Summary
Ett snabbt sätt att screena för melanom modifierare med en zebrafisk autoktona tumörmodell presenteras. Det drar fördel av miniCoopR vektor som tillåter uttryck av gener kandidat melanom i melanocyterna. En metod för att få melanom överlevnad kurvor, en invasion assay, ett protokoll för antikroppar färgning av skala melanocyter och en melanom transplantation analys beskrivs.
Abstract
Genomiska studier av cancer hos människa har gett en mängd information om gener som är förändrade i tumörer 1,2,3. En utmaning som härrör från dessa studier är att många gener förändras, och det kan vara svårt att skilja genetiska förändringar som drev tumörgenes från att de uppstod för övrigt under förändring. Att dra denna distinktion är det fördelaktigt att ha en analys som kvantitativt kan mäta effekten av en förändrad gen på tumörinitiering och andra processer som möjliggör tumörer att kvarstå och sprida. Här presenterar vi en snabb sätt att screena ett stort antal modifierare kandidat melanom i zebrafisk med ett autoktont 4 tumör modell som omfattar steg som krävs för melanom initiering och underhåll. En viktig reagens i denna analys är miniCoopR vektorn, som kopplar en vild-typ kopia av mitfa melanocyt specifikationen faktor till en gateway rekombination kassett i vilken kandidat melAnoma gener kan rekombineras 5. Den miniCoopR vektorn har en mitfa rädda minigen som innehåller promotorn, öppna läsramen och 3'-otranslaterade regionen av vildtyp mitfa genen. Det ger oss möjlighet att göra konstruktioner som använder full längd öppna läsramar av modifierare kandidat melanom. Dessa enskilda kloner kan sedan injiceras i en enda cell Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) zebrafisk embryon. Den miniCoopR vektorn blir integrerat med Tol2-medierad transgenes 6 och räddar melanocyter. Eftersom de är fysiskt kopplade till mitfa rädda minigenen, är kandidatgener uttrycks i melanocyter räddade, av vilka vissa kommer att förvandla och utvecklas till tumörer. Effekten av en kandidat gen på melanom initiering och melanom cellegenskaper kan mätas med hjälp melanom överlevnad kurvor, analyser invasion, antikroppar färgning och analyser transplantation.
Protocol
1. Screening för Modifieringar Melanom Onset
- Skapa Gateway-kloner mitten inträde med PCR förstärka fullängds öppna läsramen av gener av intresse (GOI) och rekombination in pDONR 221 med BP CLONASE II (Invitrogen). Använd flera platser Gateway teknik (Invitrogen) till rekombinera p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 och miniCoopR 5 för att placera gener av intresse under mitfa promotorn i miniCoopR vektorn (Figur 1A).
- Injicera 25 pikogram av varje klon tillsammans med 25 pikogram Tol2 transposas mRNA till en cell Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) triply homozygota embryon zebrafisk som tidigare beskrivits 7. Inkubera de injicerade embryona vid 28,5 ° C. Ta bort eventuella döda embryon vid 24 HPF.
- Välj transgena djur med räddade melanocyter vid 72 HPF genom att placera petriskål innehållande injicerade embryon på en dissekera microscope under infallande ljus mot en vit bakgrund (Figur 1A).
- Överför djur 3 L tankar i barnkammaren för zebrafisk anläggningen i 4 dpf som tidigare beskrivits 8.
- Vid 2 månader, välj djuren med minst ett område av melanocyt räddning större än 4 mm 2 (Figur 1A). Det finns ett starkt samband mellan graden av melanocyt räddning vid 72 HPF och graden av melanocyt räddning vid 2 månader. När embryon med melanocyt räddning plockas vid 72 HPF, kommer majoriteten av dem (~ 80%) har minst ett område av melanocyt räddning större än 4 mm 2 vid 2 månader.
- Skärm de utvalda djuren varje vecka med avseende på närvaron av tumörer (Figur 1B). Det finns ett starkt samband mellan histopatologiska och morfologiska förändringar. Övergång från godartad till elakartad redovisas som en morfologisk förändring när lesioner blir upp från ytan av djuret. Isolera tumörbärande animaÄr för studien.
