Summary
Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.
Abstract
Los estudios genómicos de cáncer en humanos han arrojado una gran cantidad de información acerca de los genes que están alterados en los tumores 1,2,3. Un desafío que surge de estos estudios es que muchos genes están alterados, y puede ser difícil distinguir las alteraciones genéticas que impulsaron la tumorigénesis de aquellos que surgió incidentalmente durante la transformación. Para hacer esta distinción es beneficioso tener un ensayo que puede medir cuantitativamente el efecto de un gen alterado en la iniciación del tumor y otros procesos que permiten a los tumores a persistir y difundir. Aquí presentamos un medio rápido para detectar un gran número de candidatos modificadores de melanoma en el pez cebra utilizando un modelo de tumor 4 autóctona que abarca los pasos necesarios para la iniciación y el mantenimiento de melanoma. Un reactivo clave en este ensayo es el vector miniCoopR, que acopla una copia de tipo salvaje del factor de especificación mitfa melanocitos a un casete de recombinación Gateway en el que candidato melAnoma genes pueden ser recombinados 5. El vector miniCoopR tiene un minigen rescate mitfa que contiene el promotor, marco de lectura abierta y la región 3 'no traducida del gen de tipo salvaje mitfa. Nos permite hacer construcciones con larga duración marcos de lectura abierta de modificadores de melanoma candidatos. Estos clones individuales pueden ser inyectados en célula única Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra. El vector miniCoopR se integra por Tol2 transgénesis mediada 6 y rescata a los melanocitos. Debido a que están físicamente acoplado a la minigen mitfa rescate, genes candidatos se expresa en los melanocitos rescatadas, algunas de las cuales se transforman y se desarrollan en tumores. El efecto de un gen candidato en la iniciación melanoma y propiedades celulares de melanoma se puede medir usando libres melanoma curvas de supervivencia, los ensayos de invasión, tinción de anticuerpos y ensayos de trasplante.
Protocol
1. La detección de Onset Modificadores Melanoma
- Cree clones de entrada de puerta de enlace media por PCR amplificando el marco de cuerpo entero de lectura abierta de los genes de interés (GOI) y recombinación en pDONR 221 con BP Clonase II (Invitrogen). Use Multisite tecnología de Gateway (Invitrogen) para recombinarse p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 y miniCoopR 5 para colocar los genes de interés bajo el promotor en el vector mitfa miniCoopR (Figura 1A).
- Inyectar 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos Tol2 transposasa mRNA en una célula Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra triplemente homocigotos como se ha descrito previamente 7. Se incuban los embriones inyectados a 28,5 ° C. Retire los embriones muertos a las 24 HPF.
- Seleccione los animales transgénicos con melanocitos rescatados a 72 HPF, colocando la placa de Petri que contiene los embriones inyectados en una disección microscópicase con luz incidente sobre un fondo blanco (fig. 1A).
- Transfiera los animales a 3 tanques de L en el vivero de la instalación de pez cebra a 4 dpf a lo descrito previamente 8.
- A los 2 meses, seleccionar los animales con al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm 2 (Figura 1A). Hay una fuerte correlación entre el grado de rescate de melanocitos en 72 HPF y el grado de rescate de melanocitos a los 2 meses. Cuando los embriones con rescate de los melanocitos se recogió en 72 hpf, la mayoría de ellos (~ 80%) tendrá al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm 2 a los 2 meses.
- Pantalla de los animales seleccionados semanales para detectar la presencia de tumores (Figura 1B). Hay una fuerte correlación entre los cambios histopatológicos y morfológicas. Transición de benigno a maligno se reconoce como un cambio morfológico cuando las lesiones se elevó fuera de la superficie del animal. Aislar anima con el tumorls de estudio.
- Dibujar libres melanoma curvas de supervivencia con la edad en semanas en las abscisas y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Los animales con los melanocitos que expresan un gen de interés se comparan con los animales control que expresa EGFP (proteína verde fluorescente) en los melanocitos (Figura 1C). La aparición de tumores mediana para los animales inyectados con miniCoopR-EGFP es de aproximadamente 18 semanas. Determinar si las dos curvas son diferentes estadísticamente mediante la prueba de log-rank.
