Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Published: March 6, 2013 doi: 10.3791/50141
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

Summary

الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء التي هي مناسبة لتحليل الهيكلية التي كتبها صدى حل المغناطيسي النووي (NMR) والتطبيقات التحليلية الأخرى.

Abstract

التفاعلات الجسدية بين المجالات ألفا حلزونية للدهون، بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من لعب دورا حاسما في للطي والتجمع مجمعات البروتين غشاء والعمليات الدينامية في مثل عبر الغشاء (TM) إشارات وتنظيم مستويات البروتين على سطح الخلية. فهم السمات الهيكلية قيادة رابطة تسلسل معين يتطلب تحليلات متطورة البيوكيميائية البيوفيزيائية والمجمعات الببتيد TM. ومع ذلك، فإن hydrophobicity متطرفة من المجالات TM يجعل من الصعب جدا على التعامل مع تقنيات الكيمياء باستخدام معيار الببتيد، وإنتاج المواد الدراسية مناسبة غالبا ما يثبت التحدي باهظة. تحديد الظروف التي يمكن أن الببتيدات اعتماد التشكل حلزونية الشكل مستقرة والمجمعات يضيف تلقائيا على مستوى مزيد من الصعوبة. هنا نقدم إجراء لإنتاج وطي أو مثنوي مغاير المجمعات الببتيد TM من المواد التي يتم التعبير عنها في E. مضيق بين قمتينالأول، مما يسمح بإدراج تسميات النظائر المستقرة لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو غير الطبيعية الأحماض الأمينية لتطبيقات أخرى غير مكلفة نسبيا. والابتكار الرئيسي في هذا الأسلوب هو أن يتم إنتاج مجمعات TM وتنقيته والتجمعات (ثاني كبريتيد-crosslinked) المرتبطة تساهميا التي يمكن أن تشكل هياكل مستقرة، والقياس المتكافئ متجانسة عندما أعيد إلى الدهون والمنظفات أو غيرها من المواد غشاء المحاكاة. نقدم أيضا إجراءات بعناية الأمثل للتعبير وتنقية التي تنطبق على قدم المساواة سواء المنتجة أو واحدة المجالات TM المجمعات crosslinked وتقديم المشورة للتكيف هذه الأساليب لتسلسل TM الجديدة.

Introduction

تفاصيل هذا البروتوكول إجراء ضعنا لإنتاج ثاني كبريتيد المجمعات استقرت عبر الغشاء من الببتيدات (TM) للدراسات الهيكلية باستخدام NMR الحل. الإجراء يستفيد من التعبير القوي التي يوفرها نظام الانصهار ΔtrpLE1413 (انظر أدناه)، ويسمح إنشاء المجمعات الببتيد TM تكوين المعرفة باستخدام تقنيات متطورة وضع العلامات النظائر مستقرة-NMR لتجارب حديثة متعددة الأبعاد. لقد استخدمنا هذه التقنيات لتحديد هياكل NMR عدة كشفت معلومات جديدة هامة حول كيفية تجميع الخلايا اللمفاوية-تفعيل immunoreceptors من عدة مفارز بروتين الغشاء من خلال التفاعل بين المجالات التي TM (مشاركة مؤخرا في 1). هذه التقنيات قابلة للتطبيق على العديد من أنظمة البروتين الغشاء، فضلا عن مجموعة واسعة من الأساليب التحليلية المصب بالإضافة إلى NMR الحل. في حين أن المثال المذكور هنا يستخدم بقايا السيستين الأصليلإنشاء مجمع الذي يحاكي بشكل طبيعي ثاني كبريتيد العبودي البروتين، وتصميم على ما يرام أيضا مناسبة لخلق السندات ثاني كبريتيد هندسيا لتحقيق الاستقرار في المجمعات التي تقام عادة معا عن طريق أضعف التفاعلات غير التساهمية، مثل هومو ومثنوي مغاير المجمعات TM من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) بين أفراد الأسرة أو البروتينات 2-4 heterodimeric αβ المجمعات إنتغرين 5،6.

تسلسل الببتيد مسعور للغاية مثل تلك المستمدة من الدهون طبقة ثنائية، والتي تمتد أجزاء من البروتينات TM هي الموضوعات الصعبة للغاية للدراسات كيميائية حيوية والفيزيائية الحيوية. بالإضافة إلى كونها صعبة للغاية لمعالجة باستخدام البروتين القياسية وتقنيات الكيمياء الببتيد، فإنها غالبا ما تكون سامة جدا للخلايا وبالتالي فهي صعبة لإنتاج recombinantly. نحن 7،8 9-11 وغيرها كان لها كبير معربا عن نجاح هذه تسلسل الببتيد الصعب في البكتيريا كما هو الحال في الإطار كربوكسي لمحطةاندماج لنسخة معدلة من تسلسل ΔtrpLE1413 المستمدة من E. القولونية الحزب OPERON 12. يمكن أن تنتج عن ببتيد ~ 13 كيلو دالتون trpLE المشفرة بواسطة هذا التسلسل عند مستويات مرتفعة في ظل المروج T7 ويتم ترجمة تماما لإدراج الهيئات حيث يتم التحايل المشاكل المتعلقة سمية و / أو عدم الاستقرار. تعديل تسلسل إضافة محطة الأمينية 9-13 و الحامض الاميني العلامة القضاء على بقايا ميثيونين الداخلية والسيستين من تسلسل 14 trpLE يسمح trpLE الببتيد اندماج ليكون منقى من قبل اللوني تقارب المعادن ايون وهضمها باستخدام بروميد السيانوجين (CNBr ) للافراج عن تسلسل الببتيد المطلوب. وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح للتعبير عن أكثر من اثني عشر سلاسل مختلفة مثل اندماج trpLE تمثل شظايا البروتين غشاء التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة مجالات TM (7،8 والنتائج غير المنشورة، وانظر أيضا قسم المناقشات).