- Rita melanom överlevnad kurvor med åldern i veckor på abskissan och procent melanom överlevnad på ordinatan. Djur med melanocyter som uttrycker en gen av intresse jämförs för att kontrollera djur som uttrycker EGFP (förstärkt grönt fluorescerande protein) i melanocyterna (figur 1C). Medianvärdet tumör debut för djur injicerade med miniCoopR-EGFP är ca 18 veckor. Ta reda på om de två kurvorna är statistiskt olika med en log rank-test.
2. Tumörinvasion analys
- Välj isolerat zebrafisk som utvecklar tumörer dorsalt, i ett område mellan den bakre gränsen för bakhjäman och främre kanten av ryggfenan (figur 2A).
- Två veckor efter melanom debut avliva fisken enligt riktlinjer som anges i American Veterinary Medical Association panelen för dödshjälp och godkänts av University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Specifikt är en fisk placeras i en skål med 0,6 mg / ml tricaine tills gäl rörelse stannar.
- Göra ett snitt i bukhålan av fisken med en skalpell och sedan placera fisken i 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 ° C för fixering.
- Behandla med 0,5 M EDTA natten vid 4 ° C för att avkalka.
- Fix med formalin i kassetten natten, dehydrera under 1 h, klara med xylen 3 gånger under 1 timme och behandla sedan med paraffin 2 gånger för 2 timmar vardera vid 60 ° C.
- Bädda in vävnaden i paraffin i en form och låta den stelna under 30 minuter till 1 timme.
- Gör 5 pm sektioner, en var 50 pm. Avsnitten ska vara tvärgående och genom hela lesionen så att den punkt djupaste invasion kan identifieras. Följ med hematoxylin och eosin-färgning.
- Bedöma tumörinvasion genom att mäta huruvida tumörceller står utanför kollagena stratum compactum, invaderar in i dorsalamuskulatur eller invadera vidare in i ryggraden (figur 2B, C). Bestämma statistisk skillnad mellan de två uppsättningarna av prover.
3. Antikropp Färgning av Scale Melanocyter
- Fyll upp PO4 buffert med 80 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 och 20 ml 0,1 M NaH 2 PO 4. Kontrollera pH är 7,3. Make up 2x fix buffert innehållande 8,0 g sackaros, 0,15 ml 0,2 M CaClj 2 och 90 ml 0,2 M PO 4-buffert, pH 7,3. Om nödvändigt justera pH till 7,3 med NaOH eller HCl sedan göra upp till 100 ml med PO 4 buffert.
- Väg upp till 300 mg fast substans PFA och lägga till ett mikrocentrifugrör. Lägg 5 mM NaOH till en volym lika med 4,5 x massa, i mg, av PFA (t ex 450 | il 5 mM NaOH till 100 mg PFA). Värm vid 60-70 ° C med tillfällig skakning tills PFA är upplöst. Centrifugera ner återstående partiklar och återvinna 20% PFA supematant. Göra färskt varje gång.
- Bered fixeringslösning innehållande 1x fix buffert och 4% PFA.
- Söva fisken i 0,17 mg / ml tricaine.
- Använda infallande ljus under ett dissektionsmikroskop plocka dorsala skalor med skarpa spetsig tång, noga med att inte skada melanocytstimulerande innehåller hälften av skalan (Figur 3A). Placera skalor direkt från tången i 1 ml fixeringslösning och inkubera vid rumstemperatur, medan svarvning, för ≥ 2 timmar. Överför fisken i fisk vatten och övervaka fisken att bekräfta framgångsrik återhämtning.
- Att bleka pigmenterade melanocyter tvätta fasta skalor i PBST (1 x PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 gånger under 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 1 ml nyligen gjorde blekmedel innehållande 0,4 ml 10% KOH och 0,15 ml 30% H 2 O 2 i 5 ml med dH 2 O. Sätt på parafilm eller mössa lås för att förhindra gas från brister rören öppna. Fortsätt blekning tills pigmentet är borta (10 min är typiskt) (Figur 3B, C). Tvätta i PBST fyra gånger under 5 min vid rumstemperaturratur.
- Block för minst 30 minuter i block lösning bestående av 1 x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaNs 3 och 2% lammserum. Utelämna NaN 3 om att utveckla med HRP reaktion.
