Summary
zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
인간의 암의 게놈 연구는 종양 하나, 둘, 셋에서 변경 아르 유전자에 대한 풍부한 정보를 굴복했습니다. 이 연구에서 발생하는 문제는 많은 유전자가 변경된다는 것입니다, 그것은 모든 사람들이 변화하는 동안 부수적으로 발생한 그에서 tumorigenesis를 몰고 유전자 변경을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 구별을 그리려면이 양적 종양 계속하고 배포 할 수 있도록 종양 개시 및 기타 프로세스에 변경된 유전자의 효과를 측정 할 수 있습니다 검정을 가지고 유용합니다. 여기 흑색 증의 개시 및 유지 보수에 필요한 단계를 포함 autochthonous 종양 모델 (4)를 사용하여 zebrafish에 후보 흑색 증 조절 다수의 화면에 빠른 방법을 제시한다. 이 분석의 주요 시약 어떤 게이트웨이 재결합 카세트에 커플 mitfa melanocyte 사양 계수의 야생 형 사본을 miniCoopR 벡터, 어느 후보 멜로anoma 유전자는 5 재결합 할 수 있습니다. miniCoopR 벡터는 발기인, 오픈 읽기 프레임과 야생 형 mitfa 유전자의 3'-번역되지 않은 지역을 포함하는 mitfa의 구조를 minigene 있습니다. 우리는 후보 흑색 증 조절의 전체 길이 열려있는 독서 프레임을 사용하여 구조를 할 수 있습니다. p53의 (만약에); mitfa (LF) zebrafish의 배아 :이 각각의 클론 그런 다음 단일 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 주입 될 수있다. miniCoopR 벡터는 Tol2로 인한 transgenesis 6 통합 melanocytes를 구출됩니다. 그들이 실제로 mitfa 구출 minigene에 연결되기 때문에, 후보 유전자는 변화와 종양으로 발전 할 일부의 구출 melanocytes에 표현됩니다. 흑색 증의 개시 및 흑색 증 세포의 특성에 후보 유전자의 효과가 흑색 증없는 생존 곡선, 침략의 assays, 항체 염색법과 이식 assays를 사용하여 측정 할 수 있습니다.
Protocol
1. 흑종의 발병 조절을위한 검사
- PCR 관심의 유전자의 전체 길이 열려있는 독서 프레임 (GOI)를 증폭하고 BP clonase II (Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221에 recombining에 의해 게이트웨이 중간 항목 클론을 만들 수 있습니다. miniCoopR 벡터 (그림 1A)에 mitfa 프로모터에서의 관심 유전자를 삽입 재조합 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 miniCoopR 5 Multisite 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용합니다.
- 이전 7에 설명 된대로 mitfa (LF) triply homozygous zebrafish의 배아, p53의 (만약에) : 한 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 25 picograms Tol2 transposase의 mRNA와 함께 각 클론의 25 picograms를 삽입. 28.5에서 주입 배아를 배양 ° C. 24 hpf에있는 죽은 태아를 제거합니다.
- 해부 microscop에 주입 배아를 포함하는 페트리 접시를 배치하여 72 hpf에서 구출 melanocytes과 유전자 변형 동물을 선택흰색 배경 (그림 1A)에 대한 입사광에 따라 5.
- 이전에 8에 설명 된대로 네 dpf에서 zebrafish 시설의 보육의 3 L 탱크에 동물을 전송합니다.
- 2개월에서 4mm 2 (그림 1A)보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 공간이있는 동물을 선택합니다. 72 hpf에서 melanocyte 구조의 정도, 2 개월 melanocyte 구조의 정도 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. melanocyte 구조와 태아가 72 hpf로 선택하는 경우, 그들 중 대부분 (~ 80 %) 2 개월 4mm 2보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 영역을 갖게됩니다.
- 화면 종양의 존재 (그림 1B)에 대한 주간 선택한 동물. histopathologic와 morphologic 변경 사항을 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. 양성에서 악성으로 전환이 병변은 동물의 표면을 제기 될 morphologic 변경으로 인정 받고 있습니다. 종양 베어링 애니 마을 분리연구 있나요.
- 종좌표에 자리표와 %의 흑색 증이없는 생존의 주 나이가 흑색 증 - 무료 생존 곡선을 그립니다. 관심있는 유전자를 표현하는 melanocytes가있는 동물은 동물을 제어하는 비교됩니다 melanocytes에서 명시 적 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) (그림 1C). miniCoopR-EGFP를 주입 동물에 대한 중간 종양의 증상은 약 18 주입니다. 두 곡선이 로그 순위 테스트를 사용하여 통계적으로 다른 있는지 여부를 확인합니다.