الالابتكار الرئيسية في هذا البروتوكول هو تحديد الشروط التي بموجبها غير منظم وقابل للذوبان جدا سيئة trpLE-TM اندماج يمكن أن يكون بكفاءة ثاني كبريتيد-crosslinked في سياق تبسيط العمل. كما تم عدة جوانب ذات الإنتاجية العالية المناولة والتعبير وتنقية المنتجات الببتيد الأمثل بدقة، والتوصيات المقدمة هنا هي نفس القدر من الأهمية لإنتاج ثاني كبريتيد غير crosslinked-(أحادى) منتجات الببتيد TM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ وتصميم تعبيد

استنساخ متواليات من الفائدة في ناقلات PMM الببتيد (التي يمكن توفيرها حسب الطلب) باستخدام HindIII والمواقع تقييد BamHI (انظر الشكل 1). وينبغي إدراج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي تتضمن، وفقا للترتيب التالي: موقع HindIII؛ كودون واحد وميثيونين لانشقاق CNBr، وE. القولونية كودون الأمثل الببتيد تسلسل الترميز؛ لكودون وقف؛ موقع BamHI. ينبغي القضاء على جميع methionines أخرى في الببتيد وينبغي تجنب تسلسل ثنائي الببتيد ASP المؤيد وسوف أيضا أن المشقوق في الظروف الحمضية.

وينبغي الأخذ A بقايا السيستين فريدة من نوعها في كل تسلسل الببتيد وفقا لتحديد المواقع المطلوب من ثاني كبريتيد تشعبي في مجمع النهائي، وينبغي تحور جميع cysteines أخرى لسيرين. البلازميد يحمل كاسيت المقاومة الكاناميسين للاختيار.

2. التعبير عن trpLE-peptiدي فيوجن

  1. وتشكل العقيمة مرشح M9/Kan المتوسطة النمو ضئيلة (0.1 ملي CaCl 2، 2 مم MgSO 4، 3 ز / L KH 2 PO 4، 7.5 غ / L نا 2 HPO 4 · 2H 2 O، 0.5 جم / L كلوريد الصوديوم، 1 غرام / لتر كلور NH 4، 4 ز / L الجلوكوز، 50 كبريتات الكاناميسين ملغ / L). تكملة مع سنتروم الزنك لإكمال لتوفير B-الفيتامينات والمعادن النزرة: حل 1 قرص في 40 مل O 2 H مع خلط لمدة 30 دقيقة، الطرد المركزي لإزالة المواد غير القابلة للذوبان ومعقمة تصفية طاف البرتقال متجر في محلول C ° 4 في الظلام لتصل إلى 2 أسابيع، واستخدام 4 مل / لتر في M9.
    ملاحظة: قد يتم تضمين 15 N التخصيب NH 4 الكلورين، 13 C-المخصب الجلوكوز أو غيره من السلائف مستقرة-النظائر التي تحمل علامات في M9 المتوسطة في هذه المرحلة اذا شئت.
  2. تطعيم 100 مل ثقافة كاتب من تحول حديثا BL21 E. سلالة (DE3) الإشريكية المتوسطة في M9/Kan. تنمو بين عشية وضحاها في C ° 37 مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  3. في صباح اليوم التالي، والتحقق من OD 600 من ثقافة كاتب - هذا ينبغي أن يكون في حدود 2 أو أكبر. تمييع الثقافة 100 مل كاتب في حجم L 1-سنتروم مجموعه M9 تستكمل المتوسطة. انقسم الى اثنين قوارير L 2 حيرة (500 مل الثقافة في كل قارورة) وينمو بمعدل 37 ° C عند 140 دورة في الدقيقة تهتز حتى تصل إلى 600 OD 0.6.
  4. تعيين درجة الحرارة إلى 18 ° شاكر C وتستمر لتهز 1 ساعة، والسماح لتبرد تماما الثقافات قبل التعريفي.
  5. أخذ عينة ما قبل التوجيهي للSDS-PAGE تحليل (ما يعادل 50 ميكرولتر من ثقافة في OD 600 = 1)، ثم يضاف إلى تركيز IPTG 0.1 ملم النهائي للحث على التعبير عن الانصهار trpLE الببتيد. تواصل نموها في 18 ° C/140 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها (16-20 ساعة) تحت تحريض IPTG.

3. إدراج إعداد الجسم والنيكل ربط مصفوفة

  1. وOD النهائي 600 من الثقافات بين عشية وضحاها في التعبير المتوسطة الحد الأدنى هو متغير وSHOULD يكون بين 2.5 و 5.0. أخذ عينة للتحليل SDS-PAGE (ما يعادل 50 ميكرولتر من ثقافة في OD 600 = 1) وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في ز X 5،000.
  2. إعادة تعليق بيليه الخلية من الثقافة L 1 في 50 مل العازلة تحلل (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 20 ملي β-ME، 0.2 M كلوريد الصوديوم). ويمكن تخزين تعليق خلية مجمدة لتجهيز في وقت لاحق.
  3. ليز الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد في الطاقة الإنتاجية القصوى لمدة 1 دقيقة والباقي على الجليد لمدة 5 دقائق. نستخدم Sonicator Misonix 3000 (خرج 600 واط كحد أقصى) مع طرف ½ بوصة عالية الكثافة للاستبدال. تكرار صوتنة / التبريد لمدة ثلاث دورات.
  4. جمع غير قابلة للذوبان إدراج الجسم (IB) المواد بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في XG 20000 وتجاهل طاف. ويجوز للفضفاضة، طبقة رقيقة من الخلايا الحطام الفاتحة تكون مرئية على رأس بيليه IB كثيفة، ويمكن غسلها بعيدا عن استخدام المياه أو المخزن المؤقت مع الإثارة لطيف. يمكن تكرار الخطوات 3.3 و 3.4 لتحسين نقاء الكسر إذا IB منتدياتالحمراء. ينبغي أن تؤخذ عينات من المواد وطاف بيليه لتحليل SDS-PAGE لتأكيد trpLE-TM توطين الانصهار للهيئات إدراج.
  5. حل الكريات في محلول IB غوانيدين (6 M الجوانيدين حمض الهيدروكلوريك، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، تريتون 1٪ X-100، 5 ملي β-ME)، وذلك باستخدام 25-50 مل لكل لتر من الثقافة معالجتها. وهذه الخطوة تتطلب عدة ساعات مع الانفعالات وصوتنة خفيفة في بعض الأحيان.
  6. مسح المحللة IB بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة عند 75،000-100،000 XG ° C. و 20 صب طاف وفلتر من خلال غشاء ميكرون 0.2.
  7. الجمع بين مسح IB المحللة، في أنبوب 50 مل المخروطية أو أكبر سفينة يمكن إغلاق آمن، مع الراتنج تقارب النيكل التي تم غسلها بالماء ومعايرتها لحل الجوانيدين. استخدام الراتنج 3-4 مل لكل لتر من استقر الثقافة المجهزة للاندماج التي تعبر عن لدرجة مماثلة لtrpLE-DAP12TM هو موضح هنا (الشكل 3، لين 2). ربط دفعة من احتضان بين عشية وضحاها في غرفة ر emperature مع خلط لطيف.

