Summary
Bir zebrafish otokton tümör modeli kullanılarak melanoma düzenleyiciler için ekran için hızlı bir şekilde sunulmaktadır. Bu melanosit aday melanom genlerin ifadesi için izin miniCoopR vektör yararlanır. Melanom sağkalım eğrileri, bir işgal testi, ölçek melanosit antikor boyama için bir protokol ve bir melanom nakli tahlil elde bir yöntem tarif edilmiştir.
Abstract
Insan kanserlerini Genomik çalışmalar tümörler 1,2,3 değişmiş genler hakkında bilgi bir zenginlik vermiştir. Bu çalışmalardan kaynaklanan bir zorluk birçok genin değişmiş olduğunu ve bu dönüşüm sırasında tesadüfen ortaya çıktığını gelen tümörogenez sürdü genetik bozukluklardan ayırt etmek zor olabilir. Bu ayrım çizmek için bunu kantitatif tümörler inat ve yaymak için izin tümör gelişimini ve diğer süreçlere değişmiş bir gen etkisini ölçebilen bir test olması faydalıdır. Burada melanom başlatılması ve bakımı için gerekli adımları kapsayan bir otokton tümör modeli 4 kullanarak zebrafish aday melanom değiştiriciler çok sayıda taranması için hızlı bir araç sunuyoruz. Bu tahlilde önemli bir reaktif olan bir ağ geçidi rekombinasyon kaset için çiftler mitfa melanosit şartname faktörünün bir vahşi-tip kopya miniCoopR vektör ki, burada aday haline melanomaliler genler 5 recombined. MiniCoopR vektör promotör, açık okuma çerçevesi ve yabani-tip mitfa geninin 3'-çevrilmemiş bölge içeren bir mitfa kurtarıcı minigene sahiptir. Bu bizi bir aday melanom modifiye tam boy açık okuma çerçeveleri ile yapılar yapmak için olanak sağlar. P53 (lf);; mitfa (lf) zebrafish embriyolar: Bu bireysel klonlar daha sonra tek hücre Tg (BRAF V600E mitfa) enjekte edilebilir. MiniCoopR vektör Tol2-aracılı transgenesis 6 ile entegre ve melanosit kurtarır alır. Fiziksel mitfa kurtarıcı minigene birleştiğinde Çünkü, aday genler dönüştürmek ve tümörler dönüşecek bazıları kurtarıldı melanosit olarak ifade edilmiştir. Melanom başlatılması ve melanom hücre özelliklerini bir aday genin etkisi melanom sağkalım eğrileri, invazyon deneyleri, antikor boyama ve transplantasyon yöntemleri kullanılarak ölçülebilir.
Protocol
1. Melanom Onset Değiştiricileri için Tarama
- PCR ilgi genlerinin tüm uzunlukta açık okuma çerçevesi (GOI) yükselterek ve BP klonaz II (Invitrogen) kullanılarak pDONR 221 içine yeniden birleştirilmesini ile orta ağ geçidi giriş klonlar oluşturur. MiniCoopR vektörü (Şekil 1A) mitfa organizatörü altında ilgi genleri yerleştirmek rekombinasyona p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 ve miniCoopR 5 Multisite Geçidi teknolojisi (Invitrogen) kullanın.
- Önceden 7 açıklandığı gibi mitfa (lf) triply homozigot zebrafish embriyolar; p53 (lf): tek hücreli Tg (BRAF V600E mitfa) içine 25 pikogram Tol2 transposase mRNA ile birlikte her klon 25 pikogram enjekte edilir. 28.5 enjekte edilen embriyolar inkübe ° C. 24 hpf herhangi ölü embriyolar çıkarın.
- Diseksiyon mikroskop üzerine enjekte embriyoları içeren Petri kabı koyarak 72 hpf at kurtarıldı melanosit ile transgenik hayvanlar seçinbeyaz bir arka plan (Şekil 1A) karşı gelen ışığı altında e.
