每天观察鱼的肿瘤细胞植入（ 图4C）。如果已发生的植入，持续增长和疾病的发展也可以观察到。
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Representative Results
一单元格的Tg（mitfa：BRAF V600E）; p53基因（如果）; mitfa（如果）斑马鱼胚胎与miniCoopR矢量含有黑色素瘤癌基因SETDB1 5或EGFP的mitfa启动子的控制下，每个注入。胚胎选择，并允许成熟的黑素细胞的救援。在2个月内黑素细胞救援与动物的年龄大于4平方毫米的选择。在动物中筛选每周黑色素瘤。为成人肿瘤发病率曲线表明，SETDB1癌基因显着加速黑色素瘤onsetas EGFP的控制（ 图1）相比。动物肿瘤之间的后脑和后的边界，背鳍前缘（ 图2A）被分离出来。黑色素瘤发病两个星期后，它们被固定在4％多聚甲醛，切片，用苏木精和曙红染色，以评估黑色素瘤侵入未其潜在的组织。黑色素瘤表达SETDB1的局部浸润，，EGFP控制黑色素瘤（ 图2C）。为了寻找候选基因的表达，背鳞被拔去从野生型斑马鱼和染色用1:100稀释的一抗承认Mitfa的转录因子，然后由1:1000稀释的FITC标记的羊抗-兔IgG抗体（ 图3）。评估可移植性的肿瘤，黑色素瘤细胞中分离出的Tg（mitfa：BRAF V600E），p53蛋白（LF）;注入mitfa（LF）鱼与miniCoopR-EGFP。 50,000个细胞皮下注射到收件人的casper突变体的前一天，被照射25戈瑞。通过年龄2周，色素来自供体的细胞（ 图4）容易地识别。
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图1。黑色素瘤发病的修饰符使用的miniCoopR的分析筛选。 A）示意图的miniCoopR检测。获救的黑素细胞（箭头），含有miniCoopR矢量与感兴趣的基因的胚胎。比例尺= 250μM。成人大于4平方毫米黑素细胞救援（箭头）。比例尺= 500μMB）MiniCoopR-EGFP救出斑马鱼无色素和色素瘤（箭头）。 C）代表黑色素瘤生存率曲线比较肿瘤表达基因SETDB1和控制绿色荧光蛋白基因（P = 9.4×10 -7，对数秩χ2） 点击此处查看大图 。
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图2。肿瘤的侵袭实验。 A）的MiniCoopR救出斑马鱼背部肿瘤（箭头）之间的后脑和前缘的背鳍后的边界。 B）的横截面，示出致密层（SC），体重秤，规模相关的黑素细胞（SAM）（插图，比例尺= 50μM），肌肉（M）和脊柱（SPC）。比例尺= 200μM。 C）的横截面图，显示一种非侵入性的miniCoopR-EGFP的肿瘤（T）（左）和miniCoopR-SETDB1肿瘤（右），已经侵入通过地层compactuminto肌肉（M）和脊柱。比例尺= 200μM。
图3。定额黑色素细胞的抗体染色。 A）秤弹拨从一个的麻醉miniCoopR-EGFP斑马鱼。 B）的未漂白规模与色素沉着的黑色素细胞和C）漂白小号Cale的从miniCoopR-EGFP的斑马鱼。比例尺= 100μM。未漂白的规模与D）Mitfa抗体和E染色）DAPI。漂白染色用F）的规模Mitfa抗体和G）DAPI。比例尺= 40微米。
图4的黑色素细胞移植 。 A）未注射卡斯帕斑马鱼。比例尺= 500μM。 B）皮下移植部位（箭头）50,000黑色素瘤细胞注射后立即在照射卡斯帕收件人。比例尺= 200μM。 C）辐照卡斯帕收件人50,000黑色素瘤细胞注射两个星期后的肿瘤细胞植入（箭头）。
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Discussion
miniCoopR方法使表达的基因在斑马鱼的黑素细胞的兴趣。这种方法利用的事实，的斑马鱼mitfa基因的作用细胞自主性。出于这个原因，黑素细胞获救由miniCoopR载体是一定要包含小基因和任何感兴趣的基因，它在物理上耦合。营救黑素细胞是清晰可见，能够得到在被注射的动物，作为单细胞胚胎。特定程度的嵌合体被选中，并可以拿下超过此截止动物肿瘤发病或其他特性。的一大好处是足够的嵌合体动物，可以很容易识别，而无需获得稳定的转基因株系对应的每一个基因测试的兴趣，取得了的miniCoopR方法。时间，精力和费用都保存在基因被调查的数量比例。
正如以前报道的5
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢伦纳德一博士在他的实验室，这些技术最初开发区域生态克里斯汀关和已故的简智彬在这项工作中所用的质粒的礼物，詹姆斯·李斯特和大卫Raible抗体染色的援助;和詹姆斯Neiswender显微注射的视频。这项工作是由美国国立卫生研究院授予R00AR056899-03 CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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