2. 종양 침략 분석
- hindbrain과 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞쪽에 경계의 뒤쪽 경계 사이의 지역에서, dorsally 종양을 개발하는 절연 zebrafish를 선택합니다.
- 흑색 증의 증상은 메사추세츠 의과 대학 기능 대학에서 안락사에 대한 미국의 동물 의료 협회 패널에 의해 지정된 및 승인 지침에 따라 물고기를 안락사시켜야 2 주 후에titutional 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC). 아가미의 움직임이 멈출 때까지 특히, 생선은 0.6 MG / ML tricaine와 함께 그릇에 배치됩니다.
- 메스 생선의 복막 캐비티에 절개를 확인하고 고정에 대해 4 ° C에서 밤새 4 % paraformaldehyde에있는 물고기 (PFA)를 넣습니다.
- 4에서 하루 아침에 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 함께 치료 ° C가 decalcify합니다.
- 밤 60시 2 시간 각 2 회 ° C.를 1 시간에 크실렌 3 회와 분명 1 시간에 탈수하고 파라핀으로 처리 카세트에 포르말린으로 고정
- 몰드에 파라핀의 조직을 삽입하고 30 분 ~ 1 시간을 위해 더욱 강화 할 수 있습니다.
- 5 μm 섹션, 하나마다 50 μm하십시오. 섹션은 가로와 깊은 침략의 요점을 식별 할 수 있도록 전체 병변을 통해해야합니다. hematoxylin 및 eosin의 착색에 따릅니다.
- 종양 세포가 collagenous 지층 compactum 밖에 남아 있는지 여부를 측정하여 종양 침략을 평가 등쪽에 침략근육은 나 척추 (그림 2B, C)에 더 침략. 샘플의 두 집합 사이의 통계적 차이를 확인합니다.
3. 규모 Melanocytes의 항체 염색법
- 80 ML 0.1 M 오세영 2 HPO 4, 20 ML 0.1M 아니 2 PO 4 PO4 버퍼를 확인합니다. 산도는 7.3 있는지 확인하십시오. 8.0 g의 자당, 0.15 ML 0.2M CaCl 2, 90 ML 0.2M PO 4 버퍼, 산도 7.3을 포함하는 2 배 수정 버퍼를 확인합니다. 필요는 NaOH 또는 HCL과 7.3로 pH를 조정한다면 PO 4 버퍼 100 ML까지합니다.
- 300 MG 고체 PFA까지 무게 microcentrifuge 튜브에 추가합니다. PFA 4.5 X 질량, MG에서 (예를 들면 450 UL 5 MM NaOH 100 MG PFA까지)와 같은 볼륨에 5 MM NaOH를 추가합니다. 60-70에서 열 ° C PFA가 해산 될 때까지 흔들림 가끔있는. 나머지 입자를 스핀 다운 20 % PFA 표면에 뜨는을 복구합니다. 신선한 때마다 확인합니다.
- 1X Fi 접속 설비를 포함하는 고정 솔루션을 준비X 버퍼와 4퍼센트 PFA.
- 0.17 MG / ML tricaine에서 물고기를 마취.
- 날카로운 미세 스쳐 집게를 사용하여 등쪽의 비늘은 꺽을 해부 현미경으로 입사 광을 사용하여 규모의 melanocyte 함유 절반 (그림 3A)를 손상하지 돌봐. 직접 한 ML의 고정 솔루션과 실온에서 알을 품다,에 포셉 곳에서의 비늘가 도는 동안, ≥ 2 시간에. 물고기 물에 물고기를 전송하고 성공적인 복구를 확인하기 위해 생선을 모니터링 할 수 있습니다.
- 표백 색소 melanocytes는 실온에서 5 분에 PBST (1X PBS 산도 7.4, 0.1 % 트리톤 X-100) 2 번에 고정 비늘을 씻어합니다. DH 2 O. 5 개 ML에 0.4 ML 10% 코와 0.15 ML 30% H 2 O 2를 포함 한 ML을 추가 갓 만든 표백 솔루션 튜브가 열려 파열에서 가스를 방지하기 위해 parafilm이나 모자를 자물쇠에 놔. 안료는 (그림 3B, C) (10 분 전형적인) 사라질 때까지 표백 계속합니다. 온도는 실온에서 5 분 동안 PBST 네 번에 씻어erature.
- 1X PBS 산도 7.4, 0.2 % 트리톤 X-100, 2 밀리그램 / ML BSA, 1 % DMSO, 0.02 % 할머니 3 2% 양 혈청으로 구성 블록 솔루션에 적어도 30 분을위한 블록. HRP 반응을 개발하면 할머니 3을 둡니다.
