Summary
Un modo rapido per lo screening del melanoma modificatori che utilizzano un modello di zebrafish tumore autoctona è presentato. Si avvale del vettore miniCoopR che permette l'espressione di geni candidati melanoma nei melanociti. Un metodo per ottenere melanoma senza curve di sopravvivenza, un saggio di invasione, un protocollo per la colorazione degli anticorpi dei melanociti di scala e di un saggio di trapianto melanoma sono descritti.
Abstract
Studi di genomica dei tumori umani hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui geni che sono alterati nei tumori 1,2,3. Una sfida derivante da questi studi è che molti geni sono alterati, e può essere difficile distinguere alterazioni genetiche che hanno spinto tumorigenesi da coloro che nasce accidentalmente durante la trasformazione. Per questa distinzione è utile avere un saggio che può quantitativamente misurare l'effetto di un gene alterato sull'iniziazione tumore e altri processi che consentono tumori di persistere e diffondere. Qui vi presentiamo un mezzo rapido per lo screening un gran numero di candidati modificatori di melanoma in zebrafish con un autoctono modello 4 tumore che comprende passaggi necessari per l'iniziazione melanoma e la manutenzione. Un reagente chiave in questo saggio è il vettore miniCoopR, che accoppia una wild-type copia del melanociti fattore specifica mitfa ad una cassetta di ricombinazione Gateway in cui candidato melAnoma geni possono essere ricombinati 5. Il vettore ha una miniCoopR minigene salvataggio mitfa che contiene il promotore, di lettura aperta e 3'-non tradotta regione del gene di tipo selvaggio mitfa. Ci permette di fare costrutti con full-length fasi di lettura aperta di modificatori melanoma candidati. Questi cloni singoli possono poi essere iniettato nella cella singola Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); mitfa (lf) embrioni di zebrafish. Il vettore miniCoopR viene integrata da Tol2-mediata transgenesi 6 e salva melanociti. Perché sono fisicamente accoppiati al salvataggio mitfa minigene, geni sono espressi in melanociti recuperati, alcuni dei quali si trasformano e svilupparsi in tumori. L'effetto di un gene candidato per l'inizio del melanoma e delle cellule di melanoma può essere misurato con melanoma senza curve di sopravvivenza, saggi di invasione, colorazione degli anticorpi e saggi di trapianto.
Protocol
1. Screening per Modificatori Onset Melanoma
- Crea Gateway cloni entrata di mezzo con PCR amplificando il full-length open reading frame di geni di interesse (GOI) e ricombinando in pDONR 221 con BP clonase II (Invitrogen). Utilizzare Multisite Gateway tecnologia (Invitrogen) per ricombinare p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 e miniCoopR 5 per spostare geni di interesse sotto il promotore mitfa nel vettore miniCoopR (Figura 1A).
- Iniettare 25 picogrammi di ogni clone insieme con 25 picogrammi Tol2 mRNA trasposasi in una cella-Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); mitfa (lf) embrioni di zebrafish triplamente omozigoti come descritto in precedenza 7. Incubare gli embrioni iniettati a 28,5 ° C. Rimuovere eventuali embrione è morto a 24 HPF.
- Selezionare animali transgenici con melanociti salvati a 72 HPF ponendo la capsula Petri contenente gli embrioni iniettati su una microscop dissezionee sotto la luce incidente su uno sfondo bianco (Figura 1A).
- Di trasferire gli animali a 3 serbatoi L nel vivaio della struttura zebrafish a 4 dpf come descritto in precedenza 8.
- A 2 mesi, selezionare gli animali con almeno una zona di salvataggio melanociti superiore a 4 mm 2 (Figura 1A). Vi è una forte correlazione tra il grado di soccorso melanociti a 72 HPF e il grado di soccorso melanociti a 2 mesi. Quando embrioni con salvataggio melanociti vengono raccolte a 72 HPF, la maggior parte di essi (~ 80%) avranno almeno uno spazio di salvataggio melanociti maggiore di 4 mm 2 a 2 mesi.
- Schermo gli animali selezionati settimanali per la presenza di tumori (Figura 1B). Vi è una forte correlazione tra i cambiamenti istopatologici e morfologiche. Transizione da benigna a maligna è riconosciuto come un cambiamento morfologico quando le lesioni diventano sollevato dalla superficie dell'animale. Isolare anima tumore cuscinettols di studio.