4. على العمود مؤكسد يشابك

  1. تحميل التعليق IB الراتنج المحللة / النيكل في عمود خطورة تدفق فارغة بدعم السرير يسهل اختراقها، مضيفا مستمر حتى وحدة التخزين بالكامل من خلال تدفقات. جمع وطرح جانبا flowthrough، والتي قد لا تزال تحتوي على البروتين الانصهار غير منضم.
  2. غسل الراتنج النيكل من تدفق الجاذبية مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا (8 M اليوريا و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم) تحتوي على 5 ملي β-ME.
  3. غسل الراتنج النيكل مرة أخرى مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا دون ME-β.
  4. غسل الراتنج النيكل مرة الثالثة مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا الذي تم تستكمل مع 20 ميكرون كبريتات النحاس 4 و 2 مم أكسدة الجلوتاثيون. بعد هذا يغسل، إغلاق منفذ العمود واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح القصوى تشكيل السندات ثاني كبريتيد.

5. TFA شطف والكمي

المحتوى "> تنبيه: حمض Trifluoroacetic (TFA) يؤدي بحروق شديدة على ملامسة الجلد والأبخرة هي مزعجة للغاية وينبغي أن تستخدم فقط TFA المركزة في الدخان هود الكيميائية المعتمدة مع حماية العين وقفازات اللاتكس غير تحقق من التوافق الكيميائي للجميع. المواد المستخدمة؛ البولي بروبلين متوافق مع جميع الخطوات من هذا البروتوكول.

  1. تغسل الحل اليوريا المؤكسدة السرير مع وحدات التخزين 10 من المياه وتجفيف السرير عمود من خلال تطبيق خط فراغ إلى مخرج العمود.
  2. إغلاق منفذ عمود وإضافة وحدات السرير 1.5 من TFA (99-100٪) أنيق. تحريك الراتنج النيكل مع ملعقة صغيرة لضمان التعرض حتى لحمض واحتضان لمدة 5 دقائق. فتح منفذ العمود وجمع شطافة الحامض، الضغط بلطف مع حقنة أو مضغوط الخطوط الجوية إذا لزم الأمر لطرد جميع من السائل.
  3. كرر الخطوة شطف حمض مع حجم السرير آخر TFA 1.5 من أنيق. العمل بسرعة على هذه الخطوة لتجنب تفكك كامل للbeadeد الاغاروز المصفوفة. يمكن تحديد العائد البروتين في هذه المرحلة وفقا للمعادلة بئر لامبرت ومعامل الانقراض النظرية المولي من تسلسل trpLE الببتيد. تمييع عينة من شطافة TFA (1:20 حتي 01:50) في trifluoroethanol (TFE) وقياس الامتصاصية في 280 نانومتر، وذلك باستخدام TFA / TFE في التخفيف نفس فارغة.

6. CNBr الهضم

تنبيه: بروميد السيانوجين (CNBr) هي سامة للغاية وينبغي التعامل معها فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية المعتمدة الدخان. هناك حاجة على الاطلاق بما في ذلك معدات الوقاية الشخصية نظارات السلامة، والقفازات معطف المختبر غير اللاتكس. CNBr هو رد الفعل للرطوبة ويجب أن يقدم إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. اتصل بمكتب السلامة المؤسسية حصول على تعليمات حول تحييد / التخلص من CNBr الملوثة حلول والمواد.