- Önceden 8 açıklandığı gibi 4 dpf at zebrafish tesisin kreş 3 L tanklarına hayvanlar aktarın.
- 2 ay sonra, 4 mm 2 (Şekil 1A) 'den daha büyük bir melanosit kurtarma en az bir alana sahip hayvanlar seçin. 72 hpf de melanosit kurtarma derecesi ve 2 ay melanosit kurtarma derecesi arasında güçlü bir ilinti vardır. Melanosit kurtarma ile embriyolar 72 hpf azından seçilmiş olduğunda, bunların kısmı (~% 80) 2 ay azından 4 mm 2 'den daha büyük bir melanosit kurtarma en az bir alan vardır.
- Ekran tümörlerin varlığı (Şekil 1B) için haftalık seçilen hayvanlar. Histopatolojik ve morfolojik değişiklikler arasında güçlü bir ilişki vardır. Benign ve malign Geçiş lezyonların hayvanın yüzeyden yükseltilmiş haline bir morfolojik değişim olarak kabul edilmektedir. Tümörlü anima Isolateçalışma için ls.
- Ordinat üzerindeki apsis ve yüzde melanom sağkalım üzerine hafta içinde yaşla birlikte melanom sağkalım eğrileri çizin. Ilgi bir gen ifade melanosit Hayvanlar, kontrol hayvanlarına kıyasla olduğunu melanosit ekspres EGFP (gelişmiş yeşil flüoresan protein) (Şekil 1C). MiniCoopR-EGFP enjekte hayvanlar için medyan tümör başlangıcı yaklaşık 18 haftadır. Iki eğri bir log rank testi kullanılarak istatistiksel olarak farklı olup olmadığını belirleyin.
2. Tümör Invasion Assay
- Arka beyin ve sırt yüzgeci (Şekil 2A) anterior sınır posterior sınırı arasındaki bir bölgede, dorsal tümörler geliştirmek izole zebrafish seçin.
- Melanom başlangıçlı Massachusetts Tıp Fakültesi İnş Üniversitesi tarafından Ötenazi tarihinde Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Paneli tarafından belirlenen ve onaylanan yönergelere göre balık ötenazi İki hafta sonratitutional Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC). Solungaç hareket durana kadar Spesifik olarak, bir balık, 0.6 mg / ml 'tricaine ile bir çanak içine yerleştirilmiştir.
- Bir neşter ile balık periton boşluğunda bir kesi yapın ve sonra fiksasyonu için 4 ° C gecede% 4 paraformaldehid balık (PFA) yerleştirin.
- 4 gece boyunca 0.5 M EDTA ile tedavi ° C kirecini için.
- Gecede, 60 az 2 saat her biri için 2 kez ° C'de 1 saat boyunca ksilen 3 kez ile açık, 1 saat boyunca kurutmak ve daha sonra parafin ile tedavi kaset formalin ile tespit
- Bir kalıp içinde parafin içinde doku gömmek ve yaklaşık 30 dakika, 1 saat için katılaşmaya izin.
- 5 mikron bölümleri, bir her 50 mikron olun. Bölümler enine ve derin istila noktasına tespit edilebilir, böylece tüm lezyon aracılığıyla olmalıdır. Hematoksilen ve eozin boyama ile izleyin.
- Tümör hücreleri kollajen tabakanın compactum dışında kalır olmadığını ölçerek tümör invazyonu değerlendirin, dorsal içine işgalkas veya omurga (Şekil 2B, C) içine daha fazla işgal. Numunelerin iki takım arasında istatistiksel fark belirleyin.
3. Ölçek Melanositler Antikor Boyama
- 80 ml 0.1 M Na 2 HPO 4 ve 20 ml 0.1M NaH 2 PO 4 ile PO4 tamponu Makyaj. PH 7,3 olduğundan emin olun. 8.0 g sakkaroz, 0,15 ml 0,2 M CaCl2 ve 90 ml 0,2 M PO 4 tamponu, pH 7.3 ihtiva 2x düzeltme tampon Makyaj. Gerekli NaOH veya HCI ile 7.3 'e ayarlayın, sonra pH 4 tampon PO ile 100 mL'ye tamamlanır.
