Summary
דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.
Abstract
מחקרים הגנומי של סרטן האנושי הניבו שפע של מידע על גנים ששינו בגידולי 1,2,3. אתגר נובע ממחקרים אלה הוא שגנים רבים הם שינו, וזה יכול להיות קשה להבחין שינויים גנטיים שהובילו tumorigenesis מאלה שהתעוררו במקרה במהלך הפיכה. כדי לצייר הבחנה זו היא מועילה יש assay שיכול כמותית למדוד את ההשפעה של גן השתנה בייזום גידול ותהליכים אחרים שייאפשרו גידולים להתמיד ולהפיץ. כאן אנו מציגים אמצעי מהיר כדי לסנן כמויות גדולות של מלנומה מכפילי מועמד בדג זברה באמצעות 4 מודל גידול כבני מקום שמקיפים את פעולות הנדרשות לייזום מלנומה ותחזוקה. מגיב מפתח בassay זה הוא וקטור miniCoopR, שזוגות העתקה פרועה סוג של גורם מפרט מלנוציט mitfa לקלטת רקומבינציה שער שאליו מל המועמדגני anoma ניתן recombined 5. וקטור miniCoopR יש minigene הצלת mitfa המכיל מקדם, מסגרת קריאה פתוחה ואזור 3'-מתורגם של גן mitfa פראי מהסוג. זה מאפשר לנו לבצע מבנים באמצעות מסגרות קריאה פתוחות באורך מלא של מלנומה מכפילי מועמד. שיבוטים בודדים אלה לאחר מכן ניתן להזריק לתוך תא Tg היחיד (mitfa: BRAF V600E); (LF) עוברי דג זברת mitfa; p53 (LF). וקטור miniCoopR מקבל משולב על ידי transgenesis Tol2 בתיווך 6 ומציל מלנוציטים. משום שהם מצמידים פיסיים mitfa הצלת minigene, גני המועמדים באים לידי הביטוי במלנוציטים חולצו, שחלקם יהפכו ולהתפתח לגידולים. ההשפעה של גן המועמד בייזום לנומה ומאפייני תא מלנומה ניתן למדוד באמצעות עקומות הישרדות ללא מלנומה, מבחני פלישה, מכתים נוגדן מבחני השתלה.
Protocol
1. הקרנה למכפילי התחילה מלנומה
- יצירת שיבוטי כניסה אמצעית Gateway באמצעות PCR הגברת המסגרת באורך מלא הפתוחה קריאה של גנים של עניין (GOI) ויצרף אל pDONR 221 באמצעות BP clonase השני (Invitrogen). השתמש multisite Gateway טכנולוגיה (Invitrogen) לrecombine p5E_mitfa, pME_GOI, # 302 6 p3E_SV40polyA Tol2kit וminiCoopR 5 למקום גנים של ריבית מתחת אמרגן mitfa בminiCoopR הווקטור (איור 1 א).
- הזרק 25 picograms של כל שיבוט יחד עם 25 picograms Tol2 mRNA transposase לתוך אחד התאים Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) עוברי דג זברה פי שלוש הומוזיגוטים כפי שתוארו בעבר 7. דגירת העוברים המוזרקים ב28.5 מעלות צלזיוס הסר את כל עוברים מתים בגיל 24 hpf.
- בחר בעלי חיים מהונדסים עם מלנוציטים חולצו ב72 hpf ידי הצבת צלחת פטרי המכיל עוברים הזריקו בmicroscop ביתורדואר תחת אור תקרית על רקע לבן (איור 1 א).
- העברת חיות ל3 טנקי L בחדר ילדים של מתקן דג הזברה בשעת 4 DPF כפי שתואר בעבר 8.