- Disegna melanoma senza curve di sopravvivenza con l'età in settimane in ascissa e la percentuale di sopravvivenza libera melanoma in ordinata. Animali con melanociti che esprimono un gene di interesse sono confrontati agli animali di controllo che esprimono EGFP (enhanced green fluorescent protein) nei melanociti (Figura 1C). L'insorgenza tumorale mediano per animali iniettati con miniCoopR-EGFP è circa 18 settimane. Determinare se le due curve sono statisticamente differenti utilizzando un log rank test.
2. Invasion test Tumore
- Selezionare zebrafish isolato che sviluppano tumori dorsalmente, in una regione compresa tra il confine posteriore del romboencefalo e margine anteriore della pinna dorsale (Figura 2A).
- Due settimane dopo l'insorgenza del melanoma eutanasia il pesce secondo le linee guida indicate dalla American Veterinary Medical Association Panel sull'eutanasia e approvato dalla University of Massachusetts Medical Ins ScuolaCura degli animali e del Comitato titutional uso (IACUC). In particolare, un pesce è posto in un piatto con 0,6 mg / ml fino a quando il movimento tricaine branchia si ferma.
- Praticare un'incisione nella cavità peritoneale del pesce con un bisturi e poi mettere il pesce in 4% paraformaldeide (PFA) per una notte a 4 ° C per il fissaggio.
- Trattare con EDTA 0,5 M per una notte a 4 ° C per decalcificare.
- Fissare con formalina nel cassetto durante la notte, disidratare per 1 ora, chiaro con xilene 3 volte per 1 ora e poi trattare con paraffina 2 volte per 2 ore ciascuna a 60 ° C.
- Incorporare il tessuto in paraffina in uno stampo e farlo solidificare per 30 minuti a 1 ora.
- Fai 5 sezioni micron, una ogni 50 micron. Le sezioni devono essere trasversale e attraverso l'intera lesione in modo che il punto più profondo della invasione può essere identificato. Segui con ematossilina eosina e colorazione.
- Valutare l'invasione del tumore misurando se le cellule tumorali rimangono al di fuori del collagene strato compactum, invadere la dorsalemuscolatura o invadere ulteriormente nella colonna vertebrale (Figura 2B, C). Determinare differenza statistica tra le due serie di campioni.
3. Colorazione anticorpale dei melanociti Scala
- Costituiscono PO4 tampone con 80 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 e 20 ml di 0,1 M NaH 2 PO 4. Verificare che il pH è 7.3. Make up tampone 2x soluzione contenente 8,0 g di saccarosio, 0,15 ml di 0,2 M CaCl 2 e 90 ml di 0,2 M PO 4, pH 7.3. Se necessario regolare il pH a 7,3 con NaOH o HCl poi portare a 100 ml con tampone PO 4.
- Pesare fino a 300 mg di solido PFA e aggiungere in una provetta. Aggiungere 5 mM NaOH ad un volume pari a 4,5 x massa, in mg, di PFA (ad esempio 450 ul 5 mM NaOH a 100 mg PFA). Termico a 60-70 ° C con occasionale agitazione fino a quando il PFA è sciolto. Spin down particelle rimanenti e recuperare il 20% PFA surnatante. Fai fresco ogni volta.
- Preparare la soluzione di fissaggio contenente 1x fix tampone e 4% PFA.
- Anestetizzare il pesce in 0,17 mg / ml tricaine.
- Utilizzo di luce incidente sotto un microscopio da dissezione cogliere squame dorsali con taglienti a punta fine pinze, facendo attenzione a non danneggiare il melanocita contenente la metà della scala (Figura 3A). Posizionare le scale direttamente dalle pinze in 1 ml di soluzione di fissaggio e incubare a temperatura ambiente, mentre si gira, per ≥ 2 ore. Trasferire il pesce in acqua pesci e monitorare il pesce per confermare il recupero di successo.
- Per candeggina melanociti pigmentati lavare scale fisse in PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) due volte per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di soluzione di candeggina espressi contenente 0,4 ml di KOH al 10% e 0,15 ml 30% H 2 O 2 in 5 ml di dH 2 O. Mettere su serrature parafilm o tappo per impedire al gas di scoppio dei tubi aperti. Continuare sbiancamento fino pigmento è andata (10 min tipico) (Figura 3B, C). Lavare in PBST quattro volte per 5 min a temperatura ambienteteratura.
- Blocco per almeno 30 min in soluzione di blocco costituito da 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN 3 e 2% di siero di agnello. Lasciare fuori NaN 3 se in via di sviluppo con la reazione HRP.