  1. يخفف من حمض شطافة إلى 80٪ تركيز TFA النهائي بالإضافة نقطه نقطه من الماء في حين خلط بلطف. إذا كان يعجل أشكال، وهوي ي مرة أخرى وحدة تخزين صغيرة (0.5 إلى 1 مل) من TFA أنيق حتى حل يوضح، ثم إعادة الصحيحة إلى 80٪ مع الماء. اتخاذ 5 ميكرولتر قبل هضم عينة لتحليل SDS-PAGE وتجميد في النيتروجين السائل وlyophilizing العينة على الفور.
  2. إضافة إلى ما يقرب من بلورات CNBr 0.2 جم / مل، مع الحرص على الموازنة بين المواد الكيميائية السامة بأمان في أنابيب مغلقة قبل وزنه، أو باستخدام ميزان داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية الدخان. المزيج بلطف حتى يذوب تماما. طرد وختم وعاء التفاعل تحت غاز خامل (النتروجين أو الأرجون تيار) واحتضان 3-4 في ساعة درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء.
  3. اتخاذ 5 ميكرولتر بعد هضم عينة للتحليل SDS-PAGE وتجميد ويجفد على الفور. نقل رد الفعل هضم السليلوز إلى كاسيت أو أنابيب غسيل الكلى مجدد (خلات السليلوز سوف تذوب في حمض مركزة) مع قطع الوزن الجزيئي من 3.5 كيلو دالتون أو أقل، وفقا لحجم المجمع الببتيد المتوقعة. Dialyze بين عشية وضحاها إلى 4 L من الماء فيالكيميائية غطاء الدخان للحد من تركيز TFA وتتحلل أي CNBr غير المتفاعل. يترك مجالا في الكاسيت أو أنابيب غسيل الكلى لزيادة كبيرة في حجم (بما يصل الى اثنين إلى ثلاثة أضعاف) خلال غسيل الكلى بين عشية وضحاها.
  4. إزالة محلول التفاعل مع مدال يعجل علقت من كاسيت غسيل الكلى أو أنابيب (أكثر من البروتين سوف يعجل عندما يتم تقليل تركيز TFA) ونقل إلى أنابيب التعليق 50 مل المخروطية. تجميد ويجفد لإزالة المياه وآثار CNBr / TFA. هذه الخطوة من المرجح أن تتطلب عدة أيام.
    تنبيه: يتعين على كل من رد الفعل هضم مدال والمياه غسيل الكلى لا تزال تعامل على أنها سامة والتعامل معها / التخلص مع الاحتياطات المناسبة.
  5. يجوز تحليل العينات من الثقافات من مراحل ما قبل الحصاد والحث، وإدراج طاف بيليه والجسم، وCNBr شطافة TFA-هضم المواد بواسطة SDS-PAGE. إعداد عينات عن طريق التسخين إلى 95 ° C في LDS إينفيتروجن sampl NuPAGEه العازلة. وينبغي إعداد TFA شطافة وهضم العينات في ظروف كل من خفض وغير المختزلة لتسهيل تحديد وتقييم المنتج يشابك التأكسدي.
  6. فصل العينات على 12٪ NuPAGE مكرر تريس هلام مادة الأكريلاميد مسبقة الصب باستخدام SDS-MES عازلة للتشغيل الأمثل للقرار منتجات أصغر هضم.

7. عكس المرحلة HPLC تنقية ثاني كبريتيد-crosslinked مجمعات الببتيد

  1. حل ما يصل الى 100 ملغ من منتجات هضم مجفف بالتجميد في 2-3 مل حمض الفورميك أنيق وتحميلها في إحدى إعدادي النطاق (21.2 × 150 مم) اجيلنت ZORBAX SB-300 C3 PrepHT عمود في المذيبات A (الأسيتونيتريل عادة 10-20٪ أو 5 -10٪ الأيزوبروبانول في الماء مع TFA 0.1٪).
  2. أزل المنتجات دايجست في التدرج من المذيبات B (الأسيتونيتريل أو الأيزوبروبانول مع TFA 0.1٪) خلال حجم العمود لا يقل عن 5. انظر المناقشة للحصول على اقتراحات بشأن اختيار الظروف المثلى للالتدرج تسلسل الببتيد مختلفة.
  3. أخذ50-100 ميكرولتر من العينات كل جزء HPLC لSDS-PAGE تحليل وتجميد ويجفد على الفور. إزالة المذيبات HPLC سريعا ويجب أن يكون كاملا في 1-2 ساعة.
  4. إعداد عينات مجفف بالتجميد HPLC لSDS-PAGE عن طريق تسخين لC ° 95 في NuPAGE إينفيتروجن العازلة عينة LDS مع عدم وجود عامل مختزل. تبريد وتقسيم كل عينة بالتساوي في أنابيب microcentrifuge 2، بإضافة 100 مم إلى DTT واحد منهم لفترة وجيزة وإعادة التسخين.
  5. فصل انخفاض وغير المنخفض عينات HPLC على 12٪ NuPAGE مكرر تريس هلام مادة الأكريلاميد مسبقة الصب مع MES-SDS تشغيل المخزن المؤقت على النحو الوارد أعلاه. الصغيرة، الببتيدات مسعور في كثير من الأحيان لا يستغرق Coomassie جيدا وصمة عار قد لا تعمل في أوزانها الجزيئية المتوقعة. ومع ذلك، يجب مقارنة العينات انخفاض وغير المنخفض تسهيل التعرف على المنتجات الببتيد crosslinked وتقييم النقاء.
  6. تحليل المرشح التي تحتوي على الببتيد الكسور بواسطة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الطيران من (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي (انظر المناقشة) لتحديد الأنواع ذات الأهمية وتأكيد كتلته المتوقعة.
  7. الجمع، وتجميد يجفد الكسور HPLC يحتوي على نقية، crosslinked مجمع الببتيد TM واتخاذ الوزن الجاف للمنتج النهائي لتحديد العائد. قد الكسور ذات المحتوى العالي الأيزوبروبانول لا تزال مجمدة. إذا الكسور الببتيد تجف وصولا الى فيلم بدلا من منتج مجفف بالتجميد رقيق، وإعادة حل الفيلم تماما في كمية صغيرة من hexafluoroisopropanol النقي (HFIP)، وتجميد يجفد مرة أخرى. يجب على المنتج HFIP المعالجة تكون صغيرة، مخروط الأبيض الذي يميل بسهولة وزنه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مستوى التعبير عن تحقيق اندماج trpLE هو متغير ويعتمد اعتمادا كبيرا على تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد المرفقة. ويبين الشكل 3 تحليل SDS-PAGE الحث قبل (حارة 1) وتستغرق وقتا من الحصاد (حارة 2) عينات من الثقافة التي أسفرت عن حوالي 120 ملغ من الذهب الخالص، والانصهار trpLE-DAP12TM سليمة من 1 لتر و 4 للثقافة مصفوفة النيكل مل. تم ترجمة كل من الانصهار trpLE-DAP12TM على إدراج بيليه الجسم (حارة 4) بدلا من طاف (حارة 3).