- 300 mg katı PFA kadar tartılır ve bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. PFA 4.5 x kütle, mg olarak (örn., 450 ul 5 mM NaOH ile 100 mg PFA) eşit bir hacim ile 5 mM NaOH ekleyin. Isı 60-70 ° C, PFA çözününceye kadar sallama sıra ile. Kalan partiküller aşağı spin ve 20% PFA süpernatant kurtarabilirsiniz. Taze her zaman olun.
- 1x fi içeren fiksasyon çözeltisi hazırlayınx tampon ve% 4 PFA.
- 0.17 mg / ml tricaine içinde balık anestetize.
- Keskin ince uçlu forseps kullanarak sırt pulları, koparmak bir diseksiyon mikroskobu altında olay ışık kullanarak ölçek melanosit içeren yarısı (Şekil 3A) zarar vermemeye özen. Direkt olarak 1 ml tespit çözeltisi ile oda sıcaklığında inkübe edin, içine forseps Sıra terazi açarken, ≥ 2 saat için. Balık suya balık aktarın ve başarılı kurtarma onaylamak için balık izlemek.
- Ağartıcı pigmentli melanosit oda sıcaklığında 5 dakika için PBST (1 x PBS, pH 7.4,% 0.1 Triton X-100) içinde 2 kez sabit terazi yıkamak için. DH 2 O ile 5 ml içinde 0.4 ml% 10 KOH ve 0.15 ml,% 30 H2O 2, içeren 1 ml taze yapılmış ağartıcı çözelti Tüplerinin açık patlama gaz önlemek için parafilm veya kapak kilitleri giy. Pigment (Şekil 3B, C) (10 dk tipik) gidene kadar beyazlatma devam edin. Oda sıcaklığında 5 dakika için PBST dört kez yıkayınerature.
- 1 x PBS, pH 7.4,% 0,2 Triton X-100, 2 mg / ml BSA,% 1 DMSO,% 0.02 NaN3,% 2 kuzu serumu oluşan blok çözelti içinde, en azından 30 dakika için Blok. HRP reaksiyon ile gelişmekte olmadığını NaN 3 dışarı bırakın.
- Gece boyunca oda sıcaklığında blok çözelti içinde birincil antikor ile inkübe edin. Bunları batık tutmak için numune üzerine çözelti en az 400 ul olması gerekir.
- Oda sıcaklığında PBST içinde 30 dakika için terazi 3 kez yıka.
- 2 saat oda sıcaklığında blok çözelti gece boyunca sekonder antikor ile inkübe edin.
- PBST + 0.1 uM DAPI ile 10 dakika boyayın.
- PBST ile 5 dk için 3 kere yıkayın.
- Ölçekler konkav slayt aşağı doğru bakacak şekilde vectashield bir damla bir cam slayt üzerine ölçekler monte ediniz ve onlar üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. Net oje ile slayt kenarları mühür ve bir floresan mikroskop (Şekil 3B, E, F, G altında slaytlar gözlemlemek
4. Transplantasyon Assay
- Transplantasyonu 10 öncesi gama ışınlaması 25 Gy ile bir gün aydınlatarak tarafından alıcıya 2-3 aylık casper 9 balık hazırlayın. Balık balık suda kurtarmak için izin ver.
- Daha önce açıklandığı gibi, bir tümör taşıyan balık (Bölüm 2.2) Euthanize.
- Tümör kes ve% 5 FBS ile 0.9x PBS sterilize yaklaşık 5 ml filtre ile bir Petri kabı koyun. Bir jilet çözüm ise tümörün zar.
- Oda sıcaklığında çalışmak, tek hücreler almak için P1000 pipet ile çiğnemek. % 5 FBS ile filtre sterilize 0.9x PBS ile hacmi 25 ml'ye kadar olun.
- 40 uM gözenekli filtre süzülür.