2. Ensayo de invasión tumoral
- Seleccione pez cebra aislado que desarrollan tumores dorsalmente, en una región entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal (Figura 2A).
- Dos semanas después de la aparición del melanoma eutanasia a los peces según las directrices especificadas por la American Veterinary Medical Association Panel sobre la eutanasia y aprobado por la Universidad de Massachusetts Medical School InsCuidado de Animales y el empleo Comisión titucional (IACUC). Específicamente, un pez se coloca en un plato con 0,6 mg / ml hasta tricaína movimiento branquial se detiene.
- Hacer una incisión en la cavidad peritoneal de los peces con un escalpelo y luego coloque el pescado en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° C para su fijación.
- Tratar con 0,5 M EDTA durante la noche a 4 ° C para descalcificar.
- Fijar con formalina en casete durante la noche, se deshidratan durante 1 hora, claro con xileno 3 veces durante 1 hora y luego se trata con parafina 2 veces durante 2 horas cada una a 60 ° C.
- Insertar el tejido en parafina en un molde y dejar que se solidifique durante 30 min a 1 hr.
- Hacer 5 micras secciones, una cada 50 micras. Las secciones deben ser transversal y a través de toda la lesión para que el punto más profundo de invasión puede ser identificado. Siga con hematoxilina y eosina.
- Evaluar la invasión tumoral midiendo si las células tumorales permanecen fuera de la colágena compactum estrato, invadir la dorsalmusculatura o invadir adicional en la columna vertebral (Figura 2B, C). Determinar la diferencia estadística entre los dos grupos de muestras.
3. Antibody tinción de melanocitos Escala
- Maquillaje PO4 tampón con 80 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 y 20 ml de 0,1 M NaH 2 PO 4. Asegúrese de que el pH es de 7,3. Maquillaje solución tampón 2x que contiene 8,0 g de sacarosa, 0,15 ml 0,2 M CaCl 2 y 90 ml de 0,2 M tampón de PO 4, pH 7,3. Si es necesario ajustar el pH a 7,3 con NaOH o HCl completar hasta 100 ml con tampón de PO 4.
- A pesar hasta 300 mg PFA sólido y añade a un tubo de microcentrífuga. Añadir 5 mM NaOH a un volumen igual a la masa x 4,5, en mg, de PFA (por ejemplo, 450 ul 5 mM NaOH a 100 mg PFA). Se calienta a 60-70 ° C con agitación ocasional hasta que el PFA se disuelve. Decantar las partículas restantes y recuperar el 20% PFA sobrenadante. Haga fresca cada vez.
- Preparar la solución de fijación que contiene 1x fix tampón y 4% PFA.
- Se anestesia el pescado en 0,17 mg / ml tricaína.
- Usando la luz incidente bajo un microscopio de disección arrancar escamas dorsales agudas utilizando pinzas de punta fina, teniendo cuidado de no dañar el medio que contiene los melanocitos de la escala (Figura 3A). Escalas lugar directamente desde las pinzas en 1 ml de solución de fijación y se incuba a temperatura ambiente, mientras se gira, por ≥ 2 hr. Transferir el pez en el agua los peces y controlar a los peces a confirmar una recuperación exitosa.
- Para blanquear melanocitos pigmentados lavar escalas fijas en PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de lejía recién preparada que contiene 0,4 ml de solución de KOH al 10% y 0,15 ml de 30% de H 2 O 2 en 5 ml de dH 2 O. Ponga cerraduras Parafilm o gorra para evitar que el gas se rompa los tubos abiertos. Continuar hasta decoloración de pigmento se ha ido (10 min es típico) (Figura 3B, C). Lavar cuatro veces en PBST durante 5 min a temperatura ambientetura.
- Bloquear por lo menos durante 30 minutos en solución de bloqueo compuesta por 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN 3 y 2% suero de cordero. Dejar de lado NaN 3, si el desarrollo de la reacción con HRP.
- Incubar con anticuerpo primario en solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Debe tener al menos 400 l de solución sobre las muestras para mantenerlas sumergidas.