- Inkubera med primär antikropp i block lösning över natten vid rumstemperatur. Du måste ha minst 400 ul lösning under proven för att hålla dem under vatten.
- Tvätta skalorna 3 gånger under 30 min i PBST vid rumstemperatur.
- Inkubera med sekundär antikropp från 2 h till över natten i block lösning vid rumstemperatur.
- Stain i 10 min med PBST + 0,1 | iM DAPI.
- Tvätta 3 gånger under 5 min med PBST.
- Montera vågen på en glasskiva i en droppe vectashield så att den konkava sidan av vågen vänd ner mot bilden och placera en slip glaslock över dem. Täta kanterna på bilden med genomskinligt nagellack och observera bilderna under ett fluorescensmikroskop (Figur 3D, E, F, G
4. Transplantation analys
- Förbered mottagare 2-3 månader gammal casper 9 fisk genom bestrålning med 25 Gy gammastrålning en dag före transplantation 10. Låt fisken att återhämta sig fisk vatten.
- Avliva en tumörbärande fisk som tidigare beskrivits (avsnitt 2,2).
- Skär av tumören och placera den i en petriskål med ca 5 ml filtersteriliserad 0.9x PBS med 5% FBS. Tärna tumören med ett rakblad medan lösning.
- Arbetar vid rumstemperatur, triturera med en P1000 pipett för att få enskilda celler. Fyll upp volymen till 25 ml med filtersteriliserad 0.9x PBS med 5% FBS.
- Filtrera genom 40 pM nätfilter.
- Snurra i en Eppendorf 5810R bordscentrifug vid 1.500 varv per minut (453 RCF) för 10 minuter.
- Avlägsna supernatanten och göra cellsuspension till ungefär önskad koncentration (anta 10 7 celler för en 100 mm 3 tumör).
- Beräkna than exakt cellantal användning av en hemocytometer och späd cellsuspensionen så att den slutliga injektionsvolym är cirka 5 pl. Till exempel, om 50.000 celler skall injiceras, bör cellsuspensionen spädas till en slutlig koncentration av 10.000 celler / | il. Snärta röret innehållande cellsuspensionen varje några minuter för att förhindra klumpning av cellerna.
- Tvätta en 26S mätare (koniska spets) 701 N 10 il Hamilton-spruta 2-3 gånger med 100% etanol och 0.9x PBS. Fyll sprutan med 5 pl av cellsuspensionen.
- Söva den bestrålade mottagande fisk i 0,17 mg / ml tricaine. Placera fisk på dess sida på en fuktig Kimwipe (figur 4A).
- Stabilisera fisken med ena handen och stick in nålen med den nedåtlutande uppåt i 45 ° vinkel i sidan på fisken ovanför bukhålan ungefär halvvägs mellan den bakre gräns bakhjäman och främre gräns ryggfenan. Försiktigt pressa kolven (figur 4B). </ Li>
- Låt fisken återhämta sig i färsk fisk vatten och observera fisk dagligen för tumör engraftment (Figur 4C). Om engraftment har skett, kan fortsatt tillväxt och sjukdomsutvecklingen också observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En-cell-Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) zebrafisk embryon injicerades med miniCoopR vektorn innehållande melanom onkogenen SETDB1 5 eller EGFP, vardera under kontroll av promotorn mitfa. Embryon med melanocyt räddning valdes och fick mogna. Vid 2 månaders ålder djur med melanocyt räddning större än 4 mm 2 valdes. Djuren screenades veckovis för melanom. Tumörincidens kurvor för vuxna visade att SETDB1 onkogenen signifikant accelererade melanom onsetas jämfört med EGFP kontrollen (figur 1). Djur som utvecklade tumörer mellan den bakre gräns bakhjäman och den främre kanten av ryggfenan (figur 2A) isolerades. Två veckor efter melanom debut de fixerades i 4% paraformaldehyd, snittades och färgades med hematoxylin och eosin för att bedöma melanom invasion i ununderliggande vävnader. Melanom uttrycker SETDB1 var mer lokalt invasiv än EGFP kontroll melanom (figur 2C). För att leta efter uttryck av en kandidatgen, var dorsala skalor plockade från en vild-typ zebrafisk och färgades med användning av en 1:100 spädning av en primär antikropp som känner igen Mitfa transkriptionsfaktor följt av en 1:1000 utspädning av FITC get anti -kanin-IgG-antikropp (figur 3). För att bedöma transplantability av tumören, var melanomceller isolerades från ett Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) fisk som injicerats med miniCoopR-EGFP. 50.000 celler injicerades subkutant i en mottagande casper mutant som hade bestrålats dagen innan med 25 Gy. Genom 2 veckor gamla, har pigmenterade donator-härledda celler lätt igen (Figur 4).
