Screening for Melanoma Modifiers anvendelse af et zebrafisk Autokton tumormodel

Summary

En hurtig måde at screene for melanom modifikatorer anvendelse af en zebrafisk autokton tumormodel er præsenteret. Den udnytter den miniCoopR vektor, som tillader ekspression af kandidat melanom gener i melanocytter. En fremgangsmåde til opnåelse af melanom-free overlevelseskurverne, en invasion assay, en protokol til antistoffarvning af skala melanocytter og en melanom transplantation assay er beskrevet.

Abstract

Genomiske undersøgelser af humane cancere har givet et væld af oplysninger om gener, der er ændret i tumorer ^1,2,3. En udfordring i forbindelse med disse undersøgelser er, at mange gener er ændret, og det kan være vanskeligt at skelne genetiske ændringer, der kørte tumorigenese fra at de opstod øvrigt under transformation. For at tegne denne skelnen er det fordelagtigt at have en assay, der kan kvantitativt måle effekten af ​​et ændret gen på tumor initiering og andre processer, der muliggør tumorer til at vare ved og formidle. Her præsenterer vi en hurtig metode til at screene et stort antal kandidat melanom modifikatorer i zebrafisk med en autokton tumormodel ^4, som omfatter nødvendige trin for melanom initiering og vedligeholdelse. Et vigtigt reagens i dette assay er miniCoopR vektoren, som kobler en vildtype-kopi af mitfa melanocyt specifikation faktor til en Gateway rekombination kassette i hvilken kandidat melAnoma gener kan rekombineres ^5. The miniCoopR vektor har en mitfa redning minigen, som indeholder promotoren, åbne læseramme og 3'-utranslaterede region af det vildtype-mitfa genet. Det giver os mulighed for at lave konstruktioner under anvendelse fuld længde åbne læserammer af kandidat melanom modifikatorer. Disse individuelle kloner kan derefter injiceres i enkelt celle Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf), mitfa (lf) zebrafisk embryoner. The miniCoopR vektor bliver integreret ved Tol2-medieret transgenese ⁶ og redder melanocytter. Fordi de er fysisk koblet til mitfa redning minigenet, der kandidatgener udtrykt i reddede melanocytter, hvoraf nogle vil omdanne og udvikle sig til tumorer. Virkningen af ​​et kandidatgen for melanom initiering og melanomcellelinjer egenskaber kan måles med melanom-free overlevelseskurverne, invasion assays, antistof-farvning og transplantation assays.

Protocol

1. Screening for Melanom Onset Modifiers

1. Opret Gateway midterste entry kloner ved PCR amplifikation af fuldlængde åben læseramme på gener af interesse (GOI) og rekombinere til pDONR 221 ved anvendelse BP clonase II (Invitrogen). Brug Multisite Gateway-teknologi (Invitrogen) at rekombinere p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ og miniCoopR ⁵ for at gener af interesse under mitfa promotoren i miniCoopR vektoren (figur 1A).
2. Injicer 25 picogram af hver klon sammen med 25 picogram Tol2 transposase mRNA i en celle Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf), mitfa (lf) triply homozygote zebrafisk embryoner som tidligere beskrevet ^7. Inkuber de injicerede embryoner ved 28,5 ° C. Fjern eventuelle døde fostre ved 24 HPF.
3. Vælg transgene dyr med reddede melanocytter ved 72 HPF ved at anbringe petriskål indeholdende injicerede embryoner på et dissekerende microscope under indfaldende lys mod en hvid baggrund (figur 1A).
4. Overførsel dyr til 3 l tanke i børnehaven af zebrafisk facilitet ved 4 dpf som tidligere beskrevet ^8.
5. Efter 2 måneder ved at vælge dyrene med mindst et område af melanocyt redning større end 4 mm ² (figur 1A). Der er en stærk sammenhæng mellem graden af ​​melanocyt redning ved 72 HPF og graden af ​​melanocyt redning på 2 måneder. Når embryoer med melanocyt redning samles ved 72 HPF, vil de fleste af dem (~ 80%) har mindst ét område af melanocyt redning større end 4 mm ² efter 2 måneder.
6. Screen de udvalgte dyr ugentlige for tilstedeværelsen af tumorer (figur 1B). Der er en stærk sammenhæng mellem histopatologiske og morfologiske forandringer. Overgang fra godartede til malign indregnes som en morfologisk ændring Hvis læsioner hæves fra overfladen af ​​dyret. Isoler tumorbærende animals for at studere.
7. Trække melanom-free overlevelseskurverne med alderen i uger på abscissen, og procent melanom overlevelse på ordinaten. Dyr med melanocytter, der udtrykker et gen af interesse sammenlignes med kontroldyr, der udtrykker EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) i melanocytter (figur 1C). Den mediane tumor indtræden for dyr injiceret med miniCoopR-EGFP er cirka 18 uger. Afgøre, om de to kurver er statistisk forskellige ved anvendelse af en log rank test.

