Summary
ゼブラフィッシュ土着腫瘍モデルを用いてメラノーマ修飾するための画面への迅速な方法が提示される。これは、メラノサイト内の候補メラノーマの遺伝子の発現を可能にminiCoopRベクトルを利用しています。メラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイ、スケールメラノサイトおよびメラノーマ移植アッセイの抗体染色のためのプロトコルを取得するための方法が記載されている。
Abstract
ヒト癌のゲノム研究は、腫瘍1,2,3で変更されている遺伝子に関する豊富な情報が得られている。これらの研究から生じる課題は、多くの遺伝子が改変されていることであり、それは、変換時に偶然に生じたものから、腫瘍形成を運転した遺伝的変化を区別するのが困難な場合があります。この区別を描画するには、それを定量的に腫瘍の開始と腫瘍が持続し、普及することができ、他のプロセスで変更された遺伝子の効果を測定できるアッセイを有することが有益である。ここでは、黒色腫の開始と維持のために必要なステップを包含土着腫瘍モデル4を用いてゼブラフィッシュにおける候補メラノーマモディファイ多数を上映するために迅速な手段を提示する。このアッセイにおけるキー試薬がminiCoopRベクトルであり、その中に候補メルGateway組換えカセットに結合mitfaメラノサイト仕様因子の野生型コピーをanoma遺伝子は5を再結合することができる。 miniCoopRベクターは、プロモーター、オープンリーディングフレームと野生型mitfa遺伝子の 3'-非翻訳領域を含むmitfaの救出ミニ遺伝子を持っています。それは私たちが候補メラノーマ修飾子の完全長のオープンリーディングフレームを使用して構造体を作ることができます。 P53（LF）;; mitfa（LF）ゼブラフィッシュの胚：これらの個々のクローンは、単一セルのTg（BRAF V600E mitfa）に注入することができる。 miniCoopRベクトルは Tol2媒介形質転換6によって統合取得し、メラノサイトを救う。それらは物理的にmitfa救出ミニ遺伝子に結合されているので、候補遺伝子が変革し、腫瘍に発展するそのうちのいくつか救出メラノサイト、で表されます。メラノーマ開始とメラノーマ細胞特性に関する候補遺伝子の効果はメラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイは、抗体染色および移植アッセイを用いて測定することができる。
Protocol
1。メラノーマ発症の修飾のためのスクリーニング
- PCRは、目的の遺伝子の完全長のオープンリーディングフレーム（GOI）を増幅し、BPクロナーゼII（Invitrogen）を用いてpDONR 221に再結合によりゲートウェイ中間エントリークローンを作成します。 miniCoopRベクター（ 図1A）にmitfaプロモーター下に目的の遺伝子を配置する再結合p5E_mitfa、pME_GOI、Tol2kit 302位p3E_SV40polyA 6とminiCoopR 5にマルチゲートウェイ技術（Invitrogen）を使用します。
- P53（LF）;; mitfa（LF）は前述したように7三重ホモ接合ゼブラフィッシュ胚：1セルTG（BRAF V600E mitfa）にTol2のトランスポザーゼmRNAは25ピコグラムと一緒に、それぞれのクローンの25ピコグラムを注入します。 28.5で注入した胚をインキュベート℃に24 HPFで任意の死亡胚を取り出します。
- 解剖microscopに注入された胚を含むペトリ皿を置くことによって、72 HPFで救出メラノサイトを有するトランスジェニック動物を選択する白い背景（ 図1A）に対する入射光の下でのe。
- 前述の8として4 DPFにおけるゼブラフィッシュ施設の保育園で3リットルタンクに動物を移します。
- 2ヶ月で、4ミリメートル2（ 図1A）を超えるメラノサイト救助の少なくとも1つの領域を持つ動物を選択します。 72 HPFにおけるメラノサイト救助の程度、2ヵ月後のメラニン細胞救助の程度との間には強い相関関係がある。メラノサイト救助した胚を72 HPFで拾われた場合、それらの大半（約80％）が2ヶ月で4ミリメートル2より大きいメラノサイト救助の少なくとも1つの領域を持つことになります。
- 画面腫瘍の存在（ 図1B）のための週刊選択された動物。組織病理学的および形態学的変化との間には強い相関関係があります。良性から悪性への遷移は、病変が動物の表面から浮き上がるとなる形態変化として認識されています。担癌アニマを隔離研究については、ls。
