Summary
Un moyen rapide pour le dépistage de modificateurs de mélanome en utilisant un modèle de tumeur poisson zèbre autochtone est présenté. Il tire profit du vecteur miniCoopR qui permet l'expression de gènes candidats de mélanome dans les mélanocytes. Une méthode pour obtenir des courbes de survie sans mélanome, un dosage invasion, un protocole pour la coloration d'anticorps de mélanocytes échelle et un essai de transplantation mélanome sont décrits.
Abstract
Les études génomiques de cancers humains ont révélé une mine de renseignements sur les gènes qui sont altérés dans les tumeurs 1,2,3. Un défi découlant de ces études est que de nombreux gènes sont altérés, et il peut être difficile de distinguer les altérations génétiques qui ont poussé la tumorigenèse de ceux qui se leva d'ailleurs lors de la transformation. Pour faire cette distinction, il est utile d'avoir un test qui peut mesurer quantitativement l'effet d'un gène modifié sur l'initiation de la tumeur et d'autres procédés qui permettent tumeurs à persister et à diffuser. Nous présentons ici un moyen rapide pour cribler un grand nombre de modificateurs de mélanome chez le poisson zèbre candidats à l'aide d'un 4 tumeurs autochtones modèle qui englobe les étapes nécessaires à l'initiation et le maintien du mélanome. Un réactif clé dans ce test est le vecteur miniCoopR, qui couple une copie de type sauvage de la spécification facteur mitfa mélanocytes à une cassette de recombinaison dans lequel la passerelle candidate melAnoma gènes peuvent être recombinées 5. Le vecteur a un minigène miniCoopR sauvetage mitfa qui contient le promoteur, le cadre de lecture ouvert et la région 3 'non traduite du gène de type sauvage mitfa. Il nous permet de faire des constructions à l'aide de longue durée cadres ouverts de lecture de modificateurs de mélanome candidats. Ces clones individuels peuvent ensuite être injecté dans la cellule unique Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (lf). Le vecteur miniCoopR obtient intégré par Tol2 médiée par transgénèse 6 et sauve mélanocytes. Parce qu'ils sont physiquement couplé à la minigène mitfa sauvetage, les gènes candidats sont exprimés dans les mélanocytes rescapés, dont certains vont transformer et se développer en tumeurs. L'effet d'un gène candidat à l'initiation du mélanome et des cellules de mélanome peut être mesurée à l'aide des courbes de survie sans mélanome, des essais d'invasion, la coloration d'anticorps et les essais de transplantation.
Protocol
1. Dépistage du mélanome Modificateurs Onset
- Créer des clones de passerelle moyen d'entrée par PCR amplifiant le cadre de pleine longueur de lecture ouvert de gènes d'intérêt (GOI) et la recombinaison en utilisant les batteries BP 221 pDONR clonase II (Invitrogen). Utilisez la technologie de passerelle multi-sites (Invitrogen) pour recombiner p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit N ° 302 p3E_SV40polyA 6 et miniCoopR 5 afin d'ajouter des gènes d'intérêt dans le cadre du promoteur mitfa dans le vecteur miniCoopR (figure 1A).
- Injecter 25 picogrammes de chaque clone ainsi que 25 picogrammes Tol2 ARNm transposase dans une cellule-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (LF) d'embryons de poisson zèbre triplement homozygotes 7 comme décrit précédemment. Incuber les embryons injectés à 28,5 ° C. Retirez tous les embryons morts à 24 hpf.
- Sélectionnez animaux transgéniques avec mélanocytes secourus à 72 hpf en plaçant la boîte de Petri contenant des embryons injectés sur une dissection microscope sous la lumière incidente sur un fond blanc (figure 1A).
- Transfert à 3 réservoirs animaux L dans la pépinière de l'installation poisson zèbre à 4 dpf comme décrit précédemment 8.
- A 2 mois, sélectionnez les animaux avec au moins une zone de sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 (figure 1A). Il ya une forte corrélation entre le degré de sauvetage mélanocytes à 72 hpf et le degré de sauvetage mélanocytes moins 2 mois. Lorsque les embryons ayant sauvetage mélanocytes sont cueillies à 72 hpf, la majorité d'entre eux (environ 80%) ont au moins une zone de sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 à 2 mois.
- Écran animaux sélectionnés hebdomadaires pour la présence de tumeurs (figure 1B). Il ya une forte corrélation entre les changements histopathologiques et morphologiques. Transition de bénigne à maligne est comptabilisé comme un changement morphologique lorsque les lésions se soulèvent à la surface de l'animal. Isoler anima porteur d'une tumeurls pour étude.