- ב2 חודשים, בחר את החיות באזור אחד לפחות של הצלת מלנוציט יותר מ 4 מ"מ 2 (איור 1 א). יש מתאם חזק בין מידת הצלת מלנוציט ב 72 hpf ומידת הצלת מלנוציט ב2 חודשים. כאשר עוברים בעלי הצלת מלנוציט נקטפים בגיל 72 hpf, רובם (~ 80%) יהיה לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציט יותר מ 4 מ"מ 2 ב2 חודשים.
- מסך החיות הנבחרות השבועיות לנוכחות של גידולים (1B איור). יש מתאם חזק בין שינויים מורפולוגיים והיסטופתולוגיים. מעבר משפיר לממאיר מוכר כשינוי המורפולוגי כאשר נגעים הפכו העלו מעל פני השטח של בעלי החיים. מבודד האנימה נושאה גידולls למחקר.
- צייר עקומות הישרדות ללא מלנומה עם גיל בשבועות ובabscissa אחוזים מלנומה בהישרדות ללא ordinate. חיות עם מלנוציטים שמבטאים את הגן של עניין הן בהשוואה לבעלי חיים ששולטות המפורש EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) במלנוציטים (התרשים 1C). הופעת הגידול החציוני לבעלי חיים הוזרקו miniCoopR-EGFP היא כ 18 שבועות. קבע האם שתי העקומות הן סטטיסטי שונות בעזרת בדיקת דרגת יומן.
2. Assay פלישת גידול
- בחר דג זברה מבודד שלפתח גידולי dorsally, באזור שבין הגבול האחורי של המוח האחורי וגבול קדמי של סנפיר הגב (איור 2 א).
- שבועות לאחר תחילה לנומה להרדים את הדג על פי הנחיות מפורטות על ידי הפנל האמריקאי לרפואת וטרינרית אגודה על המתת חסד ואושר על ידי אוניברסיטת Ins בית הספר לרפואה במסצ'וסטסטיפול בבעלי חיים וtitutional ועדת שימוש (IACUC). באופן ספציפי, דגים ממוקמים לתוך צלחת עם 0.6 מ"ג / המ"ל tricaine עד תנועת זימים מפסיקה.
- עושה חתך בחלל הצפק של הדג עם אזמל ולאחר מכן הנח את הדג בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה ב 4 ° C לקיבעון.
- פנק עם 0.5 M EDTA לילה ב 4 ° C כדי decalcify.
- לתקן עם פורמלין בקלטת לילה, לייבש לשעה 1, ברור עם 3 פעמים קסילן לשעה 1 ולאחר מכן טיפול עם פרפין 2 פעמים עבור 2 שעות כל אחת, לפי 60 ° C.
- שבץ הרקמה בפרפין בעובש ולאפשר לו לחזק למשך 30 דקות עד 1 שעה.
- הפוך 5 חלקים 1 מיקרומטר, כל 50 מיקרומטר. הסעיפים צריכים להיות רוחביים ודרך כל הנגע כך שהנקודה העמוקה ביותר של פלישה יכולה להיות מזוהית. עקוב ידי hematoxylin ומכתים eosin.
- הערך את פלישת גידול על ידי מדידה אם תאים סרטניים להישאר מחוץ לשכבה compactum collagenous, לפלוש לתוך הגבשרירים או לפלוש לעוד יותר לתוך עמוד השדרה (האיור 2B, C). לקבוע הבדל סטטיסטי בין שני הסטים של דגימות.
3. כתמים של נוגדן מלנוציטים Scale
- איפור PO4 חיץ עם 80 מ"ל 0.1 M Na 2 HPO 4 ו 20 המ"ל 0.1M nah 2 PO 4. ודא pH הוא 7.3. איפור חיץ התיקון 2x המכיל סוכרוז 8.0 גרם, 0.15 המ"ל CaCl 0.2m 2 ל 4 חיץ 90 מ"ל 0.2m PO, 7.3 pH. אם יש צורך להתאים את ה-pH ל 7.3 עם NaOH או HCl אז לעשות עד 100 מ"ל עם 4 חיץ פו.