وكان ما يقرب من 70٪ من الانصهار trpLE-DAP12TM ثاني كبريتيد النيكل النقي، crosslinked إلى النموذج مثنوي (الشكل 3، 5 و 6 حارات: عينات غير مخفضة وانخفاض شطافة TFA). هذا هو نتيجة لاندماج نموذجية trpLE-DAP12TM، ولكن الكفاءة يشابك سوف تختلف مع وضع cysteines هندسيا. المنتجات الببتيد DAP12TM لا يسهل تحديدها في مجموع العينات هضم CNBr (الممرات 7 و 8)،لكن المقارنة بين الانصهار سليمة وشرائح جزء trpLE في العينة خلاصة انخفاض (حارة 8) يشير إلى أن عملية الهضم من الانصهار كان ~ 60٪ كاملة.

ويبين الشكل 4 الفصل بين المنتجات هضم بواسطة عكس المرحلة HPLC باستخدام العمود C3 إعدادي النطاق (سعة ملزمة إجمالي ~ 200 ملغ من البروتين). لأن محتوى العطرية من الانصهار منخفضة عادة نقوم بمراقبة الامتصاصية في 214 نانومتر نانومتر بدلا من 280. لهذا المدى من 90 ملغ أكسدة، تم حل CNBr-هضمها trpLE-DAP12TM الانصهار في 3 مل حمض الفورميك أنيق وتحميلها على العمود A في المذيبات 100٪ (60٪ H 2 O، الأسيتونيتريل 40٪، 0.1٪ TFA). ومزال منتجات محددة في التدرج على مرحلتين من 0-60٪ تليها B المذيبات 60-90٪ (75٪ الأيزوبروبانول، الأسيتونيتريل 25٪، 0.1٪ TFA) في معدل التدفق من 10 مل / دقيقة. يشار إلى المنتجات الرئيسية الواردة في كل جزء وفقا لتحليل SDS-PAGE (الشكل 5) فوق كروماتوغرام باستخدام رموز عاصيgned في الشكل 2. انظر الأمثل لشطف التدرج HPLC في قسم المناقشات لمزيد من التفاصيل حول تحسين ظروف التدرج لتسلسل الببتيد مختلفة.

منتجات الببتيد يمكن تمييزها بسهولة في SDS-PAGE (الشكل 5) وMALDI-TOF (الشكل 6) تحليلات لكسور HPLC الرئيسية. الببتيدات DAP12TM و، في تجربتنا، وغيرها العديد من الببتيدات مسعور TM، تشغيل مع معدلات الهجرة انخفاضا كبيرا مقارنة أوزانها الجزيئية المتوقعة (3366 دالتون مونومر و6730 ديمر دالتون للأنواع ذات العلامات N 15 هو موضح هنا). وهناك علاقة مباشرة هذا السلوك لكمية من الببتيد تحميلها على هلام والنتائج في سلسلة متصلة من الأوزان الجزيئية واضح كما هو تفاوتت كمية تحميل (المعطيات غير معروضة). ومع ذلك، فإن التغيير في التنقل الكهربي من الذروة إلى 5 ملم DTT مع الحد من 100 (مقارنة الممرات 7 و 8) ويحدد هذا الببتيد كما crosslinkedالمنتج. MALDI-TOF MS تحليل يؤكد هوية الببتيد مثنوي مع الارتفاع الحاد في 6729،2 دالتون وغيرها من المنتجات لا تكشف الرئيسية (الشكل 6). وكان العائد النهائي من الذهب الخالص ثاني كبريتيد-crosslinked homodimer الببتيد DAP12TM من هذا المستحضر 7.5 ملغ للتر الواحد للثقافة.

الشكل 1
الشكل 1. تسلسل الحمض النووي من المنطقة trpLE-DAP12TM الترميز مع ترجمتها الأحماض الأمينية. ويسلط الضوء على المناطق الرئيسية للتسلسل ببتيد واللون ترميز مع تسميات إلى اليمين. وأبرزت فريدة من نوعها الداخلية ميثيونين (الحد) والسيستين (السيستئين) بقايا لانشقاق السيانوجين (CNBr) بروميد ويشابك التأكسدي في سماوي والأرجواني، على التوالي. HindIII والمواقع تقييد BamHI (جريئة وتحتها خط) هي فريدة من نوعها في البلازميد والماجستيرذ أن تستخدم لتحل محل سلسلة ببتيد TM مع آخر سلسلة من الفائدة.

الشكل 2
الشكل 2. الرسم التخطيطي لهذا الإجراء. يشار إلى الخطوات الرئيسية في البروتوكول في تسميات نصية. وقطاعات رئيسية من الانصهار trpLE-DAP12TM لون مشفرة كما في الشكل (1). وصفت المنتجات الرئيسية ببتيد من يشابك والخطوات هضم AF ويتم سرد هنا مع وصف والأوزان الجزيئية المتوقعة (15 N-المسمى): [A] جزء trpLE: 13769 دالتون، [B] سليمة trpLE-DAP12TM الانصهار: 17118 دالتون ؛ [C] سليمة trpLE-DAP12TM الانصهار ديمر: 34233 دالتون، [D] واحد المشقوق trpLE-DAP12TM الانصهار ديمر: 20482 دالتون، [E] موحودي DAP12TM الببتيد: 3366 دالتون، [F] مثنوي DAP12TM الببتيد: 6730 دالتون. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. SDS-PAGE تحليل الخطوات التعبير، وتنقية، وهضم يشابك trpLE-DAP12TM عينات الثقافة (حارة 1، قبل التعريفي، خطوة 2.5؛ حارة 2، الحصاد، الخطوة 3.1). وعينات إدراج الإعدادية الجسم (حارة 3، طاف؛ حارة خفضت الخطوة 3.4) ملم مع DTT 100؛ 4، بيليه. TFA شطافة من العمود النيكل (5 و 6 حارات؛ الخطوة 6.1) وعينة بعد CNBr (7 و 8 حارات، الخطوة 6.3) تم تشغيل غير مخفضة (NR) وتقليل مع DTT ملم 100 (R) كما هو مبين لتأكيد ثاني كبريتيد-crosslinked المنتجات. * المنتج الببتيد موحودي ومثنويق E و F هي تصور سيئة من قبل تلطيخ Coomassie وبالتالي لا يمكن كشفها على هذا الجل.