- Tracer des courbes de survie sans mélanome avec l'âge dans les semaines en abscisse et le mélanome pour cent de la survie sans en ordonnée. Les animaux atteints de mélanocytes qui expriment un gène d'intérêt sont comparés à des animaux témoins qui expriment l'EGFP (enhanced green fluorescent protein) dans les mélanocytes (figure 1C). L'apparition de tumeur médiane pour animaux injectés avec miniCoopR-EGFP est d'environ 18 semaines. Déterminer si les deux courbes sont statistiquement différentes en utilisant un test du log-rank.
2. Essai de l'invasion tumorale
- Sélectionnez le poisson-zèbre isolé qui développent des tumeurs dorsalement, dans une région située entre le bord postérieur du cerveau postérieur et bord antérieur de la nageoire dorsale (figure 2A).
- Deux semaines après l'apparition du mélanome euthanasier les poissons selon les directives spécifiées par le Groupe American Veterinary Medical Association sur l'euthanasie et approuvé par l'Université de Massachusetts Medical School Insprotection des animaux et le Comité titutional utilisation (IACUC). Plus précisément, un poisson est placé dans une boîte avec 0,6 mg / ml tricaïne jusqu'à ce que le mouvement s'arrête branchies.
- Faire une incision dans la cavité péritonéale du poisson avec un scalpel, puis placer le poisson dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant une nuit à 4 ° C pour la fixation.
- Traiter avec 0,5 M d'EDTA nuit à 4 ° C de la détartrer.
- Fixer avec du formol dans la cassette du jour au lendemain, déshydrater pendant 1 heure, clair avec du xylène 3 fois pendant 1 heure et ensuite traiter avec de la paraffine 2 fois pour 2 heures chacune à 60 ° C.
- Incorporer le tissu dans de la paraffine dans un moule et le laisser se solidifier pendant 30 min à 1 h.
- Assurez-5 sections um, un toutes les 50 Pm. Les sections doivent être transversal et toute la lésion sorte que le point le plus profond de l'invasion peut être identifié. Suivi de l'hématoxyline et éosine.
- Évaluer l'invasion tumorale en mesurant si les cellules tumorales restent en dehors du collagène couche compacte, envahir la dorsalemusculature ou envahir plus loin dans la colonne vertébrale (figure 2B, C). Déterminer différence statistique entre les deux séries d'échantillons.
3. La coloration d'anticorps de mélanocytes échelle
- Maquillage PO4 tampon avec 80 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 et 20 ml 0,1 M NaH 2 PO 4. Assurez-vous que le pH est de 7,3. Maquillage tampon fix 2x contenant 8,0 g de saccharose, 0,15 ml 0,2 M CaCl 2 et 90 ml 0,2 M PO 4, pH 7,3. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,3 avec NaOH ou HCl, puis compléter à 100 ml avec tampon PO 4.
- Peser jusqu'à 300 mg de solide PFA et ajouter dans un tube à centrifuger. Ajouter 5 mM de NaOH à un volume égal à 4,5 x la masse, en milligrammes, de PFA (par exemple 450 ul 5 mM NaOH à 100 mg PFA). Chauffer à 60-70 ° C avec agitation jusqu'à occasionnelle de la PFA soit dissoute. Isoler les particules restantes et récupérer 20% de PFA surnageant. Assurez frais à chaque fois.
- Préparer une solution contenant de fixation 1x fix tampon et 4% de PFA.
- Anesthésier les poissons de 0,17 mg / ml tricaïne.
- Utilisation de la lumière incidente sous un microscope à dissection arracher écailles dorsales pointues en utilisant une pince à pointe fine, en prenant soin de ne pas endommager la moitié des mélanocytes contenant de l'échelle (figure 3A). Placer les échelles directement à partir de la pince dans 1 ml de solution de fixation et incuber à température ambiante, tout en tournant, pour ≥ 2 h. Transférer le poisson dans l'eau du poisson et de surveiller le poisson pour confirmer la récupération réussie.
- Pour l'eau de Javel mélanocytes pigmentés laver échelles fixes dans du PBST (1x PBS, pH 7,4, 0,1% de Triton X-100) 2 fois pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 1 ml d'une solution fraîchement préparée de blanchiment contenant 0,4 ml de KOH à 10% et 0,15 ml 30% H 2 O 2 dans 5 ml de dH 2 O. Mettez serrures parafilm ou casquette pour empêcher le gaz de l'éclatement des tubes ouverts. Continuer jusqu'à ce que le blanchiment pigment est parti (10 min est typique) (figure 3B, C). Laver à l'PBST quatre fois pendant 5 min à température ambiantetérature.