- Incubare con l'anticorpo primario in soluzione di blocco notte a temperatura ambiente. È necessario disporre di almeno 400 ml di soluzione sui campioni per tenerli sommersi.
- Lavare le scale 3 volte per 30 minuti in PBST a temperatura ambiente.
- Incubare con anticorpo secondario da 2 ore a tutta la notte in soluzione di blocco a temperatura ambiente.
- Colorare per 10 minuti con PBST + 0,1 DAPI pM.
- Lavare 3 volte per 5 minuti con PBST.
- Montare le scale su un vetrino in una goccia di Vectashield modo che il lato concavo della bilancia rivolto verso il vetrino e posizionare un coprioggetto di vetro su di loro. Sigillare i bordi del vetrino con smalto trasparente e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza (figura 3D, E, F, G
4. Trapianto Assay
- Preparare destinatario 2-3 mesi vecchio casper 9 pesci irradiando con 25 Gy di raggi gamma un giorno prima del trapianto 10. Lasciare che il pesce per il recupero in acqua pesci.
- Eutanasia di un portatore di tumore pesci come descritto in precedenza (Sezione 2.2).
- Tagliare il tumore e metterlo in una capsula di Petri con circa 5 ml di filtro sterilizzato 0.9x PBS con il 5% di FBS. Tagliare il tumore con un rasoio mentre in soluzione.
- Lavorare a temperatura ambiente, con una pipetta triturare P1000 per ottenere cellule singole. Portare al volume di 25 ml con filtro sterilizzato 0.9x PBS con il 5% di FBS.
- Filtrare su filtro a 40 pM a rete.
- Spin in una centrifuga Eppendorf 5810R tavolo a 1.500 giri al minuto (453 rcf) per 10 min.
- Rimuovere il surnatante e fare sospensione cellulare alla concentrazione di circa desiderato (assumere 10 7 celle a mm 100 3 tumore).
- Calcola il tegli esatto numero di cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare in modo che il volume di iniezione finale è di circa 5 microlitri. Ad esempio, se 50.000 cellule deve essere iniettato, la sospensione cellulare deve essere diluito ad una concentrazione finale di 10.000 cellule / microlitro. Lievemente la provetta contenente la sospensione cellulare ogni pochi minuti per evitare grumi delle cellule.
- Lavare un calibro 26s (punta conica) 701 N siringa da 10 microlitri Hamilton 2-3 volte con il 100% di etanolo e 0.9x PBS. Caricare la siringa con 5 ml di sospensione cellulare.
- Anestetizzare il pesce irradiato destinatario in 0,17 mg / ml tricaine. Pesce posto su un lato su un Kimwipe umido (Figura 4A).
- Stabilizzare il pesce con una mano e inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto ad un angolo di 45 ° nel fianco del pesce al di sopra della cavità peritoneale circa a metà strada tra il confine posteriore del cervello posteriore e il bordo anteriore della pinna dorsale. Delicatamente lo stantuffo (Figura 4B). </ Li>
- Permettono di recuperare il pesce in acqua pesce fresco e osservare i pesci giornaliera per l'attecchimento del tumore (Figura 4C). Se si è verificato l'attecchimento, crescita e lo sviluppo della malattia possono essere rispettate.
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Representative Results
Unicellulare Tg (mitfa: BRAFV600E), p53 (lf); mitfa (lf) embrioni di zebrafish sono stati iniettati con il vettore contenente il miniCoopR oncogene melanoma SETDB1 5 o EGFP, ciascuna sotto il controllo del promotore mitfa. Gli embrioni con salvataggio melanociti sono stati selezionati e lasciati maturare. A 2 mesi di età, con animali di salvataggio melanociti superiore a 4 mm 2 sono stati selezionati. Gli animali sono stati sottoposti a screening settimanale per melanomi. Curve di incidenza di tumori per gli adulti ha dimostrato che l'oncogene SETDB1 notevolmente accelerato onsetas melanoma rispetto al controllo EGFP (Figura 1). Gli animali che hanno sviluppato tumori tra il confine posteriore del romboencefalo e il bordo anteriore della pinna dorsale (Figura 2A) sono stati isolati. Due settimane dopo l'insorgenza di melanoma sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, sezionati e colorati con ematossilina ed eosina per valutare invasione melanoma in UNderlying tessuti. Melanomi esprimono SETDB1 erano più localmente invasivo rispetto EGFP controllo melanomi (Figura 2C). Al fine di cercare espressione di un gene candidato, squame dorsali sono colto da un wild-type zebrafish e colorate utilizzando una diluizione 1:100 di un anticorpo primario che riconosce il fattore di trascrizione Mitfa seguita da una diluizione di 1:1000 capra anti FITC -rabbit IgG (Figura 3). Per valutare transplantability del tumore, cellule di melanoma sono stati isolati da una Tg (mitfa: BRAFV600E), p53 (lf); mitfa (lf) pesce iniettato con miniCoopR-EGFP. 50.000 cellule sono state iniettate per via sottocutanea in una casper destinatario mutante che erano stati irradiati il giorno prima con 25 Gy. Da 2 settimane di età, pigmentate donatore cellule derivate furono facilmente riconoscibile (Figura 4).