- לשקול עד 300 מ"ג המוצק PFA ולהוסיף לצינור microcentrifuge. הוסף 5 המ"מ NaOH לנפח שווה למסת 4.5 X, במ"ג, של PFA (למשל 450 ul 5 המ"מ NaOH עד 100 מ"ג PFA). חום ב60-70 מעלות צלזיוס עם רעד עד PFA נמס מזדמן. ספין למטה חלקיקים נותרים ולשחזר 20% PFA supernatant. הפוך טריה בכל פעם.
- להכין תמיסה המכילה קיבעון 1x Fiחיץ x ו 4% PFA.
- הרדם את הדגים ב0.17 מ"ג / המ"ל tricaine.
- באמצעות אור אירוע תחת מיקרוסקופ לנתח למרוט קשקשי גב באמצעות מלקחיים חדים קנס בקצוות, נזהרים שלא לפגוע במחצית מלנוציט המכיל הסולם (איור 3 א). קשקשי מקום ישירות מהמלקחיים לתוך פתרון 1 מיליליטר קיבעון ו דגירה בטמפרטורת חדר, תוך כדי הפעלה, ל≥ 2 שעות. להעביר את הדגים למי דגים ולנטר את הדגים כדי לאשר שחזור מוצלח.
- למלנוציטים פיגמנט אקונומיקה לשטוף סולמות קבועים בPBST (1x PBS pH 7.4, 0.1% Triton X-100) 2 פעמים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 1 מיליליטר תמיסת כלור טרי המכילה 0.4 המ"ל KOH 10% ו0.15 המ"ל 30% H 2 O 2 ב5 מ"ל עם DH 2 O. שים על מנעולי parafilm או מכסה כדי למנוע מגז שהתפוצץ הצינורות פתוחים. המשך עד הלבנת הפיגמנט נעלם (10 דקות הן טיפוסיות) (איור 3B, C). שטוף בזמני PBST 4 למשך 5 דקות בטמפ 'החדרerature.
- בלוק לפחות 30 דקות בתמיסה מורכבת מבלוק 1x PBS pH 7.4, 0.2% Triton X-100, 2 מ"ג / המ"ל BSA, 1% DMSO, 0.02% NaN 3 וכבש 2% בסרום. השאר את 3 NaN אם מתפתח עם תגובת HRP.
- דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון בלוק הלילה בטמפרטורת חדר. אתה צריך לפחות 400 μl של פתרון את הדוגמות, כדי לשמור אותם מתחת למים.
- שטוף את הכף 3 פעמים למשך 30 דקות בPBST בטמפרטורת חדר.
- דגירה עם נוגדן משני מ 2 שעות ללילה בפתרון בלוק בטמפרטורת חדר.
- כתם למשך 10 דקות עם PBST + DAPI מיקרומטר 0.1.
- לשטוף 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBST.
- הר הסולמות על שקופית זכוכית בירידה של vectashield כך שהצד הקעור של המאזניים כלפי מטה לכיוון השקף ומניח פיסת זכוכית לכסות עליהם. לאטום את הקצוות של שקופיות עם לק הברור ולבחון את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (האיור 3D, E, F, G
4. ההשתלה Assay
- הכן חודש 9 דגי הנמען 2-3 ישנים casper ידי הקרנה עם 25 Gy של קרינת גמא יום לפני ההשתלה 10. אפשר הדגים להתאושש במי דגים.
- להרדים דגי גידול נושאה כפי שתואר לעיל (סעיף 2.2).
- לחתוך את הגידול ולשים אותו בצלחת פטרי עם כ 5 מיליליטר מסנן מעוקר 0.9x PBS עם 5% FBS. קוביות גידול עם סכין גילוח ואילו בתמיסה.
- עבודה בטמפרטורת חדר, עם triturate P1000 פיפטה כדי לקבל תאים בודדים. הפוך את עוצמת הקול עד 25 מ"ל עם מעוקר 0.9x PBS מסנן עם 5% FBS.