- Pour bloquer au moins 30 min dans une solution composée de blocs 1x PBS pH 7,4, 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN 3 et 2% de sérum d'agneau. Laissez de côté NaN 3 si le développement de la réaction HRP.
- Incuber avec l'anticorps primaire en solution bloquer pendant une nuit à température ambiante. Vous devez avoir au moins 400 pi de solution sur les échantillons pour les maintenir immergés.
- Laver les échelles 3 fois pendant 30 min dans du PBST à la température ambiante.
- Incuber avec l'anticorps secondaire de 2 heures ou toute la nuit dans une solution de bloc à température ambiante.
- Colorer pendant 10 min avec du PBST + DAPI uM 0,1.
- Laver 3 fois pendant 5 min avec du PBST.
- Monter les échelles sur une lame de verre dans une goutte d'Vectashield sorte que le côté concave de la balance tournée vers le bas en direction de la lame et de placer une lamelle couvre-objet en verre sur eux. Scellez les bords de la lame avec vernis à ongles transparent et observez les lames sous un microscope à fluorescence (figure 3D, E, F, G
4. Transplantation Assay
- Préparer destinataire 2-3 mois vieux casper 9 poissons par irradiation avec 25 Gy d'irradiation gamma un jour avant la transplantation 10. Permettre aux poissons de se remettre dans l'eau du poisson.
- Euthanasier un poisson porteur d'une tumeur comme décrit précédemment (section 2.2).
- Coupez la tumeur et le mettre dans une boîte de Pétri avec environ 5 ml de filtre stérilisé 0.9x PBS avec 5% de FBS. Dés la tumeur avec un rasoir tandis que dans la solution.
- Travailler à la température ambiante, on triture avec une pipette P1000 pour obtenir des cellules individuelles. Compléter le volume à 25 ml avec du PBS 0.9x stérilisée par filtration avec 5% de FBS.
- Filtrer à travers filtre 40 mesh uM.
- Faites tourner dans une centrifugeuse Eppendorf 5810R table à 1.500 tours par minute (453 rcf) pendant 10 min.
- Enlever le surnageant et faire suspension cellulaire à une concentration d'environ désiré (en supposant 10 7 cellules pour une tumeur 100 mm 3).
- Calculer til précise le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre et diluer la suspension cellulaire de sorte que le volume d'injection final est d'environ 5 pl. Par exemple, si 50.000 cellules doivent être injectés, la suspension cellulaire doit être dilué à une concentration finale de 10.000 cellules / ul. Basculez le tube contenant la suspension cellulaire à chaque quelques min pour empêcher l'agglutination des cellules.
- Laver une jauge 26s (pointe conique) 701 N seringue de 10 ul Hamilton 2-3 fois avec de l'éthanol à 100% et 0.9x PBS. Chargez la seringue avec 5 pi de la suspension cellulaire.
- Anesthésier le poisson receveur irradié dans 0,17 mg / ml tricaïne. Placer le poisson sur le côté sur une Kimwipe humide (figure 4A).
- Stabiliser le poisson avec une main et insérez l'aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45 ° dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale à mi-chemin entre le bord postérieur du cerveau postérieur et bord antérieur de la nageoire dorsale. Appuyer doucement sur le piston (figure 4B). </ Li>
- Permettre aux poissons de se remettre à l'eau les poissons frais et observer les poissons par jour pendant la prise de greffe tumorale (figure 4C). Si la prise de greffe a eu lieu, la croissance continue et le développement des maladies peuvent également être observés.
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Representative Results
Une cellule-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (LF) ont été injectés avec le vecteur contenant l'oncogène miniCoopR mélanome SETDB1 5 ou EGFP, chacun sous le contrôle du promoteur mitfa. Embryons sauvetage mélanocytes ont été sélectionnés et ont permis de mûrir. À 2 mois d'âge avec des animaux sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 ont été sélectionnés. Les animaux ont été examinés par semaine pour les mélanomes. Courbes d'incidence de tumeurs pour les adultes a montré que l'oncogène SETDB1 considérablement accéléré onsetas mélanome par rapport au témoin EGFP (Figure 1). Les animaux qui ont développé des tumeurs entre le bord postérieur du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale (figure 2A) ont été isolés. Deux semaines après l'apparition du mélanome ont été fixés dans du paraformaldéhyde 4%, sectionnées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour évaluer l'invasion du mélanome en nonjacent tissus. Les mélanomes exprimant SETDB1 étaient plus localement invasive que la EGFP contrôle mélanomes (figure 2C). Afin de rechercher l'expression d'un gène candidat, écailles dorsales ont été arrachés d'un zèbre de type sauvage et coloré en utilisant une dilution 1:100 d'un anticorps primaire qui reconnaît le facteur de transcription Mitfa suivie d'une dilution 1:1000 de chèvre anti-FITC -lapin IgG (figure 3). Pour évaluer transplantabilité de la tumeur, les cellules de mélanome ont été isolés à partir d'une Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) les poissons injectés avec miniCoopR-EGFP. 50.000 cellules ont été injectées en sous-cutané dans un mutant destinataire casper qui avait été irradié la veille avec 25 Gy. En 2 semaines d'âge, pigmentées bailleurs de cellules dérivées étaient facilement reconnaissables (figure 4).