- 縦軸横軸とパーセント黒色腫、無増悪生存期間に週齢でメラノーマフリー生存曲線を描きます。目的とする遺伝子を発現メラノサイトを持つ動物は、対照動物と比較されるメラノサイトにおける急行EGFP（緑色蛍光タンパク質）（ 図1C）。 miniCoopR-EGFPを注射した動物のための平均腫瘍の発症は約18週間です。 2つの曲線は、ログランク検定を用いて統計的に異なっているかどうかを決定します。
2。腫瘍浸潤アッセイ
- 背びれ（ 図2A）の後脳と前縁の後方境界との間の領域では、背側に腫瘍を発症孤立ゼブラフィッシュを選択します。
- 黒色腫の発症は、マサチューセッツ大学医学部アドインの大学によって安楽死でアメリカ獣医学協会のパネルで指定し、承認されたガイドラインに従って魚を安楽死二週間後titutional動物管理使用委員会（IACUC）。鰓の動きが止まるまで、具体的には、魚は0.6 mg / mlのtricaineと皿に置かれます。
- メスで魚の腹腔内に切開を加えてから、固定のために4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドで魚（PFA）を配置します。
- 4℃で一晩、0.5M EDTAを用いて治療℃で石灰を除去するために。
- 一晩、60℃で2時間ごとに2回℃で1時間、キシレンで3回クリアで1時間脱水し、パラフィンで治療カセット内のホルマリンで固定
- 金型内にパラフィンの組織を埋め込むと、それが30分〜1時間凝固させる。
- 5μmの切片、1毎に50μmを作る。のセクションでは、最も深い侵略のポイントを識別することができるように、横方向および病変全体を通してでなければなりません。ヘマトキシリン·エオシン染色により、次のとおりです。
- 腫瘍細胞はコラーゲン層緻密外に残っているかどうかを測定することにより、腫瘍の浸潤を評価する、背側に侵入筋肉や脊柱（ 図2B、C）にさらに侵入する。サンプルの2つのセット間の統計的な差を決定します。
3。スケールメラノサイトの抗体染色
- 80ミリリットルの0.1M Na 2 HPO 4および20ミリリットル0.1MのNaH 2 PO 4でPO4バッファを構成しています。 pHが7.3であることを確認します。 8.0グラムのスクロース、0.15ミリリットル0.2M CaCl 2及び90ミリリットル0.2M PO 4緩衝液、pH 7.3を含む2倍修正バッファを構成しています。必要がNaOHまたはHClで7.3にpHを調整する場合は、PO 4緩衝液で100mlにする。
- 300mgの固体PFAまで重量を量るとマイクロ遠心チューブに追加します。 PFAの4.5 x質量、mgで、（ 例えば、450 ulの5 mMのNaOHを100 mgのPFAに）に等しい容積に5mMのNaOHを追加します。 60から70℃の熱でPFAが溶解するまで揺れ、時折持つ。残りの微粒子をスピンダウンし、20％のPFA、上清を回収。毎回新鮮なことを確認します。
- 1X fiを含む固定液を準備xのバッファと4％PFA。
- 0.17 mg / mlのtricaineで魚を麻酔。
- スケールのメラニン含有半分（ 図3A）を損傷しないように注意しながら、シャープな先の細いピンセットを用いて背側のスケールを摘み取る解剖顕微鏡下で、入射光を用いた。場所の鱗直接鉗子から室温で1 mlの固定液とインキュベートに、≥2時間、回転させながら。魚の水に魚を移し、正常な回復を確認するために魚を監視します。
- 漂白剤着色されたメラノサイトは、室温で5分間PBST（1×PBSのpH 7.4、0.1％Triton X-100）を2回に固定されたスケールを洗浄する。のdH 2 Oで5 mlに0.4ミリリットル10％KOHと0.15ミリリットルの30％H 2 O 2を含む1 ml加え作りたて漂白溶液管が開いて破裂からガスを防ぐためにパラフィルムやキャップロックをかけた。顔料は（ 図3B、C）（10分が一般的です）なくなるまで漂白続ける。室温で5分間PBSTで4回洗浄するerature。
- 1X PBS pHは7.4、0.2％トリトンX-100、2 mg / mlのBSA、1％DMSO、0.02％NaN 3を 、2％子羊血清で構成されたブロック溶液中で少なくとも30分間ブロック。 HRP反応を使った開発がNaN 3を残す。