- לסנן דרך מסננת רשת מיקרומטר 40.
- ספין בצנטריפוגה שולחן 5810R אפנדורף ב1500 סל"ד (453 RCF) למשך 10 דקות.
- הסר את supernatant ולהפוך את השעית תא לריכוז רצוי בערך (תניח 10 7 תאים לגידול 3 מ"מ 100).
- חישוב tהוא מספר תא מדויק באמצעות hemocytometer ולדלל את השעית התא, כך שנפח ההזרקה הסופי הוא כ 5 μl. לדוגמה, אם 50,000 תאים הם להיות מוזרקים, השעית התא צריכה להיות מדוללת לריכוז סופי של 10,000 תאים / μl. פליק הצינור המכיל את השעית תא בכל כמה דקות, כדי למנוע יצירת גושים של התאים.
- שטפו מד 26s (קצה שיפוע) מזרק המילטון μl 701 N 02-03 אוקטובר פעמים עם אתנול 100% ו0.9x PBS. טען את המזרק עם 5 μl של השעית התא.
- הרדם דגי הנמען המוקרנים ב0.17 מ"ג / המ"ל tricaine. דגים במקום על צידו על Kimwipe לח (איור 4 א).
- לייצב את הדגים ביד אחת ולהכניס את המחט עם השיפוע כלפי מעלה בזווית של 45 ° לאגף של הדג מעל חלל הצפק בערך באמצע הדרך בין הגבול האחורי של המוח האחורי וגבול קדמי של סנפיר הגב. בעדינות לוחץ על המתג (איור 4 ב). </ Li>
- אפשר הדגים להתאושש במי דגים טריים ולבחון את הדגים מדי יום לengraftment גידול (האיור 4C). אם engraftment אירע, המשך צמיחה והתפתחות מחלה יכולות גם להיות שנצפו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אחד תאי Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); (LF) עוברי mitfa דג זברה הוזרקו וקטור miniCoopR מכיל אונקוגן לנום SETDB1 5 או EGFP, כל אחד תחת השליטה של אמרגן mitfa. עוברים בעלי הצלת מלנוציט נבחרו ואפשרו לבוגרים. ב2 חודשים של גיל עם הצלת חי מלנוציט יותר מ 4 מ"מ 2 נבחרו. החיות הוקרנו שבועי עבור מלנומה. עקומות ההיארעות סרטניות למבוגרים הראו כי SETDB1 אונקוגן הואץ onsetas מלנומה באופן משמעותי בהשוואה לשליטת EGFP (איור 1). בעלי החיים שפתחו גידולים בין הגבול האחורי של המוח האחורי והגבול הקדמי של סנפיר הגב (איור 2 א) היינו מבודדים. שבועות לאחר תחילה לנומה הם היו קבועים בparaformaldehyde 4%, נחתכו ומוכתם בhematoxylin וeosin להעריך פלישה מלנומה לבלתיderlying רקמות. מלנומה מבטאים SETDB1 היו יותר מקומי פולשנית מאשר EGFP שליטה מלנומה (איור 2 ג). כדי לחפש ביטוי של גן המועמד, קשקשי גב היו מרוטים מדג זברה פראית מסוג ומוכתם באמצעות דילול של 1:100 נוגדן ראשוני שמזהה את גורם שעתוק Mitfa אחרי 1:1,000 דילול של אנטי עז FITC ארנב IgG נוגדנים (איור 3). כדי להעריך transplantability של הגידול, תאים מלנומה בודדו מTg (mitfa: BRAF V600E); דגי mitfa (LF) הוזרק miniCoopR-EGFP; p53 (LF). 50,000 תאים הוזרקו תת עורית לנמען casper מוטציה שמוקרנת יום לפני עם 25 Gy. על ידי 2 שבועות של גיל, תאי פיגמנט תורם-derived הוכרו בקלות (איור 4).