2. Tumorinvasion Assay

1. Vælg isoleret zebrafisk, der udvikler tumorer dorsalt, i et område mellem den bageste grænse af baghjerne og forreste kant af rygfinnen (figur 2A).
2. To uger efter melanom debut aflive fisken efter retningslinier fastsat af American Veterinary Medical Association Panel om Eutanasi og godkendt af University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC). Specifikt er en fisk anbragt i en skål med 0,6 mg / ml tricaine indtil gælle bevægelse standser.
3. Lave et snit i det peritoneale hulrum af fisken med en skalpel og derefter anbringe fisk i 4% paraformaldehyd (PFA) natten over ved 4 ° C til fiksering.
4. Der behandles med 0,5 M EDTA natten over ved 4 ° C til afkalkning.
5. Fix med formalin i kassette natten over, tørrer i 1 time, klart med xylen 3 gange i 1 time og derefter behandle med paraffin 2 gange i 2 timer hver ved 60 ° C.
6. Indlejre vævet i paraffin i en form og lad den størkne i 30 minutter til 1 time.
7. Gøre 5 um snit, en for hver 50 um. Sektionerne bør være tværgående og gennem hele læsion, således at punktet for dybeste invasion kan identificeres. Følge af hematoxylin og eosin-farvning.
8. Vurdere tumor invasion ved at måle, hvorvidt tumorceller forbliver uden for kollagen stratum compactum, invadere i den dorsalemuskulatur eller invadere længere ind i rygraden (fig. 2B, C). Bestemme statistisk forskel mellem de to sæt prøver.

3. Antistoffarvning over Skala Melanocytter

1. Der fyldes op PO4 buffer med 80 ml ​​0,1 M Na ₂ HPO ₄ og 20 ml 0,1 M NaH ₂ PO _4. Sørg for, at pH-værdien er 7,3. Der fyldes op 2x fix buffer indeholdende 8,0 g saccharose, 0,15 ml 0,2 M _CaCl2 og 90 ml 0,2 M _PO4-puffer, pH 7,3. Om nødvendigt justeres pH til 7,3 med NaOH eller HCI fyldes op til 100 ml med _PO4-puffer.
2. Veje op til 300 mg fast stof PFA og tilsæt til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 5 mM NaOH til et volumen svarende til 4,5 x masse i mg, af PFA (fx 450 ul 5 mM NaOH til 100 mg PFA). Opvarmning ved 60-70 ° C med lejlighedsvis omrystning indtil PFA er opløst. Spin ned tilbageværende partikler og genvinde 20% PFA supernatant. Gør frisk hver gang.
3. Fremstille fiksering opløsning indeholdende 1x fix puffer og 4% PFA.
4. Bedøve fisk i 0,17 mg / ml tricaine.
5. Brug af indfaldende lys under et dissektionsmikroskop plukke dorsale skalaer ved hjælp af skarpe spids pincet, pas på ikke at beskadige melanocyt-holdige halvdelen af skalaen (figur 3A). Sted skalaer direkte fra tangen i 1 ml fiksering opløsning og inkuber ved stuetemperatur, mens drejning, i ≥ 2 timer. Overfør fisken i fisk vand og overvåge fiskene at bekræfte vellykket genopretning.
6. At blege pigmenterede melanocytter vaskes faste skalaer i PBST (1 x PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100) to gange i 5 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 1 ml frisk gjort blegeopløsning indeholdende 0,4 ml 10% KOH og 0,15 ml 30% H ₂ O ₂ i 5 ml med dH ₂ O. Sæt på parafilm eller kasket låse for at forhindre gas i at sprænge rørene åbne. Fortsæt blegning indtil pigmentet er væk (10 min er typisk) (figur 3B, C). Vask i PBST fire gange i 5 minutter ved stuetemperaturerature.
7. Blok i mindst 30 minutter i blok opløsning bestående af 1 x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, _0,02% NaN3 og 2% lammeserum. Udelade NaN _3, hvis udvikling med HRP reaktion.
8. Inkuber med primært antistof i blokopløsning natten over ved stuetemperatur. De skal have mindst 400 pi opløsning over prøverne for at holde dem neddykket.
9. Vask skalaerne 3 gange i 30 minutter i PBST ved stuetemperatur.
10. Inkuber med sekundært antistof fra 2 timer til natten over i blok opløsning ved stuetemperatur.
11. Stain i 10 minutter med PBST + 0,1 uM DAPI.
12. Vask 3 gange i 5 minutter med PBST.
13. Monter vægten på en glasplade i en dråbe Vectashield så den konkave side af skalaerne vender ned mod objektglasset og læg et dækglas over dem. Forsegl kanterne af objektglasset med klar neglelak og observere de dias under et fluorescensmikroskop (figur 3D, E, F, G

