Summary
मेलेनोमा एक zebrafish autochthonous ट्यूमर मॉडल का उपयोग संशोधक के लिए स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से जिस तरह से प्रस्तुत किया है. यह miniCoopR वेक्टर जो उम्मीदवार melanocytes में मेलेनोमा जीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है का लाभ लेता है. मेलेनोमा से मुक्त अस्तित्व घटता, एक आक्रमण परख पैमाने melanocytes के एंटीबॉडी धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल और एक मेलेनोमा प्रत्यारोपण परख प्राप्त करने के लिए एक तरीका वर्णित हैं.
Abstract
मानव कैंसर के जीनोमिक अध्ययन जीन कि 1,2,3 ट्यूमर में बदल रहे हैं के बारे में जानकारी का एक धन मिले. इन अध्ययनों से उत्पन्न होने वाली चुनौती यह है कि कई जीनों बदल रहे हैं, और यह आनुवंशिक परिवर्तन कि tumorigenesis से है कि उन परिवर्तन के दौरान संयोग पड़ी चलाई भेद करना मुश्किल हो सकता है. इस अंतर को आकर्षित करने के लिए यह फायदेमंद है एक परख है कि मात्रात्मक ट्यूमर दीक्षा और अन्य प्रक्रियाओं है कि ट्यूमर जारी रहती है और का प्रसार सक्षम पर एक बदल जीन के प्रभाव के उपाय कर सकते हैं. यहाँ हम एक तेजी से एक autochthonous ट्यूमर मॉडल 4 कि मेलेनोमा दीक्षा और रखरखाव के लिए आवश्यक कदम शामिल हैं का उपयोग कर zebrafish में उम्मीदवार मेलेनोमा संशोधक की बड़ी संख्या स्क्रीन का मतलब उपस्थित थे. इस परख में एक प्रमुख अभिकर्मक miniCoopR वेक्टर, जो एक गेटवे पुनर्संयोजन कैसेट जंगली प्रकार mitfa melanocyte विनिर्देश कारक की एक प्रतिलिपि जोड़ों उम्मीदवार जो मेल मेंAnoma जीन 5 recombined जा सकता है. इस miniCoopR वेक्टर एक mitfa बचाव minigene जो प्रमोटर, खुला पढ़ने फ्रेम और जंगली प्रकार mitfa जीन की 3'-untranslated क्षेत्र शामिल है. यह हमारे उम्मीदवार मेलेनोमा संशोधक की पूरी लंबाई खुला पढ़ने फ्रेम का उपयोग constructs बनाने के लिए अनुमति देता है. (वामो) p53; mitfa (वामो) zebrafish भ्रूण: ये व्यक्ति क्लोनों तो एकल कक्ष (BRAF V600E mitfa) टीजी में इंजेक्ट किया जा सकता है. miniCoopR वेक्टर Tol2 की मध्यस्थता transgenesis 6 से एकीकृत हो जाता है और melanocytes बचाता है. क्योंकि वे शारीरिक रूप से mitfa बचाव minigene मिलकर कर रहे हैं, उम्मीदवार जीनों बचाया melanocytes, जिनमें से कुछ को बदलने और ट्यूमर में विकसित में व्यक्त कर रहे हैं. मेलेनोमा दीक्षा और मेलेनोमा सेल गुण पर एक उम्मीदवार जीन के प्रभाव मेलेनोमा मुक्त अस्तित्व घटता, आक्रमण assays, एंटीबॉडी धुंधला हो और प्रत्यारोपण assays का उपयोग करके मापा जा सकता है.
Protocol
1. मेलेनोमा शुरुआत संशोधक के लिए स्क्रीनिंग
- पीसीआर हित के जीन के पूर्ण लंबाई खुला पढ़ने फ्रेम (भारत सरकार) amplifying और 221 pDONR में recombining बी.पी. clonase द्वितीय (Invitrogen) का उपयोग गेटवे बीच प्रविष्टि क्लोनों बनाएँ. Recombine p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 6 p3E_SV40polyA और miniCoopR 5 एकाधिक गेटवे प्रौद्योगिकी (Invitrogen) का उपयोग करने के लिए mitfa प्रमोटर के तहत ब्याज की जीन miniCoopR वेक्टर (चित्रा 1 ए) में जगह.