o: src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
Figur 1. Screening för modifierare melanom debut med hjälp av miniCoopR analysen. A) Schematisk av miniCoopR analysen. Embryo med räddade melanocyter (pilhuvud) innehållande miniCoopR vektorn och genen av intresse. Skala bar = 250 pM. Vuxen med större än 4 mm 2 melanocyt räddning (pilspets). Skala bar = 500 pM B) MiniCoopR-EGFP räddade zebrafisk med en amelanotiska och en pigmenterad tumör (pilspetsar). C) Representant melanom överlevnad kurva jämföra tumörer som uttrycker onkogen SETDB1 och en kontroll EGFP gen (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Klicka här för att se större bild .
2.jpg "/>
Figur 2. Tumörinvasion analys. A) MiniCoopR-räddade zebrafisk med dorsal tumör (pilspets) mellan den bakre gräns bakhjäman och den främre kanten av ryggfenan. B) tvärsnitt visar stratum compactum (SC), skalor, skala-associerad melanocyt (SAM) (infälld, skala bar = 50 M), muskel (M) och ryggraden (SPC). Skala bar = 200 M. C) tvärgående sektioner som visar en icke-invasiv miniCoopR-EGFP tumör (T) (vänster) och en miniCoopR-SETDB1 tumör (höger) som har invaderat genom stratum compactuminto muskeln (M) och ryggraden. Skala bar = 200 M.
Figur 3. Antikropp färgning av skala melanocyter. A) Vågar som plockats från en sövd miniCoopR-EGFP zebrafisk. B) Oblekt skala med pigmenterade melanocyter och C) blekt sCale från miniCoopR-EGFP zebrafisk. Skala bar = 100 M. Oblekt skala färgas med ett D) Mitfa antikropp och E) DAPI. Blekt skala färgades med ett F) Mitfa antikropp och G) DAPI. Skala bar = 40 pm.
Figur 4. Transplantation av melanomceller. A) icke injicerade Casper zebrafisk. Skala bar = 500 M. B) Subkutan transplantation webbplats (pilspets) på en bestrålad casper mottagare omedelbart efter injektion med 50.000 melanomceller. Skala bar = 200 M. C) Bestrålad casper mottagare visar tumör inympning (pilspets) två veckor efter injektion med 50.000 melanomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den miniCoopR Metoden möjliggör uttryck av gener av intresse i zebrafisk melanocyter. Detta tillvägagångssätt drar fördel av det faktum att zebrafisk mitfa genen fungerar cell-autonomt. Av denna anledning, melanocyter räddas av miniCoopR vektorn är säker på att innehålla minigenen och varje gen av intresse till vilken den är fysiskt kopplad. Räddade melanocyter är klart synliga och kan erhållas i djur som injicerades som encelliga embryon. En specificerad grad av chimerism väljs och djur överträffar denna cutoff kan görs för tumör debut eller andra egenskaper. En stor fördel med miniCoopR metoden är att djur med tillräckligt chimerism lätt kan identifieras och gjorde utan att erhålla stabila transgena linjer motsvarande varje gen testade intresse. Tid, ansträngningar och kostnader sparas i proportion till antalet gener av intresse som skall undersökas.
Som tidigare rapporterats 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Leonard I. Zon i vars laboratorium dessa tekniker ursprungligen utvecklades, Kristen Kwan och den sena Chi-Bin Chien för gåvor av plasmider som används i detta arbete, James Lister och David Raible för hjälp med antikroppar färgning, och James Neiswender för mikroinjektion videon. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R00AR056899-03 till CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