o: src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
איור 1. הקרנה להופעה מלנומה באמצעות מכפילים assay miniCoopR. ) סכמטי של assay miniCoopR. עובר עם מלנוציטים חולצו (ראש החץ) המכילים את וקטור miniCoopR והגן של עניין. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. מבוגר עם יותר מ 4 הצלת מלנוציט 2 מ"מ (ראש החץ). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר B) MiniCoopR-EGFP הציל דג זברה עם amelanotic וגידול פיגמנט (ראשי חץ). ג) עקומת הישרדות לנומה ללא נציג השוואת גידולים המבטאים SETDB1 אונקוגן ושליטת EGFP גן (p = 9.4 × 10 -7, logrank χ 2). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
2.jpg "/>
איור 2. Assay פלישת גידול. א) דג זברת MiniCoopR-מציל עם גידול הגבה (ראש החץ) בין הגבול האחורי של המוח האחורי והגבול הקדמי של סנפיר הגב. ב) סעיף רוחבי מראה שכבה compactum (SC), קשקשים, (SAM) סרגל קנה מידה הקשורים מלנוציט (הבלעה, סולם = 50 מיקרומטר), שרירים (M) ועמוד שדרה (SPC). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. ג) סעיפים רוחביים מראים גידול לא פולשני miniCoopR-EGFP (ט) (משמאל) ו- SETDB1 miniCoopR גידול (מימין) שפלש דרך שריר שכבת compactuminto (ז) ואת עמוד השדרה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.
איור 3. מכתים נוגדן של מלנוציטים קנה מידה. ) סולמות נקטפים מminiCoopR-EGFP דג זברה מורדם. ב) היקף מולבן עם מלנוציטים פיגמנט ו-C) של מולבןקייל מminiCoopR-EGFP דג זברה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. היקף מולבן מוכתם ב) נוגדן D Mitfa ו-E) DAPI. היקף מולבן מוכתם בF) Mitfa נוגדנים ו-G) DAPI. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר.
איור 4. השתלה של תאים מלנומה. ) Uninjected דג זברת קספר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. B) תת עורי באתר השתלה (ראש החץ) על נמען casper מוקרן מייד לאחר הזרקה עם 50,000 תאים מלנומה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. ג) נמען casper מוקרן מראה engraftment גידול (ראש החץ) שבועות לאחר הזרקה עם 50,000 תאים מלנומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת miniCoopR מאפשרת ביטוי של גנים של עניין מלנוציטים דג זברה. גישה זו מנצלת את העובדה שגן mitfa דג הזברה פועל תא אוטונומי. מסיבה זו, מלנוציטים חולצו על ידי וקטור miniCoopR בטוחים כדי להכיל minigene וכל גן של עניין שאליו הוא מצמיד באופן פיזי. מלנוציטים הצילו הם נראים בבירור וניתן לקבלו בבעלי חיים שהוזרקו כעוברי תא בודד. תואר מצוין של chimerism נבחר ובעלי חיים מצוינים הפסקה זו יכולים להיות בקיע להופעת גידול או מאפיינים אחרים. יתרון עיקרי של השיטה הוא שminiCoopR חיות עם chimerism המספק ניתן לזהות בקלות ובקיע מבלי לקבל קווים הטרנסגניים יציבים מתאימים לכל גן של עניין נבדק. זמן, מאמץ והוצאות נשמרים באופן יחסי למספר הגנים של ריבית שנסקר.
כפי שדווח בעבר 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ליאונרד I. זון שבמעבדה שלו טכניקות אלו פותחו בתחילה; קריסטן קוואן ומאוחר צ'י סל Chien למתנות של פלסמידים משמשים בעבודה זו; ג'יימס ליסטר ודיוויד Raible לקבלת סיוע בצביעת נוגדנים, וג'יימס לNeiswender וידאו microinjection. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R00AR056899-03 לCJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