- 10 dk için 1500 rpm (453 rcf) bir Eppendorf 5810R tezgah üstü santrifüj içinde Spin.
- Süpernatantı ve kabaca istenen konsantrasyonu (100 mm 3 tümör için 10 7 hücre varsayalım) hücre süspansiyonu olun.
- T Hesaplao tam hücre sayısı, bir hemositometre kullanılarak ve nihai enjeksiyon hacmi yaklaşık 5 ul olacak şekilde hücre süspansiyonu seyreltin. 50.000 hücre enjekte edilmesi durumunda, örneğin, bir hücre süspansiyonu 10,000 hücre / ul nihai konsantrasyon ile seyreltilmelidir. Hücre süspansiyonu hücre kümelenmesi önlemek için her bir kaç dakika içeren tüp hafifçe vurun.
- 2-3 kez% 100 etanol ve 0.9x PBS ile bir 26s ölçer (konik ucu) 701 N 10 ul Hamilton şırınga yıkayın. Hücre süspansiyonu 5 ul ile şırınga yerleştirin.
- 0.17 mg / ml tricaine olarak ışınlanmış alıcı balık anestetize. Nemli Kimwipe üzerinde yan Yeri balık (Şekil 4A).
- Tek elle balık stabilize ve yaklaşık yarım arka beyin ve dorsal yüzgeç anterior sınır posterior sınırı arasındaki periton boşluğuna yukarıdaki balık kanadı içine 45 ° açıyla yukarı bakacak fasetli iğne takın. Yavaşça piston (Şekil 4B) basınız. </ Li>
- Balık taze balık suda kurtarma ve tümör engraftman (Şekil 4C) için günlük balık gözlemlemek için izin ver. Engraftman meydana gelmişse, sürekli büyüme ve hastalık gelişimi de görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücreli Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) zebrafish embriyolar melanom onkogen mitfa promotör kontrolü altında SETDB1 5 veya EGFP, her içeren miniCoopR vektörü ile enjekte edildi. Melanosit kurtarma olan embriyolar seçilir ve olgunlaşması için izin verildi. Melanosit kurtarma ile yaş hayvanların 2 ayda 4 mm 2 den büyük seçilmiştir. Hayvanlar melanomlar için haftalık tarandı. Yetişkinler için tümör oluşumunda eğrileri SETDB1 onkogen önemli ölçüde EGFP (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında hızlandırılmış melanom onsetas olduğunu göstermiştir. Arka beyin ve posterior sınır ve dorsal yüzgeç (Şekil 2A) ön sınırı arasındaki tümör gelişmiş Hayvanlar izole edildi. İki hafta melanom başlangıcından sonra onlar hematoksilen ve eozin ile kesitli ve lekeli un içine melanom işgali değerlendirmek üzere,% 4 paraformaldehid tespit edildidokuların derlying. SETDB1 ifade Melanomlar EGFP kontrolü melanomlar (Şekil 2C) daha lokal invaziv idi. Bir aday genin ifadesini aramak için, sırt terazi FITC işaretli keçi anti bir 1:1,000 seyreltme ardından Mitfa transkripsiyon faktörü tanıdığı bir primer antikor bir 1:100 seyreltme kullanılarak bir vahşi-tip zebrafish ve lekeli koparılan; -rabbit IgG antikoru (Şekil 3). MiniCoopR-EGFP enjekte mitfa (lf) balık; p53 (lf): Tümörün transplantability değerlendirmek için, melanom hücrelerinin bir Tg (BRAF V600E mitfa) izole edildi. 50.000 hücre subkutan 25 Gy gün önce ışınlanmış olan bir alıcıya casper mutant enjekte edildi. Yaş 2 hafta olarak, pigmente donör kaynaklı hücreler kolayca (Şekil 4) kabul edildi.