- Lavar las escalas 3 veces durante 30 minutos en PBST a temperatura ambiente.
- Incubar con anticuerpo secundario de 2 horas a toda la noche en solución de bloqueo a temperatura ambiente.
- Teñir durante 10 min con PBST DAPI mu M + 0,1.
- Lavar 3 veces durante 5 min con PBST.
- Montar la balanza sobre un portaobjetos de vidrio en una gota de Vectashield de modo que el lado cóncavo de la balanza está orientado hacia abajo hacia el portaobjetos y colocar un cubreobjetos de cristal sobre ellos. Selle los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas transparente y observar las diapositivas con un microscopio de fluorescencia (Figura 3 D, E, F, G
4. Trasplante de Ensayo
- Preparar destinatario 2-3 meses de edad casper 9 peces por irradiación con 25 Gy de irradiación gamma, un día antes del trasplante 10. Permitir a los peces a recuperarse en el agua los peces.
- Eutanasia a un pez portador del tumor como se ha descrito anteriormente (Sección 2,2).
- Corte el tumor y lo puso en una caja de Petri con filtro de aproximadamente 5 ml de PBS esterilizado 0.9x con FBS al 5%. Cortar el tumor con una maquinilla de afeitar mientras está en solución.
- Trabajando a temperatura ambiente, se tritura con una pipeta P1000 para obtener células individuales. Completar el volumen a 25 ml con PBS esterilizado por filtración 0.9x con FBS al 5%.
- Filtrar a través de filtro de 40 de malla.
- Haga girar en una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 fcr) durante 10 min.
- Eliminar el sobrenadante y crea suspensión de células a la concentración de aproximadamente deseado (suponga 10 7 células para un 100 mm 3 tumor).
- Calcular tque el número de células exacta usando un hemocitómetro y se diluye la suspensión de células de modo que el volumen de inyección final es de aproximadamente 5 l. Por ejemplo, si las células son 50.000 a inyectar, la suspensión celular se diluyó a una concentración final de 10.000 células / mL. Flick el tubo que contiene la suspensión de células cada pocos minutos para evitar la aglutinación de las células.
- Lave un calibre 26s (punta biselada) jeringa l 701 N 10 Hamilton 2-3 veces con etanol al 100% y PBS 0.9x. Cargar la jeringa con 5 l de la suspensión celular.
- Se anestesia el pez receptor irradiado en 0,17 mg / ml tricaína. Coloque el pescado en su lado en una Kimwipe húmedo (Figura 4A).
- Estabilizar el pescado con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 ° en el flanco del pez encima de la cavidad peritoneal a medio camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. Suavemente el émbolo (Figura 4B). </ Li>
- Permiten a los peces recuperar en peces de agua dulce y observar los peces diaria para el injerto del tumor (Figura 4C). Si el injerto se ha producido, el continuo crecimiento y desarrollo de la enfermedad también puede ser observado.
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Representative Results
Uno de células Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra fueron inyectados con el vector que contiene el oncogén miniCoopR melanoma SETDB1 5 o EGFP, cada uno bajo el control del promotor mitfa. Los embriones con rescate de melanocitos se seleccionaron y se dejó madurar. A los 2 meses de edad de los animales con rescate de melanocitos mayor que 4 mm 2 fueron seleccionados. Los animales fueron examinados semanalmente para melanomas. Curvas tumorales de incidencia de los adultos mostró que el oncogén SETDB1 significativamente acelerado onsetas de melanoma en comparación con el control de EGFP (Figura 1). Los animales que desarrollaron tumores entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal (Figura 2A) se aislaron. Dos semanas después del inicio de melanoma se fijaron en paraformaldehído al 4%, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina para evaluar la invasión de melanoma en la ONUsubyacente tejidos. Los melanomas que expresan SETDB1 eran más localmente invasiva que la EGFP control de melanomas (Figura 2 C). Con el fin de buscar la expresión de un gen candidato, escamas dorsales fueron arrancadas de un pez cebra de tipo salvaje y se tiñeron con una dilución 1:100 de un anticuerpo primario que reconoce el factor de transcripción Mitfa seguido de una dilución 1:1,000 de cabra anti FITC -IgG de conejo de anticuerpos (Figura 3). Para evaluar transplantability del tumor, las células de melanoma se aislaron de una Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); pescado mitfa (LF) inyectados con miniCoopR-EGFP. 50.000 células fueron inyectadas por vía subcutánea en un mutante receptor casper que había sido irradiado el día anterior con 25 Gy. A las 2 semanas de edad, pigmentadas células derivadas del donante fueron reconocidos fácilmente (Figura 4).