- P53 (वामो); mitfa (वामो) triply homozygous zebrafish भ्रूण के रूप में पहले से वर्णित 7: 25 Tol2 Transposase mRNA picograms के साथ एक सेल (BRAF V600E mitfa) टीजी में प्रत्येक क्लोन के 25 picograms इंजेक्षन. 28.5 में इंजेक्शन भ्रूण सेते डिग्री सेल्सियस 24 HPF में किसी भी मृत भ्रूण निकालें.
- पेट्री एक विदारक microscop पर पकवान युक्त इंजेक्शन भ्रूण रखने के द्वारा 72 HPF में बचाया melanocytes के साथ ट्रांसजेनिक जानवर का चयन करेंएक सफेद पृष्ठभूमि (चित्रा 1 ए) के खिलाफ घटना के प्रकाश के तहत ई.
- 4 DPF के रूप में पहले 8 वर्णित में zebrafish सुविधा के नर्सरी में 3 एल टैंक के लिए जानवरों स्थानांतरण.
- 2 महीने में melanocyte 4 2 मिमी (चित्रा 1 ए) की तुलना में अधिक बचाव के कम से कम एक क्षेत्र के साथ जानवरों का चयन करें. 72 HPF में मेलानोसाईट बचाव के डिग्री और 2 महीने में melanocyte बचाव की डिग्री के बीच एक मजबूत संबंध है. , जब melanocyte बचाव के साथ भ्रूण 72 HPF पर उठाया जाता है, उनमें से अधिकांश (~ 80%) melanocyte 2 महीने में 4 2 मिमी से अधिक बचाव के कम से कम एक क्षेत्र होगा.
- स्क्रीन चयनित ट्यूमर (चित्रा 1 बी) की उपस्थिति के लिए साप्ताहिक जानवरों. Histopathologic और शब्द के भागों परिवर्तन के बीच एक मजबूत संबंध है. सौम्य से घातक संक्रमण जब घावों पशु की सतह से उठाया हो जाते हैं एक शब्द के भागों परिवर्तन के रूप में मान्यता प्राप्त है. ट्यूमर असर एनिमा को अलगअध्ययन के लिए रास.
- सप्ताह में भुज और तालमेल पर मेलेनोमा से मुक्त अस्तित्व प्रतिशत पर उम्र के साथ मेलेनोमा मुक्त अस्तित्व घटता ड्रा. Melanocytes है कि ब्याज की एक जीन व्यक्त के साथ पशु के लिए पशुओं को नियंत्रित करने के लिए तुलना कर रहे हैं कि melanocytes में व्यक्त (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) EGFP (चित्रा 1C). miniCoopR-EGFP इंजेक्शन के साथ जानवरों के लिए औसत ट्यूमर शुरुआत लगभग 18 सप्ताह है. निर्धारित करें कि क्या दो घटता सांख्यिकीय अलग एक लॉग रैंक परीक्षण का उपयोग कर रहे हैं.
2. ट्यूमर आक्रमण परख
- पृथक zebrafish कि ट्यूमर पृष्ठीय पश्चमस्तिष्क और पृष्ठीय पंख (2A चित्रा) के पूर्वकाल सीमा के पीछे सीमा के बीच एक क्षेत्र में विकसित करने के लिए चयन करें.
- दो सप्ताह के बाद मेलेनोमा शुरुआत पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन इच्छामृत्यु पर पैनल द्वारा निर्दिष्ट और मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल इन्स विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार मछली euthanizetitutional पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC). विशेष रूप से, एक मछली एक डिश में 0.6 मिलीग्राम / एमएल tricaine के साथ रखा गया है जब तक gill आंदोलन बंद हो जाता है.
- एक स्केलपेल के साथ मछली की peritoneal गुहा में एक चीरा और तो 4% paraformaldehyde में मछली (पीएफए) के निर्धारण के लिए रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह.
- 0.5 एम EDTA के साथ 4 में रात भर इलाज डिग्री सेल्सियस अम्लो व्दारा कैल्सियम.