- 실온에서 하룻밤 블록 솔루션에 기본 항체를 품다. 당신이 그들을 침수 유지하기 위해 샘플을 통해 솔루션의 적어도 400 μl이 필요합니다.
- 상온에서 PBST에서 30 분의 비늘에게 3 번 씻으십시오.
- 2 시간에서 실온에서 블록 솔루션 야간에 차 항체를 품다.
- PBST + 0.1 μM의 DAPI로 10 분에 청바지.
- PBST로 5 분에 3 번 씻으십시오.
- 비늘의 오목면이 슬라이드 밑에 직면 있도록 vectashield 한 방울의 유리 슬라이드에 비늘를 장착하고 이상 유리 커버 전표를 놓습니다. 투명 매니큐어와 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 (그림 3D, E, F, G에서 슬라이드를 관찰
4. 이식 검정
- 이식 10 이전 감마 방사선의 25 GY 일일를 irradiating에 의해받는 2~3개월 이전 캐스퍼 9 생선을 준비합니다. 물고기는 물고기 물에 복구 할 수 있습니다.
- 이전에 설명 된대로 종양 - 베어링 생선 (2.2 절)을 안락사시켜야.
- 종양을 잘라 5 % FBS와 0.9x PBS를 소독 약 5 ML 필터를 페트리 접시에 넣어. 면도기 솔루션 중에있는 종양를 분석.
- 실온에서 근무, 단일 세포를 얻을 수있는 P1000 피펫을 씹다. 5% FBS와 필터를 소독 0.9x PBS로 볼륨 25 ML로 구성합니다.
- 40 μM 메쉬 필터를 통해 필터링 할 수 있습니다.
- 10 분에 1,500 RPM (453 rcf)에서 Eppendorf 5810R의 탁상 원심 분리기에 봐.
- 표면에 뜨는를 제거하고 약 원하는 농도 (100mm 3 종양에 대한 10 7 세포를 가정)에 세포 현탁액을합니다.
- t를 계산그는 정확한 휴대폰 번호는 hemocytometer를 사용하여 최종 사출 볼륨이 약 5 μl이되도록 세포 현탁액을 희석. 50000 세포 주입 할 경우 예를 들어, 세포 현탁액은 10,000 세포 / μl의 최종 농도로 희석해야합니다. 세포 현탁액에게 전지 거리며 걷게을 방지하기 위해 모든 몇 분을 포함하는 관을 긋기.
- 2 ~ 3 배는 100 % 에탄올과 0.9x PBS와 26s 게이지 (베벨 팁) 701 N 10 μl 해밀턴 주사기를 씻으십시오. 세포 현탁액의 5 μl로 주사기를로드합니다.
- 0.17 MG / ML tricaine에서 방사능받는 물고기를 마취. 젖은 Kimwipe에서의 편에 자리 물고기 (그림 4A).
- 한 손으로 물고기를 안정화 약 반 hindbrain와 등쪽 지느러미 앞쪽 테두리의 뒤쪽 경계 사이의 복막 캐비티 위의 생선의 측면에 45 ° 각도로 일어나 직면하고있는 베벨로 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 플런저를 (그림 4B) 우울. </ 리>
- 생선 신선한 생선 물에 복구하고 종양 engraftment (그림 4C)를 매일 물고기를 관찰 할 수 있습니다. engraftment가 발생했습니다 경우, 지속적인 성장과 질병 개발도 볼 수 있습니다.
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Representative Results
하나의 셀 TG (mitfa : BRAF V600E), p53의 (만약에), mitfa (LF) zebrafish의 배아는 흑색 증의 종양 유전자 mitfa 프로모터의 조절하에 SETDB1 5 EGFP 각을 포함하는 miniCoopR 벡터를 주입했다. melanocyte 구조와 태아가 선택되고 성숙 할 수 있었다. melanocyte 구조와 세 동물 2 개월에 4mm 2보다 더 큰이 선택되었습니다. 동물 melanomas 주 단위로 상영되었다. 성인을위한 종양 발생률 곡선은 SETDB1 종양 유전자는 크게 EGFP 제어 (그림 1)에 비해 흑색 증의 onsetas을 가속화 것으로 나타났다. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞 국경 사이에 종양을 개발 동물 격리되었다. 두 주 흑색 증의 발병 후에는 hematoxylin과 eosin으로 sectioned과 스테인드은 취소에 흑색 증의 침략을 평가하기 위해, 4 % paraformaldehyde에 고정 된조직을 derlying. SETDB1을 표현 Melanomas은 EGFP 제어 melanomas (그림 2C)보다 더 많은 로컬 침입했다. 후보 유전자의 표현을 찾기 위해 위해, 등쪽의 비늘은 FITC 염소 항에 1:1,000 희석 한 다음 Mitfa 전사 인자를 인식하는 기본 항체의 1:100 희석을 사용하여 야생 형 zebrafish과 스테인드 뜯어 낸되었다 - 토끼 IgG 항체 (그림 3). miniCoopR-EGFP를 주입 mitfa (만약에) 물고기, p53의 (만약에) : 종양의 transplantability을 평가하기 위해, 흑색 증 세포는 TG (BRAF V600E mitfa)에서 분리되었다. 50000 세포는 피하 25 GY로 전날을 발견 했소 된받는 사람 캐스퍼 돌연변이에 주입했다. 세 2 주에 의해 색소 기증자 파생 세포는 쉽게 (그림 4) 인정되었다.