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Figura 1. Detección de modificadores de inicio de melanoma utilizando el ensayo miniCoopR. A) Representación esquemática del ensayo de miniCoopR. Embrión con melanocitos rescatados (punta de flecha) que contienen el vector miniCoopR y el gen de interés. Barra de escala = 250 m. Adulto con mayor que 4 mm 2 rescate de melanocitos (punta de flecha). Barra de escala = 500 mM B) MiniCoopR-EGFP rescatado pez cebra con una amelanótico y un tumor pigmentado (puntas de flecha). C) Representante melanoma sin curva de supervivencia comparando los tumores que expresan SETDB1 oncogén y un control del gen EGFP (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Figura 2. Ensayo de invasión tumoral. A) MiniCoopR rescatada por el pez cebra con un tumor dorsal (punta de flecha) entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. B) Sección transversal mostrando estrato compacto (SC), las escalas, la escala asociada a los melanocitos (SAM) (bar inserción, escala = 50 mM), músculo (M) y la columna vertebral (SPC). Barra de escala = 200 m. C) Las secciones transversales que muestran un no-invasivo miniCoopR-EGFP tumor (T) (izquierda) y un miniCoopR-SETDB1 tumor (a la derecha) que ha invadido a través del músculo estrato compactuminto (M) y la columna vertebral. Barra de escala = 200 m.
Figura 3. La tinción de anticuerpos de los melanocitos escala. A) Las escalas están sacados de un anestesiado miniCoopR-EGFP pez cebra. B) escala sin blanquear con melanocitos pigmentados y C) s blanqueadacale-EGFP miniCoopR de pez cebra. Barra de escala = 100 m. Escala Crudos tiñeron con una D) de anticuerpos Mitfa y E) DAPI. Escala blanqueado teñido con una F) Mitfa anticuerpos y G) DAPI. Barra de escala = 40 m.
Figura 4. Trasplante de células de melanoma. A) sin inyectar el pez cebra casper. Barra de escala = 500 m. B) Vía subcutánea trasplante sitio (punta de flecha) en un recipiente casper irradiado inmediatamente después de la inyección con 50.000 células de melanoma. Barra de escala = 200 m. C) destinatario casper irradiado que muestra el injerto del tumor (cabeza de flecha) dos semanas después de la inyección con 50.000 células de melanoma.
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Discussion
El método miniCoopR permite la expresión de genes de interés en los melanocitos de pez cebra. Este enfoque tiene la ventaja del hecho de que el gen de pez cebra mitfa actúa células autónoma. Por esta razón, los melanocitos rescatadas por el vector miniCoopR son determinados para contener el minigen y cualquier gen de interés al que está acoplado físicamente. Melanocitos rescatados son claramente visibles y pueden ser obtenidos en los animales que fueron inyectados como una sola célula de los embriones. Un grado específico de quimerismo se ha seleccionado, y los animales que sobrepasan este límite se puede marcar el inicio de tumor u otras características. Una ventaja importante del método miniCoopR es que los animales con quimerismo suficiente pueden ser fácilmente identificados y anotó sin tener que obtener líneas transgénicas estables correspondientes a cada gen de interés probado. Tiempo, esfuerzo y gasto se guardan en proporción al número de genes de interés para la encuesta.
Como se informó previamente 5
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Leonard I. Zon en cuyo laboratorio estas técnicas fueron desarrolladas inicialmente; Kwan Kristen y el difunto Chi-Bin Chien para los regalos de los plásmidos utilizados en este trabajo, James Lister y Raible David para obtener ayuda con la tinción de anticuerpos, y por James Neiswender el vídeo de microinyección. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R00AR056899-03 a CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
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