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Figura 1. Screening per modificatori di insorgenza di melanoma utilizzando il saggio miniCoopR. A) Schema del test miniCoopR. Embrione con melanociti salvati (punta di freccia) che contengono il vettore miniCoopR e il gene di interesse. Barra di scala = 250 micron. Adulti con più di 4 mm 2 salvataggio melanociti (punta di freccia). Barra di scala = 500 pM B) MiniCoopR-EGFP salvato zebrafish con un amelanotico e un tumore pigmentato (punte di freccia). C) Rappresentante melanoma senza curva di sopravvivenza a confronto tumori che esprimono SETDB1 oncogene e un controllo gene EGFP (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 2. Saggio di invasione tumorale. A) MiniCoopR-salvato zebrafish con un tumore dorsale (punta di freccia) tra il confine posteriore del cervello posteriore e il bordo anteriore della pinna dorsale. B) Sezione trasversale che mostra strato compactum (SC), scale, scala associata melanociti (SAM) (inserto, barra della scala = 50 micron), muscolare (M) e della colonna vertebrale (SPC). Barra di scala = 200 micron. C) mostrano sezioni trasversali non invasiva miniCoopR-EGFP tumore (T) (sinistra) e un SETDB1 miniCoopR tumorale (a destra) che ha invaso attraverso il muscolo strato compactuminto (M) e la colonna vertebrale. Barra di scala = 200 micron.
Figura 3. Colorazione anticorpi dei melanociti scala. A) Bilance di essere colto da un anestetizzato miniCoopR-EGFP zebrafish. B) scala greggi con melanociti pigmentati e C) s sbiancatocale da miniCoopR-EGFP zebrafish. Barra di scala = 100 mM. Scala greggi colorate con a) anticorpo Mitfa D ed E) DAPI. Scala sbiancato tinto con un F) Mitfa anticorpi e G) DAPI. Barra della scala = 40 micron.
Figura 4. Trapianto di cellule di melanoma. A) Uninjected zebrafish casper. Barra di scala = 500 micron. B) sottocutaneo trapianto sito (punta di freccia) su un destinatario casper irradiata subito dopo l'iniezione con 50.000 cellule di melanoma. Barra di scala = 200 micron. C) destinatario casper irradiato mostrando l'attecchimento del tumore (punta di freccia) due settimane dopo l'iniezione con 50.000 cellule di melanoma.
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Discussion
Il metodo miniCoopR permette l'espressione di geni di interesse in melanociti zebrafish. Questo approccio sfrutta il fatto che il gene zebrafish mitfa agisce autonomamente cellulare. Per questo motivo, melanociti recuperati dal vettore miniCoopR sono certi di contenere il minigene e qualsiasi gene di interesse a cui è fisicamente accoppiati. Melanociti salvati sono chiaramente visibili e possono essere ottenuti in animali che sono stati iniettati come monocellulari embrioni. Una misura definita di chimerismo è selezionato, e gli animali superando questa soglia può essere ottenuto per l'insorgenza del tumore o di altre caratteristiche. Uno dei principali vantaggi del metodo miniCoopR è che gli animali con chimerismo sufficiente può essere facilmente identificati e ha ottenuto senza dover ottenere linee transgeniche stabili corrispondenti ad ogni gene di interesse testato. Tempo, energie e denaro vengono salvati in proporzione al numero di geni di interesse per essere esaminati.
Come riportato in precedenza 5
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Leonard I. Zon nel cui laboratorio queste tecniche sono state inizialmente sviluppate, Kristen Kwan e alla fine Chi-Bin Chien per i regali di plasmidi utilizzati in questo lavoro, James e David Lister Raible per l'assistenza con la colorazione degli anticorpi, e James Neiswender per la microiniezione video. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH R00AR056899-03 al CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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