- कैसेट में formalin के साथ ठीक रातोंरात, 1 घंटे के लिए निर्जलीकरण, xylene 1 घंटा के लिए 3 बार के साथ स्पष्ट और फिर तेल के साथ व्यवहार 2 घंटा प्रत्येक के लिए 60 में 2 बार ° सी.
- मोल्ड में आयल में ऊतक एम्बेड और यह 30 मिनट से 1 घंटे के लिए जमना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- 5 सुक्ष्ममापी वर्गों, हर एक 50 सुक्ष्ममापी. अनुप्रस्थ वर्गों और पूरे घाव गहरी आक्रमण की बात इतनी है कि पहचाना जा सकता है के माध्यम से होना चाहिए. Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना द्वारा पालन करें.
- मापने है कि ट्यूमर कोशिकाओं collagenous परत compactum बाहर रहने के द्वारा ट्यूमर आक्रमण का आकलन करने के लिए, पृष्ठीय में आक्रमणमांसलता या स्पाइनल कॉलम (चित्रा 2 बी, सी) में आगे आक्रमण. नमूनों के दो सेट के बीच अंतर सांख्यिकीय निर्धारित.
3. स्केल melanocytes के एंटीबॉडी धुंधला
- 80 मिलीलीटर 0.1 एम ना 2 4 HPO और 20 मिलीलीटर 0.1M नाह 2 पीओ 4 के साथ PO4 बफर बनाओ. सुनिश्चित करें कि पीएच 7.3 है. 2x तय 8.0 जी sucrose, 0.15 मिलीग्राम 0.2M CACL 2 और 90 मिलीलीटर 0.2M पीओ 4 बफर, पीएच 7.3 से युक्त बफर बनाओ. यदि 7.3 के लिए आवश्यक NaOH या एचसीएल के साथ पीएच समायोजित तो पीओ 4 बफर के साथ 100 मिलीलीटर के लिए कर सकते हैं.
- 300 मिलीग्राम ठोस पीएफए करने के लिए वजन और एक microcentrifuge ट्यूब को जोड़ने. एक 4.5 पीएफए की एक्स जन मिलीग्राम में, (जैसे 450 उल 5 मिमी NaOH 100 मिलीग्राम पीएफए) के बराबर मात्रा 5 मिमी NaOH जोड़ें. 60-70 में हीट ° C सामयिक साथ मिलाते हुए जब तक पीएफए भंग कर रहा है. नीचे शेष particulates स्पिन और 20% की वसूली पीएफए तैरनेवाला. ताजा हर समय बनाओ.
- नियतन 1x फाई युक्त समाधान तैयारx बफर और 4% पीएफए.
- 0.17 मिलीग्राम / एमएल tricaine में मछली anesthetize.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत घटना के प्रकाश का उपयोग बांधना पृष्ठीय तेज ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग तराजू, देखभाल करने के लिए पैमाने के आधे melanocyte युक्त (चित्रा 3 ए) को नुकसान नहीं है. 1 मिलीग्राम निर्धारण समाधान और कमरे के तापमान पर सेते, में संदंश से सीधे प्लेस तराजू जबकि मोड़, ≥ 2 घंटा के लिए. स्थानांतरण मछली पानी में मछली और मछली पर नजर रखने के लिए सफल वसूली की पुष्टि करने के लिए.
- ब्लीच pigmented melanocytes PBST (1x पीबीएस पीएच 7.4, 0.1% ट्राइटन X-100) 2 बार में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए निश्चित तराजू धो लो. 1 मिलीलीटर जोड़ें ताजा बना ब्लीच 5 मिलीग्राम में DH 2 ओ के साथ 0.4 मिलीग्राम KOH 10% और 0.15 मिलीग्राम 30% 2 एच 2 हे युक्त समाधान ट्यूब खुला फोड़ से गैस को रोकने के लिए parafilm या टोपी ताले पर रखो. विरंजन जारी रखें जब तक वर्णक (10 मिनट विशिष्ट है) चला गया है (चित्रा 3B, सी). कमरे Temp पर 5 मिनट के लिए PBST चार बार में धोerature.