- 室温で一晩ブロック溶液中で一次抗体とインキュベートします。あなたは彼らが水没維持する以上のサンプル溶液の少なくとも400μlを持っている必要があります。
- スケールを室温でPBST中で30分間、3回洗浄する。
- 2時間から室温でブロック溶液中で一晩に二次抗体とインキュベートします。
- PBST +0.1μMのDAPIで10分間染色する。
- PBSTで5分間3回洗浄する。
- スケールの凹面側がスライドに向かって下向きになるようvectashieldのドロップでスライドガラス上にスケールを取り付け、その上にガラスカバースリップを置く。明確なマニキュアでスライドの端をシールし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察する（ 図3D、E、F、G
4。移植アッセイ
- 移植10以前のガンマ線照射25 Gyの1日を照射することにより、受信者2から3ヶ月のキャスパー 9魚を準備します。魚は魚の水で回復することができます。
- 前述のように、担癌魚（セクション2.2）を安楽死させる。
- 腫瘍を切り取り、5％FBSを含むPBSで滅菌0.9x約5mlのフィルターを用いてペトリ皿に入れてください。溶液中でしばらくカミソリで腫瘍をサイコロ。
- 室温で働いて、単一細胞を得るためにP1000ピペットでひいて粉にする。 5％のFBSを持つフィルター滅菌0.9x PBSで25mlにボリュームを構成しています。
- 40μMのメッシュフィルターでろ過。
- 10分間1,500回転（453 RCF）でエッペンドルフ5810R卓上遠心機でスピン。
- 上清を除去し、およそ所望の濃度（100ミリメートル3腫瘍のため10 7個の細胞を想定しています）に細胞懸濁液を作る。
- tを算出彼の正確な細胞数を血球計数器を用いて、最終的な注入量は約5μLになるように細胞懸濁液を希釈します。 50,000個の細胞を注入することになっている場合は、細胞懸濁液を10,000細胞/μlの最終濃度に希釈する必要があります。細胞の凝集を防ぐために細胞懸濁液の入ったチューブごとに数分をはじく。
- 100％エタノールと0.9x PBSで26Sゲージ（ベベルチップ）701 N10μlのハミルトンシリンジを2〜3回洗ってください。細胞懸濁液の5μlでシリンジをロードします。
- 0.17 mg / mlのtricaineの照射レシピエント魚を麻酔。湿らせたキムワイプでその側の上に置いて魚（ 図4A）。
- 片手で魚を安定させ、約半分の菱脳や背びれの前縁の後方境界との間の腹膜腔上記の魚の脇腹に45°の角度で上向きにベベルに針を挿入します。ゆっくりプランジャー（ 図4B）を踏み込みます。</ LI>
- 魚は新鮮な魚を水に回復し、腫瘍移植（ 図4C）のために毎日魚を観察することができる。生着が発生した場合は、継続的な成長と病気の発症も観察することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ワンセルTG（mitfa：BRAF V600E）、P53（LF）; mitfa（LF）ゼブラフィッシュの胚はメラノーマ癌遺伝子mitfaプロモーターの制御下SETDB1 5またはEGFP、それぞれを含むminiCoopRベクターを注入した。メラニン細胞救助を伴う胚を選択して成熟させた。 4ミリメートル2より大きいメラニン細胞救助を伴う年齢動物の2ヶ月の時点で選択した。動物は、黒色腫のための週刊スクリーニングした。大人のための腫瘍発生率曲線はSETDB1オンコ大幅に加速されたメラノーマonsetasがEGFP制御 （ 図1）と比較することを示した。後脳の後方境界と背びれ（ 図2A）の前縁の間に腫瘍が発生した動物は、単離された。二週間メラノーマ発症した後に、ヘマトキシリンとエオシンで切片とステンドが国連に黒色腫の浸潤を評価するために、4％パラホルムアルデヒドで固定した組織をderlying。 SETDB1を表現する黒色腫は、EGFP制御黒色腫（ 図2C）より局所浸潤であった。候補遺伝子の発現を探すために、背側鱗がFITCヤギ抗1:1,000希釈続いMitfa転写因子を認識する一次抗体の1:100希釈液を用いて、野生型ゼブラフィッシュやステンドから摘み取られた-ウサギIgG抗体（ 図3）。 miniCoopR-EGFPを注射mitfa（LF）魚; P53（LF）：腫瘍の移植可能性を評価するために、メラノーマ細胞をTg（BRAF V600E mitfa）から分離された。 50,000個の細胞を皮下に25 Gyを前日に照射された受信者casperの変異体に注入した。 2週齢では、着色されたドナー由来細胞は容易に（ 図4）が認められた。