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그림 1. miniCoopR 분석을 사용하여 흑색 증의 발병 조절을위한 검사. miniCoopR 분석의 A) 도식. miniCoopR 벡터 관심의 유전자를 포함하는 구조 melanocytes (화살촉)와 배아. 스케일 바 = 250 μM. 4mm 2 melanocyte 구조 (화살촉)보다 큰있는 성인. 스케일 바 = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP는 amelanotic과 색소 종양 (화살촉)와 zebrafish를 구출. C) 대표 흑색 증 - 무료 생존 곡선은 종양 유전자의 SETDB1 및 제어 EGFP 유전자를 표현하는 종양을 비교 (P = 9.4 × 10 -7, logrank χ 2). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. 종양 침공 분석. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 앞쪽 가장자리 사이의 등쪽 종양 (화살촉)와 A) MiniCoopR - 탈출의 zebrafish. 지층 compactum (SC), 비늘, 규모 - 관련 melanocyte (SAM) (삽입, 스케일 바 = 50 μM), 근육 (M)과 척추 (SPC)를 보여주는 B) 가로 절을 참조하십시오. 스케일 바 = 200 μM. C) 비 침습적 miniCoopR-EGFP 종양 (T) (왼쪽)와 지층 compactuminto 근육 (M)와 척추를 침범 한 miniCoopR - SETDB1 종양 (오른쪽) 보여 가로 섹션을 제공합니다. 스케일 바 = 200 μM.
규모 melanocytes의 그림 3. 항체 염색법. A) 저울은 anesthetized miniCoopR-EGFP zebrafish에서 뽑혀된다. 색소 melanocytes와 C와 B) 표백하지 않은 기준) 표백들miniCoopR-EGFP zebrafish에서 케일. 스케일 바 = 100 μM. 표백하지 않은 규모)는 D) Mitfa 항체와 E와 DAPI를 더럽 혔다. 표백 규모)는 Mitfa 항체와 G에게) F와 DAPI를 더럽 혔다. 스케일 바 = 40 μM.
그림 4. 흑색 증 세포의 이식. A) 캐스퍼의 zebrafish는 Uninjected. 스케일 바 = 500 μM. 즉시 50,000 흑색 증 세포로 주입 한 후 방사능 캐스퍼받는 사람에 대한 B) 피하 이식 사이트 (화살촉). 스케일 바 = 200 μM. C) 방사능 캐스퍼받는 두 주 50,000 흑색 증 세포로 주입 후 종양이 engraftment (화살촉)를 보여주고 있습니다.
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Discussion
miniCoopR 방법은 zebrafish melanocytes에 대한 관심의 유전자의 표현이 가능합니다. 이 방법은 zebrafish mitfa 유전자가 세포 자율적으로 역할을한다는 사실을 활용합니다. 이러한 이유로, miniCoopR 벡터에 의해 구출 melanocytes는 minigene이 있고 물리적으로 연결된다에 관심이있는 유전자를 포함 할 확신합니다. 구출 melanocytes는 명확하게 볼 수 있으며, 단일 셀 배아로 주입 된 동물에서 얻을 수 있습니다. chimerism의 지정된 수준이 선택되어,이 컷오프를 능가 동물은 종양 발병 또는 기타 특성을 채점 할 수 있습니다. miniCoopR 방법의 가장 큰 장점은 충분한 chimerism과 동물 쉽게 식별하고 테스트 관심의 모든 유전자에 해당 안정적으로 유전자 변형 라인을 취득 할 필요없이 득점 할 수 있다는 것입니다. 시간과 노력, 비용을 조사 할 관심 유전자의 수에 비례에 저장됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
와 제임스 Neiswender, 순영 관이 작업에 사용 plasmids의 선물의 고 (故) 치 빈 치엔; 항체 염색법과 도움 제임스 리스터와 데이빗 Raible 우리는 그의 연구실이 기술이 처음 개발에서 박사 레너드 I. Zon 감사 microinjection 비디오. 이 작품은 CJC에 NIH 보조금 R00AR056899-03가 추진하는 사업
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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