4. Transplantation Assay

1. Forbered modtager 2-3 måneders gammel casper ⁹ fisk ved bestråling med 25 Gy gammastråling en dag før transplantation ^10. Lad fisken til at inddrive i fisk vand.
2. Aflive en tumor-bærende fisk som tidligere beskrevet (afsnit 2,2).
3. Skær tumor og sætte det i en petriskål med cirka 5 ml filtersteriliseret 0,9 x PBS med 5% FBS. Tern tumoren med en barberkniv, mens i opløsning.
4. Arbejder ved stuetemperatur, med en P1000 pipette for at få enkeltceller tritureres. Der fyldes op til 25 ml med filtersteriliseret 0,9 x PBS med 5% FBS.
5. Filtreres gennem 40 uM mesh filter.
6. Spin i en Eppendorf 5810R bordcentrifuge ved 1.500 rpm (453 rcf) for 10 min.
7. Supernatanten fjernes, og gør cellesuspension til ca ønskede koncentration (antager 10 ⁷ celler for en 100 mm ³ tumor).
8. Beregn tHan nøjagtige celletal anvendelse af et hæmocytometer og fortyndes cellesuspensionen således at den endelige injektionsvolumen er ca 5 pi. For eksempel, hvis 50.000 celler skal injiceres, bør cellesuspensionen fortyndes til en slutkoncentration på 10.000 celler / ul. Stil rør indeholdende cellesuspensionen hvert par min at forhindre klumpning af cellerne.
9. Vask en 26s gauge (bevel tip) 701 N 10 pi Hamilton-sprøjte 2-3 gange med 100% ethanol og 0,9 x PBS. Indlæse sprøjten med 5 pi af cellesuspensionen.
10. Bedøve bestrålede modtager fisk i 0,17 mg / ml tricaine. Sted fisk på siden på en fugtig Kimwipe (figur 4A).
11. Stabiliser fisken med en hånd og indsætter nålen med den skrå kant opad i en vinkel på 45 ° i flanken af ​​fisken over det peritoneale hulrum omkring halvvejs mellem den bageste grænse af baghjerne og forreste kant af rygfinnen. Forsigtigt trykkes stemplet (figur 4B). </ Li>
12. Lad fisken til at inddrive i frisk fisk vand og observere fiskene dagligt for tumor engraftment (figur 4C). Hvis engraftment har fundet sted, kan fortsat vækst og udvikling af sygdom også overholdes.

Representative Results

Én-celle Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf), mitfa (lf) zebrafisk embryoner injiceret med miniCoopR vektor indeholdende melanom onkogen SETDB1 5 eller EGFP, hver især er under kontrol af mitfa promotoren. Embryoner med melanocyt redning blev udvalgt og fik lov til at modnes. Ved 2 måneders alderen dyr med melanocyt redning større end 4 mm ² blev udvalgt. Dyrene blev screenet ugentligt for melanomer. Tumorforekomst kurverne for de voksne viste, at SETDB1 onkogen fremskyndes betydeligt melanom onsetas sammenlignet med EGFP kontrol (figur 1). Dyr, der udviklede tumorer mellem den bageste grænse af baghjerne, og den forreste kant af rygfinnen (figur 2A) blev isoleret. To uger efter melanoma indtræden de blev fikseret i 4% paraformaldehyd, snittet og farvet med hematoxylin og eosin for at vurdere melanom invasion ind ununderliggende væv. Melanomer udtrykke SETDB1 var mere lokalt invasive end EGFP kontrol melanomer (figur 2C). For at undersøge for ekspression af et kandidatgen, blev dorsale skalaer plukket fra en vildtype-zebrafisk og farvet med en 1:100 fortynding af et primært antistof, der genkender Mitfa transkriptionsfaktor efterfulgt af en 1:1000 fortynding af FITC-gede-anti -kanin-IgG-antistof (figur 3). At vurdere transplantability af tumoren, blev melanomceller isoleret fra en Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf), mitfa (lf) fisk injiceret med miniCoopR-EGFP. 50.000 celler blev subkutant injiceret i en recipient casper mutant, der var blevet bestrålet dagen før med 25 Gy. Ved 2 uger gamle, blev pigmenteret donor-afledte celler let genkendes (fig. 4).