o: src = src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" / "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg">
Şekil 1. MiniCoopR tahlil kullanarak melanom başlangıçlı düzenleyiciler için tarama. MiniCoopR tahlil A) şematik. MiniCoopR vektör ve ilgi geni içeren kurtarıldı melanosit (ok başı) ile Embriyo. Ölçek bar = 250 uM. 4 mm 2 melanosit kurtarma (ok başı) daha büyük olan yetişkin. Ölçek bar = 500 uM B) MiniCoopR-EGFP amelanotik ve pigmentli tümör (ok başları) ile zebrafish kurtarıldı. C) Temsilci melanom sağkalım eğrisi onkogen SETDB1 ve kontrol EGFP gen ifade tümörler karşılaştırarak (p = 9.4 × 10 -7, logrank χ 2). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
"2.jpg />
Şekil 2. Tümör invazyonu denemesi. Arka beyin ve posterior sınır ve sırt yüzgeci anterior sınırı arasındaki dorsal tümör (ok başı) ile A) MiniCoopR-kurtarıldı zebrafish. Stratum compactum (SC), ölçekler, ölçek ilişkili melanosit (SAM) (inset, ölçek çubuğu = 50 uM), kas (M) ve spinal kolon (SPC) gösteren B) Enine kesit. Ölçek bar = 200 uM. C) non-invaziv miniCoopR-EGFP tümör (T) (solda) ve stratum compactuminto kas (M) ve omurga boyunca işgal etmiştir, bir miniCoopR-SETDB1 tümör (sağ) gösteren transversal kesitler. Ölçek bar = 200 uM.
Ölçek melanosit Şekil 3. Antikor boyama. A) ölçeklendirir anestezi miniCoopR-EGFP zebrafish koparıp ediliyor. Pigmente melanosit ve C ile B) Ağartılmamış ölçek) ağartılmış sminiCoopR-EGFP zebrafish gelen cale. Ölçek bar = 100 mcM. Ağartılmamış ölçek) D) Mitfa antikor ve E DAPI boyandı. Ağartılmış ölçek) Mitfa antikor ve G) F DAPI boyandı. Ölçek bar = 40 uM.
Şekil 4. Melanom hücrelerinin nakli. A) casper zebrafish Uninjected. Ölçek bar = 500 uM. Hemen 50.000 melanom hücrelerinin enjeksiyonundan sonra ışınlanmış bir casper alıcıya B) Subkutan transplantasyonu sitesi (ok başı). Ölçek bar = 200 uM. C) Işınlanmış casper alıcı iki hafta 50.000 melanom hücreleri ile enjeksiyon sonrası tümör engraftman (ok başı) gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiniCoopR yöntem zebrafish melanosit ilgi genlerinin ifadesini sağlar. Bu yaklaşım zebrafish mitfa geni hücre-özerk davrandığını aslında yararlanır. Bu nedenle, miniCoopR vektör tarafından kurtarıldı melanosit minigene ve fiziksel birleştiğinde ilgilendiren herhangi bir gen içeren kesin. Kurtarılan melanosit açıkça görülebilir ve tek hücreli embriyolar olarak enjekte edilmiştir hayvanlarda elde edilebilir. Kimerizmin Belirtilen derecesi seçilir, ve bu kesim aşarak hayvanlar tümör başlangıcı veya diğer özellikleri için atılır olabilir. MiniCoopR yöntemin önemli bir yararı yeterli kimerizm sahip hayvanlarda kolaylıkla belirlenebilir ve test edilen her çıkar genine karşılık gelen istikrarlı transgenik hatları elde etmek zorunda kalmadan atılır olabilir. Zaman, çaba ve masraf Ankete gereken ilgi genlerin sayısı ile orantılı olarak kaydedilir.
Daha önce 5 bildirildiği gibi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Ve James Neiswender; Kristen Kwan ve bu çalışmada kullanılan plazmid hediyeler için geç Chi-Bin Chien;; antikor boyama ile ilgili yardım için James Lister ve David Raible Biz kimin laboratuar bu teknikleri başlangıçta geliştirilen Dr Leonard I. Zon ederim mikroenjeksiyon video. Bu çalışma CJC için NIH hibe R00AR056899-03 tarafından finanse edilmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
