Bir zebrafish otokton tümör modeli kullanılarak melanoma düzenleyiciler için ekran için hızlı bir şekilde sunulmaktadır. Bu melanosit aday melanom genlerin ifadesi için izin miniCoopR vektör yararlanır. Melanom sağkalım eğrileri, bir işgal testi, ölçek melanosit antikor boyama için bir protokol ve bir melanom nakli tahlil elde bir yöntem tarif edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama
Bu makalede
Özet
Özet
Insan kanserlerini Genomik çalışmalar tümörler 1,2,3 değişmiş genler hakkında bilgi bir zenginlik vermiştir. Bu çalışmalardan kaynaklanan bir zorluk birçok genin değişmiş olduğunu ve bu dönüşüm sırasında tesadüfen ortaya çıktığını gelen tümörogenez sürdü genetik bozukluklardan ayırt etmek zor olabilir. Bu ayrım çizmek için bunu kantitatif tümörler inat ve yaymak için izin tümör gelişimini ve diğer süreçlere değişmiş bir gen etkisini ölçebilen bir test olması faydalıdır. Burada melanom başlatılması ve bakımı için gerekli adımları kapsayan bir otokton tümör modeli 4 kullanarak zebrafish aday melanom değiştiriciler çok sayıda taranması için hızlı bir araç sunuyoruz. Bu tahlilde önemli bir reaktif olan bir ağ geçidi rekombinasyon kaset için çiftler mitfa melanosit şartname faktörünün bir vahşi-tip kopya miniCoopR vektör ki, burada aday haline melanomaliler genler 5 recombined. MiniCoopR vektör promotör, açık okuma çerçevesi ve yabani-tip mitfa geninin 3'-çevrilmemiş bölge içeren bir mitfa kurtarıcı minigene sahiptir. Bu bizi bir aday melanom modifiye tam boy açık okuma çerçeveleri ile yapılar yapmak için olanak sağlar. P53 (lf);; mitfa (lf) zebrafish embriyolar: Bu bireysel klonlar daha sonra tek hücre Tg (BRAF V600E mitfa) enjekte edilebilir. MiniCoopR vektör Tol2-aracılı transgenesis 6 ile entegre ve melanosit kurtarır alır. Fiziksel mitfa kurtarıcı minigene birleştiğinde Çünkü, aday genler dönüştürmek ve tümörler dönüşecek bazıları kurtarıldı melanosit olarak ifade edilmiştir. Melanom başlatılması ve melanom hücre özelliklerini bir aday genin etkisi melanom sağkalım eğrileri, invazyon deneyleri, antikor boyama ve transplantasyon yöntemleri kullanılarak ölçülebilir.
Protokol
1. Melanom Onset Değiştiricileri için Tarama
- PCR ilgi genlerinin tüm uzunlukta açık okuma çerçevesi (GOI) yükselterek ve BP klonaz II (Invitrogen) kullanılarak pDONR 221 içine yeniden birleştirilmesini ile orta ağ geçidi giriş klonlar oluşturur. MiniCoopR vektörü (Şekil 1A) mitfa organizatörü altında ilgi genleri yerleştirmek rekombinasyona p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 ve miniCoopR 5 Multisite Geçidi teknolojisi (Invitrogen) kullanın.
- Önceden 7 açıklandığı gibi mitfa (lf) triply homozigot zebrafish embriyolar; p53 (lf): tek hücreli Tg (B....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tek hücreli Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) zebrafish embriyolar melanom onkogen mitfa promotör kontrolü altında SETDB1 5 veya EGFP, her içeren miniCoopR vektörü ile enjekte edildi. Melanosit kurtarma olan embriyolar seçilir ve olgunlaşması için izin verildi. Melanosit kurtarma ile yaş hayvanların 2 ayda 4 mm 2 den büyük seçilmiştir. Hayvanlar melanomlar için haftalık tarandı. Yetişkinler için tümör oluşumunda eğrileri SETDB1 onkogen önemli .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MiniCoopR yöntem zebrafish melanosit ilgi genlerinin ifadesini sağlar. Bu yaklaşım zebrafish mitfa geni hücre-özerk davrandığını aslında yararlanır. Bu nedenle, miniCoopR vektör tarafından kurtarıldı melanosit minigene ve fiziksel birleştiğinde ilgilendiren herhangi bir gen içeren kesin. Kurtarılan melanosit açıkça görülebilir ve tek hücreli embriyolar olarak enjekte edilmiştir hayvanlarda elde edilebilir. Kimerizmin Belirtilen derecesi seçilir, ve bu kesim aşarak hayvanlar tümör başlangıcı veya diğer özellikle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Ve James Neiswender; Kristen Kwan ve bu çalışmada kullanılan plazmid hediyeler için geç Chi-Bin Chien;; antikor boyama ile ilgili yardım için James Lister ve David Raible Biz kimin laboratuar bu teknikleri başlangıçta geliştirilen Dr Leonard I. Zon ederim mikroenjeksiyon video. Bu çalışma CJC için NIH hibe R00AR056899-03 tarafından finanse edilmiştir
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Ağ Geçidi rekombinasyon reaktifler | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Referans 5 | ||
| Mitfa antikor | Referans 5 | ||
| FITC keçi anti-tavşan IgG antikoru | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vektör Labs | H-1000 | |
| casper Zebra balığı | Referans 9 | ||
| 701N 10 ul Şırınga | Hamilton / Fisher | 14-824 | |
| 40 um bir filtreden | BD Falcon / Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Kaynaklar
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M.,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