- ब्लॉक समाधान में कम से कम 30 मिनट 1x पीबीएस पीएच 7.4, और 0.2% ट्राइटन X-100, 2 मिलीग्राम / एमएल BSA DMSO 1%, 0.02% NaN 3 और 2% भेड़ का बच्चा सीरम के ऊपर बना लिए ब्लॉक. 3 NaN छोड़ अगर एचआरपी प्रतिक्रिया के साथ विकसित.
- कमरे के तापमान पर रातोंरात ब्लॉक समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. आप नमूनों पर समाधान के 400 μl कम से कम रखने के लिए उन्हें जलमग्न की जरूरत है.
- तराजू PBST में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3 बार धोएं.
- 2 घंटे से कमरे के तापमान पर ब्लॉक समाधान में रात भर के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
- PBST + 0.1 सुक्ष्ममापी DAPI के साथ 10 मिनट के लिए दाग.
- PBST साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
- Vectashield की एक बूंद में एक गिलास स्लाइड पर तराजू इतना माउंट कि तराजू के अवतल ओर स्लाइड की ओर नीचे चेहरे और उन पर एक कांच के कवर पर्ची जगह. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड के किनारों को सील और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 3 डी, ई, एफ, जी के तहत स्लाइड्स का निरीक्षण
4. ट्रांसप्लांटेशन परख
- गामा विकिरण का 25 Gy एक दिन पहले 10 प्रत्यारोपण के साथ irradiating प्राप्तकर्ता 2-3 महीने पुराने कैस्पर 9 मछली तैयार. मछली पानी में मछली को ठीक करने के लिए अनुमति दें.
- एक मछली ट्यूमर असर के रूप में पहले वर्णित (2.2 धारा) euthanize.
- बंद ट्यूमर काटें और एक पेट्री डिश में यह लगभग 5 मिलीलीटर 5% FBS साथ 0.9x पीबीएस निष्फल फिल्टर के साथ डाल दिया. जबकि समाधान में एक रेजर के साथ ट्यूमर पासा.
- कमरे के तापमान पर कार्य करना, एकल कक्षों प्राप्त करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ महीन चुर्ण बनाना. फिल्टर निष्फल 0.9x पीबीएस के साथ 25 मिलीलीटर की मात्रा 5% FBS के साथ बनाओ.
- 40 सुक्ष्ममापी जाल फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर.
- 10 मिनट के लिए 1,500 rpm (453 आरसीएफ) में एक Eppendorf 5810R tabletop अपकेंद्रित्र में स्पिन.
- तैरनेवाला निकालें और लगभग वांछित एकाग्रता (100 मिमी 3 ट्यूमर के लिए 10 7 कोशिकाओं को मान) सेल निलंबन.
- टी की गणनावह सही सेल नंबर एक hemocytometer का उपयोग कर और सेल निलंबन ताकि अंतिम इंजेक्शन की मात्रा लगभग 5 μl जलमिश्रित. उदाहरण के लिए, अगर 50,000 कोशिकाओं को इंजेक्शन जा रहे हैं, तो सेल निलंबन 10,000 कोशिकाओं / μl की एक अंतिम एकाग्रता पतला किया जाना चाहिए. सेल निलंबन कोशिकाओं के रोकने के लिए हर कुछ मिनट युक्त ट्यूब झटका.
- एक 26s (bevel टिप) गेज 701 N 10 μl हैमिल्टन सिरिंज 100% इथेनॉल और 0.9x पीबीएस के साथ 2-3 बार धोएं. सेल निलंबन के 5 μl के साथ सिरिंज लोड.
- 0.17 मिलीग्राम / एमएल tricaine में विकिरणित प्राप्तकर्ता मछली anesthetize. अपने पक्ष पर एक नम Kimwipe पर प्लेस मछली (4A चित्रा).
- एक हाथ से मछली स्थिर और पश्चमस्तिष्क और पृष्ठीय पंख के पूर्वकाल सीमा के पीछे सीमा के बीच आधे रास्ते के बारे में peritoneal गुहा ऊपर मछली की दिशा में एक 45 ° कोण पर ऊपर का सामना करना पड़ रहा बेवल के साथ सुई डालें. धीरे सवार (4B चित्रा) दबाना./ Li>
- मछली ताजा मछली पानी में ठीक करने के लिए अनुमति दें और मछली ट्यूमर engraftment (चित्रा 4C) के लिए दैनिक (नियम आदि का) पालन करना. यदि engraftment हुआ है, निरंतर विकास और रोग के विकास को भी देखा जा सकता है.