الشكل 4
الشكل 4. عكس المرحلة HPLC تنقية DAP12TM ديمر ثاني كبريتيد-crosslinked. مكسد، CNBr-هضمها ومجفف بالتجميد المنتجات الانصهار trpLE-DAP12TM (90 ملغ) حلت في 3 مل حمض الفورميك (100٪) وتحميلها على أحد ZORBAX اجيلنت SB-300 PrepHT C3 (21.2 × 150 مم) عمود في المذيبات (60٪ H 2 O، الأسيتونيتريل 40٪، 0.1٪ TFA). تم تشغيل A التدرج مرحلتين من 0-60٪ تليها B المذيبات 60-90٪ (75٪ الأيزوبروبانول، الأسيتونيتريل 25٪، 0.1٪ TFA) في معدل التدفق من 10 مل / دقيقة إلى أزل منتجات محددة. كما جمعت الكسور التدفق من خلال (FT) ويتم وضع علامة 4 قمم الرئيسية أعلاه تتبع الامتصاصية 214 نانومتر (AU: التعسفية للأمم المتحدةيشار إلى) والمنتجات الرئيسية الواردة في كل جزء باستخدام الرموز المخصصة في الشكل 2. ومظللة المطلوب الذروة DAP12TM المنتج crosslinked.

الشكل 5
الشكل 5. تم تشغيل SDS-PAGE تحليل المنتجات HPLC عكس المرحلة. التدفق من خلال (FT) وذروة 1 عينات غير مخفضة. تم تشغيل الذروة 2، 3 و 4 عينات كلا غير مخفضة (NR) وبنسبة المعاملة مع DTT ملم 100 (R) للتحقق من هوية من المنتجات ثاني كبريتيد crosslinked. والمنتجات الرئيسية في كل جزء (مع رموز المسندة إليها في الشكل 2) كانت [FT، PK1]: A جزء، trpLE؛ [PK2]: B، سليمة trpLE-DAP12TM الانصهار مونومر وC، سليمة ديمر الانصهار؛ [PK3]: D، واحد المشقوق trpLE-DAP12TM ديمر وE، موحودي DAP12TM الببتيد؛ [PK4]: F، ثاني كبريتيد-crosslinked ديمر DAP12TM. * كما نوقش (انظر REULTS الممثل)، والتحول تعتمد على التركيز في التنقل يجعل المنتجات المنخفضة MW في PK3 (NR وR) وPK4 (R) يبدو أن أوزان جزيئية مختلفة على الرغم من كل المنتجات هي الببتيد موحودي.

الشكل 6
الشكل 6. MALDI-TOF التحليل الطيفي الشامل من HPLC-المنقى ديمر الببتيد DAP12TM. كانت مختلطة عينة من جزء HPLC 4 (1 ميكرولتر) 1:1 مع محلول مشبع من حمض sinapinic (SA) في مصفوفة الأسيتونيتريل ورصدت على رأس طبقة رقيقة من مصفوفة SA المجففة من محلول مشبع أعد الايثانول. MALDI-TOF يكشف هذا التحليل عن المنتج في الببتيد DAP12TM المتوقعة crosslinked ديمر الشاملمن 6730 دالتون (6729،2098، 15 N-المسمى)، وكذلك منتج طفيفة في 3365،7105، على الأرجح الأنواع نقرا مزدوجا المتأين. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التعبير عن trpLE-TM اندماج. في تجربتنا، يتم التعبير عن سوء trpLE-TM اندماج في ثقافة المتوسط ​​الغنية في 37 ° C، والظروف الثقافة الموصوفة هنا أثبتت نجاحها لسلاسل مختلفة تحتوي على العديد من 1-4 TM المجالات مع عائدات تتراوح 50 حتي 150 ملغ / لتر من الانصهار، نقية سليمة. اندماج ترميز ثلاثة أو أربعة أجزاء TM GPCR (CCR5 الإنسان TM1-TM3 وTM4 TM7، على التوالي) أو جزء من الإنسان الأساسية الحفاز إشارة الببتيد ببتيداز (TM أربعة مجالات، وانظر المرجع 15) تمثل أقل في هذا النطاق التعبير المستويات، بينما المتغيرات DAP12TM ترتبط ارتباطا وثيقا تسلسل المستخدمة هنا تمثل أعلى نهاية النطاق (بيانات غير منشورة). وينبغي تحديد تركيز IPTG الأمثل تجريبيا لكل تسلسل جديد. معيارنا هو 0.1 ملم، وتركيزات أعلى (تصل إلى 1 مم) يؤدي عادة في المحصول بدرجة كبيرة بسبب انخفاض مستويات كل من التعبير وأقل كثافة ثقافةر الحصاد (انظر على سبيل المثال الشكل 1A في اشارة 7).

