דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.
Abstract
מחקרים הגנומי של סרטן האנושי הניבו שפע של מידע על גנים ששינו בגידולי 1,2,3. אתגר נובע ממחקרים אלה הוא שגנים רבים הם שינו, וזה יכול להיות קשה להבחין שינויים גנטיים שהובילו tumorigenesis מאלה שהתעוררו במקרה במהלך הפיכה. כדי לצייר הבחנה זו היא מועילה יש assay שיכול כמותית למדוד את ההשפעה של גן השתנה בייזום גידול ותהליכים אחרים שייאפשרו גידולים להתמיד ולהפיץ. כאן אנו מציגים אמצעי מהיר כדי לסנן כמויות גדולות של מלנומה מכפילי מועמד בדג זברה באמצעות 4 מודל גידול כבני מקום שמקיפים את פעולות הנדרשות לייזום מלנומה ותחזוקה. מגיב מפתח בassay זה הוא וקטור miniCoopR, שזוגות העתקה פרועה סוג של גורם מפרט מלנוציט mitfa לקלטת רקומבינציה שער שאליו מל המועמדגני anoma ניתן recombined 5. וקטור miniCoopR יש minigene הצלת mitfa המכיל מקדם, מסגרת קריאה פתוחה ואזור 3'-מתורגם של גן mitfa פראי מהסוג. זה מאפשר לנו לבצע מבנים באמצעות מסגרות קריאה פתוחות באורך מלא של מלנומה מכפילי מועמד. שיבוטים בודדים אלה לאחר מכן ניתן להזריק לתוך תא Tg היחיד (mitfa: BRAF V600E); (LF) עוברי דג זברת mitfa; p53 (LF). וקטור miniCoopR מקבל משולב על ידי transgenesis Tol2 בתיווך 6 ומציל מלנוציטים. משום שהם מצמידים פיסיים mitfa הצלת minigene, גני המועמדים באים לידי הביטוי במלנוציטים חולצו, שחלקם יהפכו ולהתפתח לגידולים. ההשפעה של גן המועמד בייזום לנומה ומאפייני תא מלנומה ניתן למדוד באמצעות עקומות הישרדות ללא מלנומה, מבחני פלישה, מכתים נוגדן מבחני השתלה.
Protocol
1. הקרנה למכפילי התחילה מלנומה יצירת שיבוטי כניסה אמצעית Gateway באמצעות PCR הגברת המסגרת באורך מלא הפתוחה קריאה של גנים של עניין (GOI) ויצרף אל pDONR 221 באמצעות BP clonase השני (Invitrogen). השתמש multisite Gateway טכנולוגיה (Invitrogen) לrecombine p5E_mitfa,…
Representative Results
אחד תאי Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); (LF) עוברי mitfa דג זברה הוזרקו וקטור miniCoopR מכיל אונקוגן לנום SETDB1 5 או EGFP, כל אחד תחת השליטה של אמרגן mitfa. עוברים בעלי הצלת מלנוציט נבחרו ואפשרו לבוגרים. ב2 חודשים של גיל עם הצלת חי מלנוציט יותר מ 4 מ"מ 2 נבחרו. הח…
Discussion
שיטת miniCoopR מאפשרת ביטוי של גנים של עניין מלנוציטים דג זברה. גישה זו מנצלת את העובדה שגן mitfa דג הזברה פועל תא אוטונומי. מסיבה זו, מלנוציטים חולצו על ידי וקטור miniCoopR בטוחים כדי להכיל minigene וכל גן של עניין שאליו הוא מצמיד באופן פיזי. מלנוציטים הצילו הם נראים בבירור ונית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ליאונרד I. זון שבמעבדה שלו טכניקות אלו פותחו בתחילה; קריסטן קוואן ומאוחר צ'י סל Chien למתנות של פלסמידים משמשים בעבודה זו; ג'יימס ליסטר ודיוויד Raible לקבלת סיוע בצביעת נוגדנים, וג'יימס לNeiswender וידאו microinjection. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R00AR056899-03 לCJC
Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model. J. Vis. Exp. (69), e50086, doi:10.3791/50086 (2012).