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Representative Results
एक सेल (mitfa: BRAF V600E) टीजी, p53 (वामो); mitfa (वामो) zebrafish भ्रूण miniCoopR मेलेनोमा ओंकोजीन 5 SETDB1 EGFP या mitfa प्रमोटर के नियंत्रण के तहत प्रत्येक युक्त वेक्टर इंजेक्शन के साथ थे. Melanocyte बचाव के साथ भ्रूण का चयन किया गया और परिपक्व अनुमति दी. Melanocyte बचाव के साथ 2 उम्र जानवरों के महीने में 4 2 मिमी से अधिक चयन किया गया था. जानवरों मेलानोमा के लिए साप्ताहिक जांच की गई. वयस्कों के लिए ट्यूमर घटना घटता दिखाया कि SETDB1 ओंकोजीन काफी EGFP नियंत्रण (1 चित्रा) की तुलना में मेलेनोमा onsetas त्वरित. पशु है जो पश्चमस्तिष्क के पीछे सीमा और पृष्ठीय पंख (2A चित्रा) के पूर्वकाल सीमा के बीच ट्यूमर विकसित अलग थे. मेलेनोमा शुरुआत के बाद दो हफ्ते वे 4% paraformaldehyde में तय किया गया है, संयुक्त राष्ट्र में sectioned और hematoxylin और लाल भामसान रंग के साथ दाग मेलेनोमा आक्रमण का आकलन करने के लिएऊतकों derlying. SETDB1 व्यक्त Melanomas अधिक EGFP नियंत्रण मेलानोमा (चित्रा 2C) की तुलना में स्थानीय स्तर पर आक्रामक थे. आदेश में एक उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति के लिए देखने के लिए, पृष्ठीय तराजू एक zebrafish जंगली प्रकार के दाग और एक प्राथमिक एंटीबॉडी के एक 1:100 कमजोर पड़ने कि Mitfa प्रतिलेखन कारक FITC बकरी विरोधी की एक 1:1,000 कमजोर पड़ने के द्वारा पीछा पहचानता का उपयोग कर से plucked थे खरगोश आईजीजी प्रतिरक्षी (3 चित्रा). P53 (वामो), (वामो) mitfa मछली miniCoopR-EGFP इंजेक्शन के साथ करने के लिए: ट्यूमर के transplantability का आकलन, मेलेनोमा कोशिकाओं एक टीजी (BRAF V600E mitfa) से अलग थे. 50,000 कोशिकाओं subcutaneously एक प्राप्तकर्ता कैस्पर उत्परिवर्ती है कि दिन विकिरणित किया गया था 25 Gy के साथ पहले में इंजेक्शन थे. उम्र के 2 सप्ताह तक, pigmented दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं को आसानी से (4 चित्रा) मान्यता प्राप्त किया गया.
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चित्रा 1 मेलेनोमा शुरुआत miniCoopR परख का उपयोग संशोधक स्क्रीनिंग के लिए. MiniCoopR परख के योजनाबद्ध ए). भ्रूण बचाया (arrowhead) melanocytes miniCoopR वेक्टर और ब्याज की जीन युक्त के साथ. पैमाने बार = 250 सुक्ष्ममापी. 4 मिमी 2 melanocyte बचाव (arrowhead) से अधिक के साथ वयस्क. पैमाने बार = 500 सुक्ष्ममापी) MiniCoopR EGFP अवर्णकयुक्त और एक pigmented ट्यूमर (तीर) के साथ एक zebrafish बचाया. (पी सी) प्रतिनिधि अस्तित्व मेलेनोमा मुक्त वक्र ओंकोजीन SETDB1 और एक नियंत्रण EGFP जीन व्यक्त ट्यूमर की तुलना 9.4 = 10 × -7, logrank χ 2). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2 ट्यूमर आक्रमण परख. ए) पश्चमस्तिष्क के पीछे सीमा और पृष्ठीय पंख के पूर्वकाल सीमा के बीच एक पृष्ठीय ट्यूमर (arrowhead) के साथ zebrafish MiniCoopR बचाया. बी) अनुप्रस्थ अनुभाग परत compactum (अनुसूचित जाति), तराजू, पैमाने जुड़े melanocyte (एसएएम) (इनसेट, पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी), मांसपेशियों (एम) और स्पाइनल कॉलम (SPC) दिखा. पैमाने बार = 200 सुक्ष्ममापी. सी) अनुप्रस्थ गैर इनवेसिव miniCoopR EGFP (T) ट्यूमर (बाएं) और एक miniCoopR SETDB1 (दाएं) ट्यूमर है कि परत compactuminto (एम) मांसपेशियों और स्पाइनल कॉलम के माध्यम से आक्रमण किया है दिखा वर्गों. पैमाने बार = 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 पैमाने melanocytes के एंटीबॉडी धुंधला हो जाना. ए) लीब्रा एक anesthetized miniCoopR EGFP zebrafish से plucked जा रहा है. बी) pigmented melanocytes और सी के साथ रूखा पैमाने) प्रक्षालित एसminiCoopR EGFP zebrafish से cale. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी. रूखा पैमाने डी) Mitfa एंटीबॉडी और ई के साथ दाग DAPI). प्रक्षालित पैमाने पर एक एफ के साथ दाग) Mitfa एंटीबॉडी और जी DAPI). पैमाने बार = 40 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4 मेलेनोमा कोशिकाओं के प्रत्यारोपण. ए) कैस्पर zebrafish Uninjected. पैमाने बार = 500 सुक्ष्ममापी. बी) एक विकिरणित कैस्पर प्राप्तकर्ता पर उपचर्म प्रत्यारोपण (arrowhead) 50,000 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन के बाद तुरंत साइट. पैमाने बार = 200 सुक्ष्ममापी. सी) विकिरणित कैस्पर प्राप्तकर्ता 50,000 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन के बाद दो सप्ताह ट्यूमर engraftment (arrowhead) दिखा.
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Discussion
miniCoopR विधि zebrafish melanocytes में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम बनाता है. इस दृष्टिकोण तथ्य यह है कि zebrafish mitfa जीन सेल autonomously में कार्य करता है का लाभ लेता है. इस कारण से, वेक्टर miniCoopR द्वारा बचाया melanocytes minigene और हित के लिए जो यह शारीरिक रूप से युग्मित है के किसी भी जीन शामिल करने के लिए कुछ कर रहे हैं. बचाया melanocytes स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और जानवरों है कि एकल कोशिका भ्रूण के रूप में थे इंजेक्शन में प्राप्त किया जा सकता है. काइमेरावाद का एक निर्दिष्ट डिग्री चुना है, और इस cutoff श्रेष्ठ जानवरों ट्यूमर शुरुआत या अन्य विशेषताओं के लिए रन किया जा सकता है. MiniCoopR विधि का एक बड़ा फायदा यह है कि पर्याप्त काइमेरावाद साथ जानवरों को आसानी से हो सकता है और पहचान की जा सकती है स्थिर ट्रांसजेनिक परीक्षण किया ब्याज के हर जीन इसी लाइनों को प्राप्त करने के लिए बिना रन बनाए. समय, प्रयास और खर्च सर्वेक्षण किया ब्याज की जीन की संख्या के अनुपात में बच रहे हैं.
5 के रूप में पहले से सूचना दी
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
और जेम्स Neiswender, िईद्भस्टेन Kwan और देर ची बिन plasmids के उपहार के लिए इस काम में इस्तेमाल Chien, जेम्स लिस्टर और एंटीबॉडी धुंधला के साथ सहायता के लिए दाऊद Raible हम डॉ. लियोनार्ड मैं Zon जिनकी प्रयोगशाला में इन तकनीकों को शुरू में विकसित किया गया धन्यवाद microinjection वीडियो. इस काम CJC NIH अनुदान R00AR056899-03 द्वारा वित्त पोषित किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