تنويعات على بروتوكول المقدمة. البروتوكول المذكورة هنا يصف الإنتاج من مجمع ثاني كبريتيد-TM crosslinked الببتيد، وhomodimer DAP12TM 8. بدلا من ذلك، يتم تكييفها بسهولة بروتوكول لإنتاج الببتيدات موحودي، بحذف الخطوات غسل اثنين المصممة لإزالة الحد من أكسدة وكيل والمنتجات المتجهة (4.3 و 4.4). وقد استخدمنا في السابق اختلاف آخر من إجراءات ذكرت هنا لإنتاج استقرت تساهميا مجمع الببتيد TM تمثل مثلوثي DAP12-DAP12-TM NKG2C الجمعية (انظر المرجع 8 و الأساليب المذكورة فيها). في هذا التطبيق، وكانت مختلطة 1-TM-trpLE DAP12 الانصهار والانصهار 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C في مرحلة الحصاد الثقافة قبل إعداد الجسم إدراج (3،1-3،2 الخطوة). وشملت الإجراءات خطوة اضافية HPLC لعزل heterodimeric crosslinked trpLEالمنتج الانصهار من حمض شطافة (الخطوة 5.3) قبل هضم CNBr. أدى C3 تنقية المنتجات الببتيد في الانتعاش من ثاني كبريتيد-crosslinked ديمر DAP12TM في أي واحد حبلا قام المجال TM NKG2C باعتبارها الانصهار في محطة C-الإطار. هيكل NMR حل هذا المجمع في المذيلات المنظفات وأكد أن المجال TM NKG2C تجميعها مع DAP12 في موطنه الأصلي المضادة للاتجاه مواز، 8. الخطوات الإضافية في هذا الاختلاف إلى خفض كبير في العائد للمنتج النهائي: أ إعداد نموذجي أسفرت 8-10 ملغ من "مثلوث" الببتيد من 4L واحد جنبا إلى جنب مع الانصهار وجود فائض من الثانية. هذا الاختلاف يمثل بروتوكول انطلاق جيدة للباحثين الراغبين في إنتاج ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات التي تحتوي على اثنين من مختلف متواليات TM.

الملاحظات على تنقية النيكل وتقارب. وشطف من البروتين من العمود النيكل المجففة باستخدام حمض المركزة هو إجراء غير عادي وغير قابلة للإعادةمن المصفوفة النيكل الاستخدام. أسفرت محاولات أزل مسعور للغاية trpLE-TM اندماج باستخدام الاميدازول أو EDTA في الانتعاش غير مكتملة من البروتين وتم الإبقاء تفضيلي الأنواع crosslinked على العمود (نتائج غير منشورة). وقد أوصت كمية من النيكل ومصفوفة ليلة وضحاها بروتوكول ملزم دفعة الأمثل بعناية لتشبع المصفوفة مع trpLE-TM البروتين وبالتالي تقليل شارك في تنقية الملوثات. نستعيد بشكل روتيني المنتجات النقية للغاية مع عوائد تتجاوز بكثير قدرة المعلن الملزم للسيغما HIS-اختار الانجذاب مصفوفة النيكل (15-20 ملغ / مل الراتنج). وشطف حمض كما يلغي الخطوات الوسيطة اللازمة لهضم تمر بمرحلة انتقالية في CNBr، وزاد إنتاج المنتجات crosslinked أكثر من إزاحة تكلفة من المصفوفة النيكل، وخاصة عندما وضع العلامات مع الكواشف مستقرة، نظير تكلفة لNMR.

السيانوجين بروميد ظروف هضم. الإصدار منعادة يتم تنفيذ الببتيدات TM تنصهر من trpLE في CNBr باستخدام حمض الفورميك 70٪ كما المذيب لأن كلا من معدل التفاعل والذوبان البروتين مواتية للغاية في ظل هذه الظروف. ومع ذلك، يجب أن تبقى مرات العلاج قصيرة نسبيا (أقل من 1 ساعة لهضم) لتجنب الأسترة فورميل من سيرين ثريونين والمخلفات وربما 16،17 I-formylation من مخلفات التربتوفان 18، التعديلات التي يمكن اكتشافها بواسطة مطياف الكتلة والأنواع التي لوحظ الشامل هو +28 (ن) دالتون نسبة إلى كتلة من المتوقع. تفضيلنا لTFA كما هو موضح هنا يتجنب هذه التعديلات تماما. الأنزيمية الانقسام من الانصهار trpLE-TM باستخدام عامل شى البروتيني في تريتون 1٪ X-100 تم إبلاغ 11، ولكن ذوبان سوء اندماج معظم trpLE-TM ومضاعفات عدم إمكانية الوصول الانقسام في موقع المذيلات المنظفات تحد ربما الأداة المساعدة العامة لل هذا النهج.

عكس المرحلة HPLC تنقية peptiالمنتجات دي من هضم CNBr هي الخطوة الأكثر تحديا في هذا الإجراء، ومن المرجح أن تتطلب التحسين لكل تسلسل trpLE-TM الجديدة. الملاحظات التالية تأتي من معالجة العديد من سلاسل مختلفة، ويحتمل أن ينطبق على معظم اندماج trpLE-TM:

اختيار الطور الثابت ونجد اجيلنت ZORBAX مستقرة بوند الأعمدة C3 (300 حجم المسام Å و 5 ميكرومتر حجم الجسيمات). أن تكون مرحلة متفوقة ثابتة من حيث الانتقائية، والسلطة، والاستقرار في ظل حل التعرض بشكل كبير للحمض المركزة. شبه إعدادي (9.4 مم) وإعدادي الحجم (21.2 مم) الأحجام المتاحة وأدوا بشكل جيد للغاية في أيدينا. قد C4، وثنائي الفينيل مراحل ثابتة cyanopropyl تقديم المفيد أيضا الانتقائية الببتيد البديلة في مجموعة hydrophobicity مماثلة مقارنة C3.

إعداد ملخص للمنتجات HPLC. حل هضم منتجات مجفف بالتجميد في CNBr أنيق للهيئة التصنيع العسكري حمض توفر أفضل النتائج للفصل HPLC. تخفيض إعداد في TFA أو المذيبات العضوية مثل trifluoroethanol، وثنائي ميثيل فورماميد الأسيتونيتريل تسهم في تخفيض القابلية للذوبان، العمود ملزمة و / أو شطف من المنتجات في قمم واسعة تحتوي على أنواع متعددة. يجب الحرص على إعداد المنتجات في حمض الفورميك مباشرة قبل التحميل لأن التعرض لفترة طويلة العمود يمكن أن يؤدي إلى تعديل فورميل من 16-18 sidechains الببتيد كما نوقش أعلاه.

