Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone
Summary
Un modo rapido per lo screening del melanoma modificatori che utilizzano un modello di zebrafish tumore autoctona è presentato. Si avvale del vettore miniCoopR che permette l'espressione di geni candidati melanoma nei melanociti. Un metodo per ottenere melanoma senza curve di sopravvivenza, un saggio di invasione, un protocollo per la colorazione degli anticorpi dei melanociti di scala e di un saggio di trapianto melanoma sono descritti.
Abstract
Studi di genomica dei tumori umani hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui geni che sono alterati nei tumori 1,2,3. Una sfida derivante da questi studi è che molti geni sono alterati, e può essere difficile distinguere alterazioni genetiche che hanno spinto tumorigenesi da coloro che nasce accidentalmente durante la trasformazione. Per questa distinzione è utile avere un saggio che può quantitativamente misurare l'effetto di un gene alterato sull'iniziazione tumore e altri processi che consentono tumori di persistere e diffondere. Qui vi presentiamo un mezzo rapido per lo screening un gran numero di candidati modificatori di melanoma in zebrafish con un autoctono modello 4 tumore che comprende passaggi necessari per l'iniziazione melanoma e la manutenzione. Un reagente chiave in questo saggio è il vettore miniCoopR, che accoppia una wild-type copia del melanociti fattore specifica mitfa ad una cassetta di ricombinazione Gateway in cui candidato melAnoma geni possono essere ricombinati 5. Il vettore ha una miniCoopR minigene salvataggio mitfa che contiene il promotore, di lettura aperta e 3'-non tradotta regione del gene di tipo selvaggio mitfa. Ci permette di fare costrutti con full-length fasi di lettura aperta di modificatori melanoma candidati. Questi cloni singoli possono poi essere iniettato nella cella singola Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); mitfa (lf) embrioni di zebrafish. Il vettore miniCoopR viene integrata da Tol2-mediata transgenesi 6 e salva melanociti. Perché sono fisicamente accoppiati al salvataggio mitfa minigene, geni sono espressi in melanociti recuperati, alcuni dei quali si trasformano e svilupparsi in tumori. L'effetto di un gene candidato per l'inizio del melanoma e delle cellule di melanoma può essere misurato con melanoma senza curve di sopravvivenza, saggi di invasione, colorazione degli anticorpi e saggi di trapianto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo miniCoopR permette l'espressione di geni di interesse in melanociti zebrafish. Questo approccio sfrutta il fatto che il gene zebrafish mitfa agisce autonomamente cellulare. Per questo motivo, melanociti recuperati dal vettore miniCoopR sono certi di contenere il minigene e qualsiasi gene di interesse a cui è fisicamente accoppiati. Melanociti salvati sono chiaramente visibili e possono essere ottenuti in animali che sono stati iniettati come monocellulari embrioni. Una misura definita di chimeris…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Leonard I. Zon nel cui laboratorio queste tecniche sono state inizialmente sviluppate, Kristen Kwan e alla fine Chi-Bin Chien per i regali di plasmidi utilizzati in questo lavoro, James e David Lister Raible per l'assistenza con la colorazione degli anticorpi, e James Neiswender per la microiniezione video. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH R00AR056899-03 al CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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