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Figure 1. Dépistage des modificateurs d'apparition de mélanome en utilisant le test miniCoopR. A) Schéma de l'essai miniCoopR. Embryon de mélanocytes sauvés (tête de flèche) contenant le vecteur miniCoopR et le gène d'intérêt. Barre d'échelle = 250 pM. Adultes avec plus de 4 mm 2 sauvetage des mélanocytes (tête de flèche). Barre d'échelle = 500 uM B) MiniCoopR-EGFP a sauvé le poisson zèbre avec un amelanotic et une tumeur pigmentée (pointes de flèches). C) représentant la courbe de survie sans mélanome comparant les tumeurs exprimant l'oncogène SETDB1 et un contrôle EGFP gène (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 2. Analyse invasion tumorale. A) MiniCoopR-zèbre sauvé d'une tumeur dorsale (tête de flèche) entre le bord postérieur du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale. B) Coupe transversale montrant couche compacte (SC), les échelles, de l'échelle associée à des mélanocytes (SAM) (en médaillon, échelle = 50 pM), le muscle (M) et la colonne vertébrale (CPS). Barre d'échelle = 200 pM. C) Des coupes transversales montrant un non-invasive miniCoopR-EGFP tumeur (T) (à gauche) et un miniCoopR-SETDB1 tumeur (à droite) qui a envahi à travers le muscle strate compactuminto (M) et la colonne vertébrale. Barre d'échelle = 200 pM.
Anticorps coloration Figure 3. Échelle des mélanocytes. A) Balances été extirpée d'une anesthésie miniCoopR-EGFP poisson zèbre. B) échelle écrus avec mélanocytes pigmentés et C) s blanchicale de miniCoopR-EGFP poisson zèbre. Barre d'échelle = 100 pM. Échelle écrus colorées avec un D) anticorps Mitfa et E) DAPI. Échelle blanchi colorées avec un F) Mitfa anticorps et G) DAPI. Barre d'échelle = 40 uM.
Figure 4. Transplantation de cellules de mélanome. A) non injectée poisson zèbre casper. Barre d'échelle = 500 uM. B) sous-cutanée transplantation site (tête de flèche) sur un receveur irradié casper immédiatement après l'injection de 50.000 cellules de mélanome. Barre d'échelle = 200 pM. C) destinataire casper irradiés montrant la prise de greffe tumorale (flèche) deux semaines après l'injection de 50.000 cellules de mélanome.
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Discussion
La méthode miniCoopR permet l'expression de gènes d'intérêt dans les mélanocytes de poisson zèbre. Cette approche tire parti du fait que le gène poisson zèbre mitfa agit cellulaire-autonome. Pour cette raison, les mélanocytes sauvés par le vecteur miniCoopR êtes certain de contenir le minigène et tout gène d'intérêt auquel il est couplé physiquement. Rescued mélanocytes sont clairement visibles et peuvent être obtenus chez les animaux qui ont été injectés dans des embryons unicellulaires. Un degré de chimérisme spécifié est sélectionné, et les animaux dépassant ce seuil peut être marqué pour l'apparition des tumeurs ou d'autres caractéristiques. Un des principaux avantages de la méthode est que les animaux miniCoopR avec chimérisme suffisante peut être facilement identifié et marqué sans avoir à obtenir des lignées stables transgéniques correspondant à chaque gène d'intérêt testé. Temps, d'efforts et de dépenses sont enregistrés au prorata du nombre de gènes d'intérêt devant être sondés.
Comme indiqué auparavant 5
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Leonard I. Zon en laboratoire dont ces techniques ont été initialement développées; Kristen Kwan et la fin des années Chi-Bin Chien pour les dons de plasmides utilisés dans ce travail; James Lister et David Raible de l'aide pour coloration des anticorps, et James Neiswender pour la micro-injection vidéo. Ce travail a été financé par le NIH subvention R00AR056899-03 à CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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