o: src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
Fig. 1. Screening for melanom onset modifikatorer hjælp af miniCoopR assay. A) Skematisk af miniCoopR assayet. Foster med reddede melanocytter (pilespids) indeholdende miniCoopR vektor og genet af interesse. Scale bar = 250 uM. Voksen med mere end 4 mm ² melanocyt redning (pilespids). Scale bar = 500 uM B) MiniCoopR-EGFP reddet zebrafisk med en amelanotiske og et pigmenteret tumor (pilespidser). C) Repræsentant melanom overlevelse kurve sammenligner tumorer, der udtrykker onkogen SETDB1 og et kontrol-EGFP-genet (p = 9,4 × 10 ^-7, logrank χ ^2). Klik her for at se større figur .

2.jpg "/>
Figur 2. Tumor invasion assay. A) MiniCoopR-reddede zebrafisk med en dorsal tumor (pilespids) mellem den bageste grænse af baghjerne, og den forreste kant af rygfinnen. B) tværsnit viser stratum compactum (SC), skalaer, skala-associeret melanocyt (SAM) (indsat, skala bar = 50 uM), muskel (M) og rygsøjlen (SPC). Scale bar = 200 uM. C) tværsnit viser en ikke-invasiv miniCoopR-EGFP tumor (T) (venstre) og en miniCoopR-SETDB1 tumor (til højre), der har invaderet gennem stratum compactuminto musklen (M) og rygsøjlen. Scale bar = 200 uM.

Figur 3. Antistoffarvning af skala melanocytter. A) Scales bliver plukket fra en bedøvet miniCoopR-EGFP zebrafisk. B) Ubleget skala med pigmenterede melanocytter og C) bleget sCale fra miniCoopR-EGFP zebrafisk. Scale bar = 100 uM. Ubleget skala farvet med et D) Mitfa antistof og E) DAPI. Bleget skala farvet med et F) Mitfa antistof og G) DAPI. Scale bar = 40 uM.

Figur 4. Transplantation af melanomceller. A) uinjicerede casper zebrafisk. Scale bar = 500 uM. B) Subkutan transplantation site (pilespids) på en bestrålet Casper modtageren umiddelbart efter injektion med 50.000 melanomceller. Scale bar = 200 uM. C) Bestrålede Casper modtageren viser tumor engraftment (pilespids) to uger efter injektion med 50.000 melanomceller.

Discussion

The miniCoopR Fremgangsmåden muliggør ekspression af gener af interesse i zebrafisk melanocytter. Denne fremgangsmåde drager fordel af det faktum, at zebrafisk mitfa genet virker celle-uafhængigt. Af denne grund er melanocytter reddes af miniCoopR vektoren sikkert at indeholde minigenet og helst gen af ​​interesse, som det er fysisk koblet. Reddede melanocytter er klart synlige og kan fås i dyr der blev injiceret som en enkelt-celle embryoer. En specificeret grad af kimærisme er valgt, og dyr, overgår dette cutoff kan scores for tumor indtræden eller andre egenskaber. En stor fordel ved den miniCoopR fremgangsmåde er, at dyrene med tilstrækkelig kimærisme kan let identificeres og scoret uden at opnå stabile transgene linier, der svarer til hvert gen af ​​testede interesse. Tid, arbejde og omkostninger gemmes i forhold til antallet af gener af interesse, der skal undersøges.

Som rapporteret tidligere ⁵

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gateway recombination reagents	Invitrogen
miniCoopR			Reference5
Mitfa antibody			Reference5
FITC goat anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper Zebrafish			Reference9
701N 10 μl Syringe	Hamilton/Fisher	14-824
40 μM filter	BD Falcon/Fisher	352340
FBS	Invitrogen	26140079