O：SRC = SRC = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" / "を/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg">
図1 miniCoopRアッセイを用いてメラノーマ発症の修飾子のスクリーニング。 miniCoopRアッセイのa）は概略。 miniCoopRベクトルと目的の遺伝子を含む救出メラノサイトを持つ胚（矢頭）。スケールバー=250μmである。 4ミリメートル2メラノサイトレスキュー（矢じり）を超えると成人。スケールバー= 500μMB）はMiniCoopR-EGFPはメラニン欠乏および色素性腫瘍（矢印）とゼブラフィッシュを救助した。 C）の代表メラノーマフリー生存曲線は癌遺伝子SETDB1と制御EGFP遺伝子を発現している腫瘍を比較した（p = 9.4×10 -7、ログランクχ2）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
2.JPG "/>
図2腫瘍浸潤アッセイ。後脳の後方境界と背びれの前縁の間に背の腫瘍（矢印）とA）はMiniCoopR-救出ゼブラフィッシュ。地層緻密（SC）、スケール、スケール、関連するメラノサイト（SAM）（差込み、スケールバー=50μM）、筋肉（M）と脊柱（SPC）を示すB）の横断面。スケールバー=200μmである。 C）は、非侵襲的miniCoopR-EGFPの腫瘍（T）（左）と地層compactuminto筋（M）と脊柱を通って侵入したminiCoopR-SETDB1腫瘍（右）を示す横断面。スケールバー=200μmである。
スケールメラノサイトの図3抗体染色。 A）のスケールは麻酔miniCoopR-EGFPゼブラフィッシュから摘み取られている。色素性メラノサイトとCとB）は無漂白スケール）漂白のminiCoopR-EGFPのゼブラフィッシュからCALE。スケールバー=100μmである。 Dと無漂白スケール染色）Mitfa抗体およびE）DAPI。女で染色晒スケール）Mitfa抗体およびG）DAPI。スケールバー= 40μmである。
図4：黒色腫細胞の移植。 A）はキャスパーゼブラフィッシュをUninjected。スケールバー=500μmである。直ちに5万メラノーマ細胞注射後照射キャスパーの受信には、B）皮下移植部位（矢頭）。スケールバー=200μmである。 C）を照射キャスパーの受信者は、2週間5万メラノーマ細胞を注射した後に腫瘍生着（矢印）を示す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miniCoopRメソッドは、ゼブラフィッシュメラノサイトにおいて、目的の遺伝子の発現を可能にします。このアプローチは、ゼブラフィッシュmitfa遺伝子は細胞自律的役割を果たしているという事実を利用しています。このような理由から、miniCoopRベクトルによって救出メラノサイトは、それが物理的に結合されているミニ遺伝子と関心のある任意の遺伝子を含んでいるために確信しています。救出メラノサイトがはっきりとわかりますし、単一セルの胚として注入された動物で得ることができる。キメラの指定された度合いが選択され、このカットを抜いて動物は腫瘍発症または他の特性のために得点することができます。 miniCoopR方法の主な利点は、十分なキメリズムを持つ動物が容易に識別され、テスト対象のすべての遺伝子に対応する安定したトランスジェニック系統を取得しなくても得点することができることである。時間、労力と費用を調査する目的の遺伝子の数に比例して保存されます。
以前に報告したように5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
クリステン·クワンと後期カイビン本研究で使用したプラスミドの贈答用チェン;、抗体染色の支援のためのジェームズ·リスターとDavid Raible、およびのためのジェイムズNeiswender我々は、その研究室、これらの技術が最初に開発されたもので博士はレナードI.ゾンに感謝マイクロインジェクションビデオ。この作品は、CJCにNIHの助成金R00AR056899-03によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