وتعظيم الاستفادة من التدرج شطف HPLC. نحن عادة ما تبدأ مع الأسيتونيتريل 10-20٪ 5-10٪ الأيزوبروبانول أو في الماء مع TFA 0.1٪ كمذيب اندماج TrpLE-TM A. ومنتجاتها هضم الذائب في حمض الفورميك ربط العمود C3 في كما بقدر 40٪ كما هو موضح هنا الأسيتونيتريل (الشكل 4). قد الكثير من جزء trpLE المحررة تتدفق من خلال ظل هذه الظروف (لاحظ أن جزء trpLE هو المنتج الوحيد في البروتين FTجزء: الشكل 5، حارة 1)، ونحن قد استفادت من هذه الملاحظة لزيادة القدرة العامة ملزمة للعمود للمنتجات المطلوبة. الأسيتونيتريل والأيزوبروبانول فعالة جدا كمذيبات التدرج، ونحن غالبا ما تصل في ظروفنا التدرج النهائي عن طريق خلط موجودة من قبل حلول المذيبات لتعديل ملامح شطف، مما أدى إلى وصفات غريبة في بعض الأحيان ولكنها فعالة مثل الأيزوبروبانول 75٪، 25٪ الأسيتونيتريل، 0.1 ٪ حل TFA تستخدم B حل لتنقية DAP12TM هو موضح هنا. تم مزال المنتجات مسعور للغاية التي كانت إشكالية استخدام الأسيتونيتريل أو الأيزوبروبانول مع اضافة ما يصل الى 10٪ trifluoroethanol (TFE) وزيادة تركيز TFA (إلى 0.3٪) في كل من A و B (نتائج غير منشورة). وأفادت نتائج جيدة باستخدام الآخرين مراحل حمض بيوتانول / الخليك المحمول مع مرحلة ثابتة C4 9.

تحليل المنتجات هضم. كل من تقنية تحليل الرئيسيةق المستخدمة هنا، SDS-PAGE وMS-TOF MALDI، يمكن أن يكون معقدا وفقا لطبيعة مسعور للغاية من trpLE-TM المنتجات. عينات تحليلية مجفف بالتجميد من ردود الفعل هضم CNBr / TFA والكسور HPLC تشغيل أحيانا عالية الوزن الجزيئي المجاميع على SDS-PAGE المواد الهلامية. نجد أن معالجة عينات مجفف بالتجميد مع صغر حجم HFIP وإعادة تجفيد-قبل التحضير لسبل الانتصاف في كثير من الأحيان SDS-PAGE هذه المشكلة. TM تسلسل الببتيد أيضا قد لا تأيين بسهولة خلال تحليل MS-TOF MALDI، وبالتالي يمكن أن تعطي إشارات ضعيفة جدا. وقد استخدمنا إجراء الأمثل لإعداد عينات الببتيد TM التي رصدت لأول مرة محلول مشبع من حمض sinapinic (SA) في الإيثانول على لوحة والمجففة لجعل طبقة رقيقة من مصفوفة موحدة. ورصدت عينة من ثم جزء HPLC المحتوية على الببتيد مختلطة 1:1 مع محلول مشبع من SA في الأسيتونيتريل على رأس طبقة مصفوفة المجففة. في أيدينا، وهذا الأسلوب الغلة بين عامين وستة أضعاف أكبر إشارة الضوضاء إلى المقارنةد لاكتشاف الببتيد: SA خليط مباشرة على لوحة MALDI نظيفة.

تطبيقات المصب. طرق إعادة تشكيل المجمعات الببتيد TM في نظم الدهون أو المنظفات لNMR حل والتطبيقات الأخرى المصب تختلف على نطاق واسع ويجب دائما أن مصممة بعناية لكل نظام جديد والتطبيق. A مناقشة كاملة من المعلمات المعنيين وبالتالي تتجاوز نطاق هذا المقال البروتوكول. للاطلاع على تفاصيل إعداد العينات من التطبيقات الناجحة باستخدام NMR الحل، نشير للقارئ أن هذه المشاركات في هذا الموضوع 1،19 والمراجع فيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

يتم توفير التمويل لهذا العمل من قبل الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (NHMRC المشروع منحة ل1011352 MEC وMJC؛ المستقلة البنية التحتية معاهد البحوث خطة دعم [IRIISS] منحة لWEHI) وحكومة فيكتوريا (VESKI الابتكار زمالة لMEC؛ الفيكتوري الدولة الدعم الحكومي البنية التحتية التشغيلية لWEHI). MEC زميل الملكة اليزابيث الثانية لمجلس البحوث الأسترالية. EFXB يعترف بدعم من برنامج المنح الدراسية هيلدا نورما شوستر في جامعة ملبورن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanogen bromide ALDRICH P.No- C91492,CAS-506-68-3 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol SIGMA-ALDRICH P.No M7154, CAS Number 60-24-2 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SIGMA-ALDRICH Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid Merck KGaA K41186564 Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea UNIVAR, AJAX FINECHEM Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE Amresco P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100 SIGMA Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel SIGMA-ALDRICH Catalog Num- P6611 IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized SIGMA-ALDRICH Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator QSONICA S-3000 (discontinued) Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 Bio-Rad Laboratories Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size Agilent Product No: 895150-909 Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels Life Technologies NP0341BOX Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO Thermo Scientific Product No: 87724 Sample dialysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 73، علم الأحياء الهيكلي، الكيمياء، الهندسة الكيميائية، الفيزياء الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الجزيئي، بروتينات الغشاء، والبروتينات، وبنية جزيئية والمجال عبر الغشاء، والكيمياء الببتيد، بنية البروتين الغشاء، مستقبلات المناعة، HPLC عكس المرحلة، HPLC، الببتيدات، الدهون، والبروتين، والاستنساخ، وشطف TFA، CNBr الهضم، NMR، ثقافة التعبير الخلية،
إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M.,… More

Sharma, P., Kaywan-Lutfi, M., Krshnan, L., Byrne, E. F. X., Call, M. J., Call, M. E. Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies. J. Vis. Exp. (73), e50141, doi:10.3791/50141 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter