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Chemistry

स्ट्रक्चरल अध्ययन के लिए स्थिर का उत्पादन Disulfide transmembrane पेप्टाइड परिसर

Published: March 6, 2013 doi: 10.3791/50141
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

Summary

Biophysical और जैव रासायनिक अध्ययन झिल्ली एम्बेडेड डोमेन प्रोटीन के बीच बातचीत के कई तकनीकी चुनौतियों, जो पहले की उपयुक्त अध्ययन सामग्री प्राप्त है का सामना करना पड़ता है. इस लेख के उत्पादन और शुद्ध डाइसल्फ़ाइड स्थिर transmembrane पेप्टाइड परिसरों कि समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और अन्य विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों से संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

लिपिड झिल्ली प्रोटीन के एम्बेडेड अल्फा पेचदार डोमेन के बीच शारीरिक संबंधों को और झिल्ली प्रोटीन परिसरों की तह विधानसभा में और (टीएम) transmembrane संकेतन और सेल सतह प्रोटीन के स्तर के विनियमन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. संरचनात्मक विशेष दृश्यों के सहयोग से ड्राइविंग सुविधाओं को समझना टीएम पेप्टाइड परिसरों के परिष्कृत biophysical और जैव रासायनिक विश्लेषण की आवश्यकता है. हालांकि, टीएम डोमेन के चरम hydrophobicity उन्हें बहुत मुश्किल बनाता मानक पेप्टाइड रसायन शास्त्र तकनीक का उपयोग में हेरफेर करने के लिए, और उपयुक्त अध्ययन सामग्री का उत्पादन अक्सर बेहद चुनौतीपूर्ण साबित होता है. शर्तों जिसके तहत पेप्टाइड्स स्थिर पेचदार रचना और फार्म परिसरों को अपनाने कर सकते हैं की पहचान अनायास कठिनाई का एक और स्तर कहते हैं. यहाँ हम होमोसेक्सुअल या सामग्री से असमलैंगिक dimeric टीएम पेप्टाइड परिसरों का उत्पादन कि ई. में व्यक्त कर रहे हैं के लिए एक प्रक्रिया उपस्थित ज़ीन, मैं इस तरह परमाणु चुंबकीय अनुनाद के लिए स्थिर आइसोटोप लेबल (एनएमआर) या अन्य अनुप्रयोगों के लिए अपेक्षाकृत सस्ते गैर प्राकृतिक एमिनो एसिड के समावेश की अनुमति. इस विधि में महत्वपूर्ण नवाचार है कि टीएम परिसरों का उत्पादन कर रहे हैं और covalently जुड़े (डाइसल्फ़ाइड Crosslinked) विधानसभाओं कि स्थिर, stoichiometric और सजातीय संरचनाओं फार्म जब डिटर्जेंट, लिपिड, या अन्य झिल्ली अनुकरण करनेवाला सामग्री में का पुनर्गठन कर सकते हैं के रूप में शुद्ध. हम भी वर्तमान अभिव्यक्ति और शोधन के लिए सावधानी से अनुकूलित प्रक्रियाओं है कि चाहे एकल टीएम डोमेन या Crosslinked परिसरों के निर्माण में समान रूप से लागू कर रहे हैं और नए टीएम दृश्यों के लिए इन तरीकों के अनुकूल ढालने के लिए सलाह प्रदान करते हैं.

Introduction

यह प्रोटोकॉल का विवरण एक प्रक्रिया है हम transmembrane डाइसल्फ़ाइड स्थिर संरचनात्मक समाधान एनएमआर का उपयोग कर अध्ययन के लिए परिसरों पेप्टाइड्स (टीएम) का उत्पादन करने के लिए विकसित किया है. प्रक्रिया मजबूत ΔtrpLE1413 संलयन प्रणाली (नीचे देखें) द्वारा afforded अभिव्यक्ति का लाभ लेता है और टीएम परिभाषित संरचना के पेप्टाइड परिसरों आधुनिक बहु - आयामी एनएमआर प्रयोगों के लिए परिष्कृत स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है. हम इन तकनीकों कार्यरत है कई एनएमआर संरचनाओं कि लिम्फोसाइट - सक्रिय immunoreceptors कई झिल्ली प्रोटीन से अपने टीएम डोमेन के बीच बातचीत के माध्यम से इकट्ठा कर रहे हैं (हाल ही में 1 समीक्षा) के बारे में महत्वपूर्ण नई जानकारी से पता चला निर्धारित. इन तकनीकों में कई अन्य झिल्ली प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सिस्टम समाधान एनएमआर अलावा बहाव विश्लेषणात्मक तरीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं. जबकि यहाँ दिए गए उदाहरण देशी सिस्टीन अवशेषों का इस्तेमालएक जटिल है कि स्वाभाविक रूप से डाइसल्फ़ाइड बंधुआ प्रोटीन mimics बनाने, डिजाइन इंजीनियर डीसल्फाइड बॉन्ड कि परिसरों आम तौर पर कमजोर, होमोसेक्सुअल और hetero-dimeric के टीएम परिसरों के रूप में इस तरह के गैर सहसंयोजक बातचीत के द्वारा एक साथ आयोजित कर रहे हैं को स्थिर बनाने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) परिवार 2-4 प्रोटीन या heterodimeric αβ Integrin 5,6 परिसरों.

लिपिड से प्राप्त उन लोगों के रूप में अत्यंत hydrophobic पेप्टाइड दृश्यों bilayer टीएम प्रोटीन के कुछ भागों में फैले जैव रासायनिक और biophysical अध्ययन के लिए बेहद मुश्किल विषय हैं. बहुत चुनौतीपूर्ण होने के मानक प्रोटीन और पेप्टाइड रसायन तकनीक का उपयोग में हेरफेर करने के लिए इसके अलावा, वे अक्सर काफी कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं और इसलिए कर रहे हैं recombinantly उत्पादन मुश्किल है. हम 7,8 और 9-11 दूसरों पड़ा महत्वपूर्ण फ्रेम carboxy टर्मिनल के रूप में इस तरह के बैक्टीरिया में मुश्किल पेप्टाइड दृश्यों व्यक्त सफलताΔtrpLE1413 अनुक्रम का एक संशोधित संस्करण ई. से व्युत्पन्न fusions कोलाई trp operon 12. T7 प्रमोटर के तहत उच्च स्तर पर ~ 13 केडीए trpLE इस अनुक्रम द्वारा इनकोडिंग पॉलीपेप्टाइड उत्पादन किया जा सकता है और पूरी तरह से समावेश शरीर जहां विषाक्तता और / या अस्थिरता से संबंधित समस्याओं circumvented स्थानीय. अनुक्रम के एक 9-हिस्टडीन 13 टैग और 14 की अनुमति दी trpLE पेप्टाइड धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध हो और पचा fusions विषैली गैस ब्रोमाइड (CNBr का उपयोग trpLE अनुक्रम से आंतरिक methionine और सिस्टीन अवशेषों के उन्मूलन अमीनो टर्मिनल के अलावा द्वारा संशोधन ) जारी करने के लिए वांछित पेप्टाइड अनुक्रम. हम सफलतापूर्वक इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है trpLE fusions झिल्ली प्रोटीन टुकड़ों कि टीएम डोमेन के रूप में कई के रूप में चार होते हैं का प्रतिनिधित्व के रूप में एक दर्जन से अधिक विभिन्न दृश्यों से अधिक व्यक्त (7,8 और अप्रकाशित परिणाम भी चर्चा अनुभाग देखें).

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण नवाचार परिस्थितियों में जो असंरचित और बहुत खराब घुलनशील trpLE टीएम fusions कुशलता से एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो के संदर्भ में डाइसल्फ़ाइड Crosslinked हो सकता है की पहचान है. उच्च उपज अभिव्यक्ति से निपटने, और पेप्टाइड उत्पादों की शुद्धि के कई पहलुओं को भी अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है, और यहाँ प्रस्तुत सिफारिशों गैर डाइसल्फ़ाइड Crosslinked (monomeric) टीएम पेप्टाइड उत्पादों के उत्पादन के लिए भी उतना ही प्रासंगिक हैं.

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Protocol

1. क्लोनिंग और कंस्ट्रक्शन डिजाइन

PMM पेप्टाइड (जो अनुरोध पर प्रदान किया जा सकता है) वेक्टर HindIII और BamHI प्रतिबंध साइटों (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर में ब्याज के दृश्यों क्लोन. डबल असहाय डीएनए डालने, निम्नलिखित क्रम में शामिल करना चाहिए: एक HindIII साइट, CNBr दरार के लिए एक एकल methionine कोडोन, ई. कोडोन अनुकूलित कोलाई अनुक्रम कोडन पेप्टाइड, एक को रोकने के कोडोन, एक BamHI साइट. पेप्टाइड में सभी अन्य methionines और समाप्त किया जाना चाहिए dipeptide एस्प समर्थक अनुक्रम के रूप में यह भी अम्लीय परिस्थितियों में cleaved जाएगा बचा जाना चाहिए.

एक अद्वितीय सिस्टीन अवशेषों अंतिम परिसर में डाइसल्फ़ाइड crosslink के वांछित स्थिति के अनुसार प्रत्येक पेप्टाइड अनुक्रम में पेश किया जाना चाहिए, और अन्य सभी cysteines सेरीन उत्परिवर्तित किया जाना चाहिए. प्लाज्मिड के चयन के लिए एक केनामाइसिन प्रतिरोध कैसेट वहन करती है.

2. TrpLE - pepti की अभिव्यक्तिडी फ्यूजन

  1. मेकअप और बाँझ फिल्टर M9/Kan न्यूनतम मध्यम विकास (0.1 मिमी CACL 2, 2 मिमी MgSO 4, 3 / छ एल KH 2 4 पीओ, 7.5 जी और एल / ना 2 HPO 4 · 2H 2 हे, 0.5 ग्राम / एल NaCl, 1 / छ एल एनएच 4 सीएल, 4 ग्लूकोज छ / एल, 50 मिलीग्राम / एल केनामाइसिन सल्फेट). 40 मिलीलीटर एच 2 हे में 30 मिनट, अपकेंद्रित्र अघुलनशील सामग्री और बाँझ फिल्टर नारंगी तैरनेवाला हटाने के लिए मिश्रण के साथ 1 गोली भंग: Centrum पूरा एक बी विटामिन और धातु का पता लगा प्रदान जिंक के साथ पूरक 4 ° अंधेरे में सी में 2 सप्ताह के लिए और 4 / M9 में मिली एल का उपयोग के लिए स्टोर स्टॉक समाधान.
    नोट: इस चरण में 15 एन समृद्ध एनएच 4 सीएल, 13 सी समृद्ध ग्लूकोज या अन्य स्थिर आइसोटोप लेबल व्यापारियों M9 मध्यम में शामिल किया जा सकता है अगर वांछित.
  2. हौसले से बदल BL21 (DE3) तनाव ई. से 100 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति टीका लगाना M9/Kan मध्यम में कोलाई. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 200 rpm पर मिलाते हुए के साथ आगे बढ़ें.
  3. अगली सुबह, आयुध डिपो के 600 स्टार्टर संस्कृति की जांच - यह 2 या अधिक से अधिक की सीमा में होना चाहिए. सेंट्रम पूरक M9 माध्यम के 1 एल कुल मात्रा में 100 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति पतला. दो 2 एल baffled बोतल (प्रत्येक फ्लास्क में 500 मिलीलीटर संस्कृति) में विभाजित है और 37 पर बढ़ने ° C 140 rpm पर मिलाते आयुध डिपो 600 तक 0.6 तक पहुँचता है.
  4. 18 प्रकार के बरतन तापमान सेट डिग्री सेल्सियस और 1 घंटे के लिए मिलाते हुए, संस्कृतियों प्रेरण से पहले पूरी तरह से शांत करने के लिए अनुमति जारी है.
  5. एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए एक पूर्व प्रेरण नमूना ले लो (आयुध डिपो 600 = 1 में एक संस्कृति से 50 μl के समकक्ष), तो 0.1 मिमी अंतिम एकाग्रता IPTG संलयन पेप्टाइड trpLE अभिव्यक्ति को प्रेरित जोड़ने. जारी 18 ° C/140 IPTG प्रेरण तहत रातोंरात rpm (16-20 घंटा) से बढ़ रही है.

3. समावेशन शारीरिक तैयारी और निकल मैट्रिक्स बाइंडिंग

  1. न्यूनतम मध्यम में रातोंरात अभिव्यक्ति संस्कृतियों के अंतिम 600 आयुध डिपो चर और थानेदारuld 2.5 और 5.0 के बीच हो सकता है. एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए एक नमूना ले लो (50 μl की 600 = 1 आयुध डिपो में एक संस्कृति से बराबर) और centrifugation द्वारा 5000 x छ पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा.
  2. Resuspend सेल गोली 1 50 मिलीलीटर lysis बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 20 मिमी β इ एम 0.2, NaCl) में एल संस्कृति से. सेल निलंबन को संग्रहित किया जा बाद में प्रसंस्करण के लिए जमे हुए कर सकते हैं.
  3. अधिकतम उत्पादन में 1 मिनट और 5 मिनट के लिए आराम के लिए बर्फ पर बर्फ पर sonication द्वारा कोशिकाओं lyse. हम एक आधा इंच उच्च तीव्रता बदली टिप के साथ एक Misonix 3000 Sonicator (अधिकतम उत्पादन 600 वाट) का उपयोग करें. Sonication / तीन चक्रों के लिए ठंडा दोहराएँ.
  4. Centrifugation द्वारा 20,000 XG पर 15 मिनट के लिए अघुलनशील शामिल किए जाने के शरीर सामग्री (आईबी) और लीजिए तैरनेवाला त्यागें. एक ढीला, हल्का रंग सेल मलबे की पतली परत घने आईबी गोली के शीर्ष पर दिखाई दे सकता है, यह धुल कोमल आंदोलन के साथ पानी या बफर का उपयोग किया जा सकता है. 3.3 और 3.4 कदम आईबी अंश की शुद्धता में सुधार करने के लिए दोहराया जा सकता है अगर देसीलाल. गोली और तैरनेवाला सामग्री के नमूने एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए लिया जाना चाहिए समावेश शरीर trpLE टीएम संलयन स्थानीयकरण की पुष्टि.
  5. Guanidine समाधान (6 एम guanidine एचसीएल, 50 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0, 200 मिमी NaCl, 1% ट्राइटन X-100, 5 मिमी β इ) में आईबी छर्रों भंग, संस्कृति संसाधित लीटर प्रति 25-50 मिलीलीटर का उपयोग. यह कदम आंदोलन और सामयिक हल्के sonication के साथ कई घंटे की आवश्यकता होगी.
  6. Centrifugation द्वारा 75,000-100,000 XG पर 1 घंटा और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए आईबी lysate साफ़ सतह पर तैरनेवाला और एक 0.2 सुक्ष्ममापी झिल्ली के माध्यम से फिल्टर छानना.
  7. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मंजूरी दे दी आईबी lysate, या एक बड़ा पोत है कि सुरक्षित रूप से बंद किया जा सकता निकल आत्मीयता राल कि पानी और guanidine समाधान equilibrated के साथ धोया गया है के साथ जुडा है. संस्कृति fusions है कि एक समान डिग्री व्यक्त रूप trpLE DAP12TM यहाँ दिखाया (3 चित्रा, 2 लेन) के लिए कार्रवाई की लीटर प्रति 3-4 मिलीग्राम बसे राल का उपयोग करें. कमरे टी में रातोंरात incubating द्वारा बैच बाँध कोमल मिश्रण के साथ emperature.

4. स्तंभ पर Oxidative Crosslinking

  1. झरझरा बिस्तर समर्थन के साथ एक खाली गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में आईबी राल / lysate निकल निलंबन लोड, लगातार जोड़ने जब तक पूरी मात्रा के माध्यम से बहती है. लीजिए और अलग flowthrough डाल दिया है, जो अभी भी अपार संलयन प्रोटीन शामिल हो सकता है.
  2. 5 यूरिया समाधान के बिस्तर मात्रा (8 एम यूरिया, 50 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0, 200 मिमी NaCl) साथ 5 β इ मिमी युक्त निकल राल गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से धो लें.
  3. निकल राल फिर बिना β ME-5 यूरिया समाधान के बिस्तर संस्करणों के साथ धो लें.
  4. निकल राल 5 यूरिया समाधान के बिस्तर की मात्रा कि 20 सुक्ष्ममापी CuSO 4 और 2 मिमी glutathione ऑक्सीकरण हो जाता है के साथ पूरक है के साथ एक तीसरी बार धो लें. इस धोने के बाद, स्तंभ आउटलेट बंद सेते हैं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अधिक से अधिक डाइसल्फ़ाइड बांड गठन की अनुमति.

5. TFA क्षालन और Quantitation

सामग्री "> चेतावनी: Trifluoroacetic एसिड (TFA) त्वचा और धुएं के साथ संपर्क पर गंभीर जलता का कारण बनता है बहुत परेशान कर रहे हैं केंद्रित TFA नेत्र सुरक्षा और गैर लाटेकस दस्ताने के साथ एक अनुमोदित रासायनिक धूआं हुड में ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए सभी के रासायनिक संगतता की जाँच करें. सामग्री का इस्तेमाल किया, polypropylene इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों के साथ संगत है.

  1. 10 पानी की मात्रा के साथ बिस्तर ऑक्सीकरण यूरिया समाधान धो और सूखी स्तंभ आउटलेट के लिए एक वैक्यूम लाइन को लागू करने से स्तंभ बिस्तर.
  2. स्तंभ आउटलेट और साफ TFA (99-100%) 1.5 बिस्तर संस्करणों जोड़ें. एक छोटे से भी एसिड के लिए प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए और 5 मिनट के लिए सेते हैं रंग के साथ निकल राल हिलाओ. स्तंभ आउटलेट खोलें और एसिड प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक इकट्ठा, एक सिरिंज या संपीड़ित हवा लाइन के साथ यदि आवश्यक हो तो धीरे दबाव तरल के सभी पुश करने के लिए.
  3. एक और साफ TFA के 1.5 बिस्तर संस्करणों के साथ एसिड क्षालन कदम दोहराएँ. Beade की पूरी विघटन से बचने के लिए इस कदम पर तेजी से काम करने के लिएघ agarose मैट्रिक्स. प्रोटीन उपज बीयर Lambert समीकरण और सैद्धांतिक पेप्टाइड अनुक्रम trpLE के दाढ़ विलुप्त होने गुणांक के अनुसार इस बिंदु पर निर्धारित किया जा सकता है. Trifluoroethanol में TFA (1:20 से 01:50) प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक (TFE) का एक नमूना पतला और 280 एनएम पर absorbance मापने के लिए, एक खाली के रूप में एक ही कमजोर पड़ने TFA / TFE का उपयोग कर.

6. CNBr पाचन

चेतावनी: एक विषैली गैस ब्रोमाइड (CNBr) बहुत विषैला होता है और केवल एक अनुमोदित रासायनिक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए. पीपीई सुरक्षा चश्मा, प्रयोगशाला कोट और गैर लाटेकस दस्ताने सहित बिल्कुल आवश्यक हैं. CNBr नमी के लिए प्रतिक्रियाशील है और कमरे के तापमान के लिए खोलने से पहले लाया जाना चाहिए. निराकरण / CNBr दूषित समाधान और सामग्री के निपटान पर निर्देश के लिए अपने संस्थागत सुरक्षा कार्यालय से संपर्क करें.

  1. 80% अंतिम TFA एकाग्रता पानी की dropwise इसके अलावा एसिड प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक जबकि धीरे मिश्रण पतला. यदि एक तलछट रूपों,dd वापस साफ TFA (0.5 से 1 मिलीग्राम) की एक छोटी मात्रा जब तक समाधान स्पष्ट है, तो फिर से पानी के साथ 80% करने के लिए सही है. एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए एक 5 μl पूर्व पचाने में नमूना ले लो, तरल नाइट्रोजन में ठंड और नमूना तुरंत lyophilizing.
  2. 0.2 लगभग छ / मिलीलीटर CNBr क्रिस्टल जोड़ें, देखभाल करने के लिए बंद, पूर्व तौला ट्यूबों में जहरीले रसायन सुरक्षित रूप से वजन या रासायनिक धूआं हुड के अंदर एक संतुलन का उपयोग. धीरे मिश्रण जब तक पूरी तरह से भंग है. फ्लश और अक्रिय गैस (नाइट्रोजन या argon धारा) के तहत प्रतिक्रिया पोत सील और कमरे के तापमान पर 3-4 घंटा सेते हैं, प्रकाश से संरक्षित है.
  3. एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए एक 5 μl के बाद डाइजेस्ट नमूना ले लो और स्थिर और तुरंत lyophilize. एक पुनर्जीवित सेलूलोज़ डायलिसिस या 3.5 केडीए या उससे कम की एक आणविक वजन cutoff के साथ टयूबिंग (सेलूलोज़ एसीटेट केंद्रित एसिड में भंग होगा) कैसेट पचाने में प्रतिक्रिया की उम्मीद पेप्टाइड परिसर के आकार के अनुसार, स्थानांतरण. में 4 पानी के एल रातोंरात Dialyzeरासायनिक धूआं हुड TFA एकाग्रता को कम करने के लिए और किसी भी unreacted CNBr विघटित करने के लिए. मात्रा में एक महत्वपूर्ण रातोंरात डायलिसिस के दौरान वृद्धि (के रूप में ज्यादा के रूप में तीन गुना दो) के लिए डायलिसिस या कैसेट टयूबिंग में कमरे में छोड़ दें.
  4. डायलिसिस कैसेट या टयूबिंग (प्रोटीन का सबसे पेंदी में बैठ जाना जाएगा जब TFA एकाग्रता कम है) से निलंबित तलछट के साथ dialyzed प्रतिक्रिया समाधान निकालें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब निलंबन हस्तांतरण. रुक और पानी और CNBr / TFA के निशान को दूर करने के लिए lyophilize. यह कदम कई दिनों की आवश्यकता होने की संभावना है.
    चेतावनी: दोनों dialyzed पचाने में प्रतिक्रिया और डायलिसिस पानी विषाक्त और संभाला / उचित सावधानियों के साथ निपटाया के रूप में इलाज किया जा जारी रखना चाहिए.
  5. पूर्व प्रेरण और फसल चरणों, शामिल किए जाने के शरीर तैरनेवाला और गोली, TFA प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक और CNBr से पचता सामग्री से संस्कृतियों के नमूने एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया जा सकता है. हीटिंग द्वारा नमूने 95 के लिए तैयार है ° Invitrogen NuPAGE LDS कॉम्पैक्ट में सीई बफर. TFA प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक और पचाने में नमूने दोनों को कम करने और गैर कम करने की स्थिति में तैयार किया जाना चाहिए करने के लिए उत्पाद और oxidative crosslinking की पहचान और मूल्यांकन की सुविधा.
  6. 12% NuPAGE बीआईएस tris acrylamide पूर्व डाली संदेश एसडीएस छोटी पचाने में उत्पादों की इष्टतम समाधान के लिए चल रहे बफर का उपयोग जेल पर नमूने अलग करें.

7. उलट चरण Disulfide Crosslinked पेप्टाइड परिसर HPLC शोधन

  1. Lyophilized पचाने में उत्पादों की 100 मिलीग्राम मिलीलीटर 2-3 स्वच्छ फार्मिक एसिड और एक प्रारंभिक पैमाने पर लोड (21.2 x 150 मिमी) में भंग Agilent ZORBAX SB-300 C3 विलायक में PrepHT स्तंभ (आमतौर पर 10-20% acetonitrile या 5 -10 पानी में 0.1% TFA साथ isopropanol%).
  2. विलायक बी के एक ढाल (या 0.1% TFA साथ acetonitrile isopropanol) में कम से कम 5 स्तंभ मात्रा पर पचाने में उत्पादों Elute. इष्टतम ढाल शर्तों के चयन पर सुझाव के लिए अलग पेप्टाइड दृश्यों के लिए चर्चा देखें.
  3. लेना50-100 एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और स्थिर और तुरंत lyophilize के लिए प्रत्येक HPLC अंश से μl नमूने. HPLC सॉल्वैंट्स हटाने तेजी है और 1-2 घंटे में पूरा किया जाना चाहिए.
  4. एसडीएस पृष्ठ के लिए कोई कम एजेंट के साथ 95 ° Invitrogen NuPAGE LDS नमूना बफर में सी हीटिंग द्वारा lyophilized HPLC नमूने तैयार. शांत और प्रत्येक नमूना 2 microcentrifuge ट्यूब में समान रूप से विभाजित है, और उन्हें पुनः हीटिंग संक्षिप्त 100 मिमी डीटीटी जोड़ने.
  5. 12% NuPAGE बीआईएस tris एमईएस एसडीएस बफर के रूप में ऊपर चल रहा है के साथ पूर्व डाली acrylamide जेल पर कम और गैर कम HPLC नमूने अलग करें. लघु, hydrophobic पेप्टाइड्स अक्सर नहीं ले Coomassie अच्छी तरह से दाग नहीं है और उनकी उम्मीद आणविक भार पर नहीं चला सकते हैं. हालांकि, कम और गैर कम नमूने की तुलना Crosslinked पेप्टाइड उत्पादों और पवित्रता के आकलन की पहचान की सुविधा चाहिए.
  6. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption ionization समय की उड़ान (MALDI से उम्मीदवार पेप्टाइड युक्त fractions विश्लेषणएफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चर्चा देखने के लिए) ब्याज की प्रजातियों की पहचान करने के लिए और इसकी उम्मीद जन की पुष्टि.
  7. गठबंधन, फ्रीज और HPLC शुद्ध, Crosslinked टीएम पेप्टाइड जटिल युक्त fractions lyophilize और उपज का निर्धारण करने के लिए अंतिम उत्पाद का एक सूखी वजन ले. Fractions उच्च isopropanol सामग्री के साथ जमे हुए नहीं रह सकती है. यदि पेप्टाइड fractions एक शराबी lyophilized उत्पाद के बजाय एक फिल्म करने के लिए नीचे सूखी, फिल्म पूरी तरह से शुद्ध hexafluoroisopropanol (HFIP) की एक छोटी मात्रा में, फिर से भंग स्थिर और फिर lyophilize. उत्पाद HFIP का इलाज एक छोटी सी, सफेद कोन है कि आसानी से बाहर इत्तला दे दी है और वजन होना चाहिए.

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Representative Results

अभिव्यक्ति की स्तर trpLE fusions के लिए हासिल चर और भारी संलग्न पेप्टाइड एमिनो एसिड अनुक्रम पर निर्भर चित्रा 3 है. पूर्व प्रेरण के विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ (1 लेन) और समय की फसल (2 लेन) से पता चलता है एक संस्कृति है है कि शुद्ध संस्कृति की 1 लीटर और 4 मिलीलीटर निकल मैट्रिक्स से बरकरार संलयन trpLE DAP12TM लगभग 120 मिलीग्राम झुकेंगे से नमूने. संलयन trpLE DAP12TM के शामिल किए जाने के शरीर (4 लेन) गोली के रूप में सतह पर तैरनेवाला (3 लेन) का विरोध करने के लिए स्थानीय किया गया था.

निकल शुद्ध संलयन trpLE DAP12TM के लगभग 70% थी dimeric फार्म (चित्रा 3, 5 और 6 गलियों: TFA प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक के गैर कम और कम नमूने) डाइसल्फ़ाइड Crosslinked. यह संलयन trpLE DAP12TM के लिए एक विशिष्ट परिणाम है, लेकिन crosslinking क्षमता इंजीनियर cysteines की नियुक्ति के साथ अलग अलग होंगे. DAP12TM पेप्टाइड उत्पादों को आसानी से पहचाने कुल CNBr पचाने में नमूने (7 गलियों और 8) में नहीं हैं,लेकिन बरकरार संलयन और कम पचाने में नमूना में trpLE टुकड़ा बैंड (8 लेन) की तुलना इंगित करता है कि संलयन के पाचन ~ 60% पूरा हो गया था.

चित्रा 4 एक प्रारंभिक पैमाने C3 स्तंभ (कुल बाध्यकारी ~ क्षमता प्रोटीन की 200 मिलीग्राम) का उपयोग उलट चरण HPLC द्वारा पचाने में उत्पादों की जुदाई से पता चलता है. क्योंकि विलय के खुशबूदार सामग्री कम है, हम आम तौर पर 214 के बजाय एनएम 280 एनएम पर absorbance की निगरानी. ऑक्सीकरण हो जाता है की इस दौड़ 90 मिलीग्राम, CNBr पचा संलयन trpLE DAP12TM 3 मिलीग्राम साफ चींटी एसिड में भंग कर दिया गया था और 100% विलायक A (60, 40% acetonitrile, एच 2 हे% 0.1% TFA) में स्तंभ पर लोड. बाध्य उत्पादों 0-60 60-90% 10 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर विलायक बी (75% isopropanol acetonitrile 25%, 0.1% TFA) द्वारा पीछा% की एक ढाल दो चरण में eluted थे. प्रमुख उत्पादों एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (चित्रा 5) के अनुसार प्रत्येक अंश में निहित कोड का उपयोग कर chromatogram assi ऊपर संकेत कर रहे हैंचित्रा 2 में gned. अलग पेप्टाइड दृश्यों के लिए ढाल की स्थिति के अनुकूलन पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग के में HPLC ढाल क्षालन के अनुकूलन देखें.

पेप्टाइड उत्पादों एसडीएस पृष्ठ (5 चित्रा) और MALDI-TOF (6 चित्रा) प्रमुख HPLC भिन्नों के विश्लेषण में आसानी से पहचाने जा सकते हैं. DAP12TM और पेप्टाइड्स, हमारे अनुभव में, कई अन्य hydrophobic टीएम पेप्टाइड्स, काफी कम प्रवास उनकी उम्मीद आणविक भार (3366 डाल्टन monomer और 15 एन - लेबल यहाँ दिखाया प्रजातियों के लिए 6730 डाल्टन डिमर) की तुलना में दरों के साथ चला रहे हैं. यह व्यवहार पेप्टाइड के मात्रा और स्पष्ट आणविक भार के एक continuum में जेल परिणामों पर लोड करने के लिए सीधे संबंधित है के रूप में भरी हुई राशि (नहीं दिखाया डेटा) विविध है. हालांकि, 100 मिमी डीटीटी (गलियों 7 और 8 की तुलना) के साथ कमी पर चोटी के 5 electrophoretic गतिशीलता में परिवर्तन Crosslinked पेप्टाइड के रूप में इस पहचानती हैउत्पाद. MALDI-TOF एमएस विश्लेषण 6729.2 Daltons में प्रमुख चोटी के साथ dimeric पेप्टाइड की पहचान की पुष्टि करता है और कोई अन्य प्रमुख उत्पादों (6 चित्रा) से पता चलता है. इस तैयारी से शुद्ध डाइसल्फ़ाइड Crosslinked DAP12TM पेप्टाइड homodimer के अंतिम उपज संस्कृति के प्रति लीटर 7.5 मिलीग्राम था.

चित्रा 1
चित्रा 1. डीएनए अनुक्रम trpLE - DAP12TM अपने एमिनो एसिड अनुवाद के साथ कोडिंग क्षेत्र के पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम के प्रमुख क्षेत्रों पर प्रकाश डाला और सही करने के लिए लेबल के साथ रंग कोडित. अद्वितीय आंतरिक (मेट) methionine और विषैली गैस ब्रोमाइड (CNBr) दरार और oxidative crosslinking सिस्टीन (Cys) अवशेषों सियान और बैंगनी रंग में डाला जाता है, क्रमशः. HindIII और BamHI प्रतिबंध साइटों (बोल्ड और रेखांकित) प्लाज्मिड और मा में अद्वितीय हैंy के लिए ब्याज की एक और दृश्य के साथ टीएम पेप्टाइड अनुक्रम की जगह इस्तेमाल किया जाएगा.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख. प्रोटोकॉल में प्रमुख कदम पाठ लेबल में संकेत कर रहे हैं. संलयन trpLE DAP12TM की कुंजी क्षेत्रों चित्रा 1 में रंग कोडित. Crosslinking और पचाने में चरणों का प्रमुख पॉलीपेप्टाइड उत्पादों वायुसेना लेबल कर रहे हैं और उनके वर्णन और उम्मीद आणविक भार (15 N-लेबल) के साथ यहाँ सूचीबद्ध: [एक] trpLE टुकड़ा: 13,769 Daltons, [बी] बरकरार संलयन trpLE DAP12TM: 17,118 Daltons [सी] बरकरार - trpLE DAP12TM संलयन डिमर: 34,233 Daltons, [डी] एकल cleaved trpLE DAP12TM संलयन डिमर: 20,482 Daltons; [ई] monomeric डीएP12TM पेप्टाइड: 3366 Daltons, [एफ] dimeric DAP12TM पेप्टाइड: 6730 Daltons. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. TrpLE DAP12TM अभिव्यक्ति, शुद्धि crosslinking और डाइजेस्ट कदम का विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ संस्कृति (1 लेन, पूर्व प्रेरण, 2,5 कदम, 2 लेन, फसल, 3.1 कदम) के नमूने और शामिल किए जाने के शरीर प्रस्तुत करने का नमूने (3 लेन, तैरनेवाला, लेन. 4, गोली, 3.4 कदम) 100 मिमी डीटीटी के साथ कम हो गई थी. TFA प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक और नमूना के बाद CNBr (7 गलियों और 8, 6.3 कदम), निकल स्तंभ (6.1 कदम गलियों 5 और 6) से गैर कम (एनआर) चला गया है और 100 मिमी डीटीटी (नि.) के साथ कम के रूप में पुष्टि करने के लिए संकेत दिया उत्पादों डाइसल्फ़ाइड Crosslinked. * Monomeric और dimeric पेप्टाइड उत्पादई और एफ Coomassie धुंधला हो जाना द्वारा खराब कल्पना कर रहे हैं और इसलिए इस जेल पर detectable नहीं कर रहे हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. Oxidized उलट चरण DAP12TM डाइसल्फ़ाइड Crosslinked डिमर HPLC शोधन., CNBr से पचता है और Lyophilized trpLE DAP12TM संलयन उत्पादों (90 मिलीग्राम) 3 मिलीलीटर फार्मिक एसिड (100%) में भंग किया गया और एक Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT पर भरा हुआ (21.2 x 150 मिमी) विलायक एक में स्तंभ (60% एच 2 हे, 40% acetonitrile, 0.1% TFA). 0-60% की एक ढाल दो चरण 60-90% विलायक बी (75% isopropanol acetonitrile 25%, 0.1% TFA) 10 मिलीग्राम / बाध्य उत्पादों elute मिनट का एक प्रवाह दर पर चलाया गया था. Fractions प्रवाह के माध्यम के रूप में एकत्र (एफटी) और चार प्रमुख चोटियों 214 एनएम absorbance ट्रेस से ऊपर के रूप में चिह्नित कर रहे हैं (एयू: मनमाना संयुक्त राष्ट्रइसकी) और प्रमुख प्रत्येक अंश में निहित उत्पादों चित्रा 2 में आवंटित कोड का उपयोग संकेत कर रहे हैं. वांछित DAP12TM Crosslinked उत्पाद शिखर छायांकित है.

चित्रा 5
चित्रा 5. एसडीएस पृष्ठ उलट चरण HPLC उत्पादों के विश्लेषण के प्रवाह के माध्यम से. (एफटी) और नमूने 1 शिखर गैर कम चलाए जा रहे थे. पीक 2, 3 और 4 के नमूने दोनों गैर कम (एनआर) चला गया है और डाइसल्फ़ाइड Crosslinked उत्पादों की पहचान की पुष्टि के लिए 100 मिमी डीटीटी (नि.) के साथ इलाज के द्वारा कम. प्रत्येक अंश में प्रमुख उत्पादों (उनकी चित्रा 2 में आवंटित कोड के साथ) [एफटी Pk1] थे: एक, trpLE टुकड़ा, [Pk2]: बी, बरकरार trpLE DAP12TM संलयन monomer और सी, अक्षत संलयन डिमर [PK3]: डी, एकल cleaved trpLE DAP12टीएम डिमर और ई, monomeric DAP12TM पेप्टाइड, [Pk4]: एफ, डाइसल्फ़ाइड Crosslinked DAP12TM डिमर. * के रूप में चर्चा (प्रतिनिधि reults देखें), एकाग्रता पर निर्भर गतिशीलता में एक बदलाव PK3 (एनआर और आर) और Pk4 (नि.) में कम मेगावाट उत्पादों बनाता विभिन्न आणविक भार होना दिखाई देते हैं, भले ही दोनों उत्पादों monomeric पेप्टाइड.

चित्रा 6
6 चित्रा. HPLC शुद्ध DAP12TM पेप्टाइड डिमर जन MALDI-TOF spectrometric HPLC 4 अंश (1 μl) का एक नमूना विश्लेषण (एसए) एसिड मैट्रिक्स sinapinic acetonitrile में संतृप्त समाधान के साथ 1:1 मिला था और एक पतली परत के शीर्ष पर देखा. इथेनॉल में तैयार एक संतृप्त समाधान से सूखे एसए मैट्रिक्स. MALDI-TOF विश्लेषण उम्मीद DAP12TM डिमर बड़े पैमाने पर Crosslinked पेप्टाइड में एक उत्पाद का पता चलता है6730 (6729.2098, 15 N लेबल) Daltons के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3365.7105 में एक मामूली उत्पाद, सबसे अधिक संभावना प्रजातियों डबल ionized बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

TrpLE टीएम fusions की अभिव्यक्ति. हमारे अनुभव में, trpLE टीएम fusions 37 डिग्री सेल्सियस पर खराब कर रहे हैं अमीर संस्कृति के माध्यम में व्यक्त की, और संस्कृति यहाँ वर्णित शर्तों पैदावार लेकर के साथ चार टीएम डोमेन से युक्त कई अलग अलग दृश्यों के लिए सफल साबित 50 से 150 मिलीग्राम / शुद्ध, अक्षत संलयन के एल. Fusions एन्कोडिंग तीन या चार टीएम GPCR (मानव CCR5 TM1 TM3 और TM4 TM7, क्रमशः) टुकड़े या मानव संकेत पेप्टाइड पेप्टिडेज़ (चार टीएम डोमेन, रेफरी 15 देखें) का एक प्रमुख उत्प्रेरक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व करते हैं, अभिव्यक्ति की इस श्रृंखला में सबसे कम स्तर, जबकि DAP12TM बारीकी से यहां इस्तेमाल किया रेंज (अप्रकाशित डेटा) के उच्चतम अंत का प्रतिनिधित्व अनुक्रम से संबंधित वेरिएंट. इष्टतम IPTG एकाग्रता प्रत्येक नए दृश्य के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित करना चाहिए. हमारे मानक 0.1 मिमी, और उच्च सांद्रता (1 मिमी) आम तौर पर काफी कम दोनों कम अभिव्यक्ति के स्तर के कारण उपज और कम संस्कृति घनत्व में परिणाम हैटी फसल (7 संदर्भ में उदाहरण चित्रा 1A के लिए देखें).

प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर बदलाव प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित. एक डाइसल्फ़ाइड Crosslinked टीएम पेप्टाइड परिसर, DAP12TM 8 homodimer के उत्पादन का वर्णन करता है. वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकॉल आसानी से दो धोने के लिए एजेंट को कम करने को हटाने और बाध्य उत्पादों (4.3 और 4.4) oxidize बनाया कदम omitting द्वारा monomeric पेप्टाइड्स का उत्पादन करने के लिए अनुकूल है. हम पहले से इस्तेमाल किया प्रक्रिया का एक और भिन्नता यहाँ बताया covalently स्थिर टीएम पेप्टाइड trimeric DAP12 - DAP12 NKG2C टीएम विधानसभा (8 संदर्भ और उसमें वर्णित विधियों देखें) का प्रतिनिधित्व जटिल उत्पादन. इस आवेदन में, एक 1-टीएम संलयन trpLE DAP12 और एक 2 टीएम संलयन trpLE - DAP12 - NKG2C संस्कृति फसल चरण में मिलाया गया, पहले से शामिल किए जाने के शरीर तैयारी (3.1-3.2 कदम) के लिए. प्रक्रिया एक अतिरिक्त HPLC के trpLE Crosslinked heterodimeric अलग कदमसे पहले एसिड प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक CNBr पचाने में (5.3 कदम) के विलय से उत्पाद. C3 पेप्टाइड उत्पादों की शुद्धि एक डाइसल्फ़ाइड Crosslinked DAP12TM डिमर जिसमें एक कतरा एक फ्रेम में संलयन सी टर्मिनल के रूप में NKG2C टीएम किए गए डोमेन की वसूली में हुई. डिटर्जेंट micelles समाधान में इस परिसर के एनएमआर संरचना की पुष्टि की है कि NKG2C टीएम डोमेन अपने मूल, विरोधी समानांतर अभिविन्यास 8 में DAP12 साथ इकट्ठे हुए. इस बदलाव में अतिरिक्त कदम काफी अंतिम उत्पाद की उपज कम: एक ठेठ तैयारी 4L से एक संलयन 2 की एक अतिरिक्त के साथ संयुक्त की 8-10 मिलीग्राम पेप्टाइड "trimer" की झुकेंगे. यह परिवर्तन डाइसल्फ़ाइड स्थिर दो अलग अलग टीएम दृश्यों से युक्त परिसरों का निर्माण करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए एक अच्छा प्रारंभिक प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है.

निकल संबंध शुद्धीकरण पर नोट्स सूखे निकल केंद्रित एसिड का उपयोग स्तंभ से प्रोटीन की क्षालन एक असामान्य प्रक्रिया है और फिर से उत्तरदायी नहीं हैनिकल मैट्रिक्स का उपयोग करें. अत्यंत hydrophobic trpLE टीएम imidazole या EDTA का उपयोग fusions elute प्रयास प्रोटीन का अधूरा वसूली में हुई और Crosslinked प्रजाति preferentially स्तंभ (अप्रकाशित परिणाम) पर बनाए रखा गया है. निकल मैट्रिक्स और रातोंरात बैच बाध्यकारी प्रोटोकॉल की सिफारिश की मात्रा को ध्यान से किया गया है साथ trpLE टीएम प्रोटीन मैट्रिक्स तर और इस तरह contaminants के सह - शुद्धि को कम करने के लिए अनुकूलित. हम नियमित रूप से उल्लेखनीय है कि अपने चयन करें निकल आत्मीयता मैट्रिक्स (15-20 राल मिलीग्राम / एमएल) सिग्मा के विज्ञापित बाध्यकारी क्षमता से अधिक पैदावार के साथ बहुत शुद्ध उत्पादों को ठीक. एसिड प्रोद्धावन भी मध्यवर्ती CNBr को पचाने में संक्रमण के लिए आवश्यक कदम है, और Crosslinked उत्पादों की वृद्धि की उपज से अधिक निकल मैट्रिक्स की लागत ऑफसेट समाप्त, खासकर जब एनएमआर के लिए महंगी अभिकर्मकों के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग.

विषैली गैस ब्रोमाइड पचाने में शर्तों के रिलीजCNBr में trpLE से जुड़े टीएम पेप्टाइड्स विलायक के रूप में आमतौर पर 70% फार्मिक एसिड का उपयोग किया जाता है, क्योंकि इन शर्तों के तहत दोनों प्रतिक्रिया की दर और प्रोटीन विलेयता बेहद अनुकूल हैं. हालांकि, उपचार बार अपेक्षाकृत को पचाने के लिए 1 घंटा () के तहत कम सेरीन और threonine 16,17 अवशेषों की formyl esterification से बचने रखा जाना चाहिए और संभवतः tryptophan 18 अवशेषों, संशोधनों जो प्रजाति के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री मनाया जिसका जन द्वारा detectable हैं मैं formylation 28 (एन) की उम्मीद जन के सापेक्ष Daltons है. TFA के लिए हमारी प्राथमिकता के रूप में यहाँ वर्णित इन संशोधनों को पूरी तरह से बचा जाता है. एक trpLE टीएम% 1 का उपयोग कर कारक Xa protease संलयन के enzymatic दरार ट्राइटन X 100 11 किया गया है की सूचना दी है, लेकिन सबसे trpLE टीएम fusions और डिटर्जेंट micelles में दरार साइट अप्राप्यता की जटिलता के गरीब विलेयता शायद सामान्य उपयोगिता सीमा इस दृष्टिकोण.

Pepti उलट चरण के HPLC शोधनपचाने में से CNBr डी उत्पादों इस प्रक्रिया में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है और प्रत्येक नए अनुक्रम trpLE टीएम के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है की संभावना है. निम्नलिखित टिप्पणियों कई विभिन्न दृश्यों के प्रसंस्करण से आते हैं और सबसे trpLE टीएम fusions के लिए सही पकड़ की संभावना हैं:

स्थिर चरण का चयन हम Agilent ZORBAX स्थिर बॉण्ड C3 कॉलम (300 एक ताकना आकार, 5 सुक्ष्ममापी कण आकार) को खोजने के लिए चयनात्मकता के मामले में एक बेहतर स्थिर चरण, हल शक्ति और केंद्रित एसिड के लिए भारी जोखिम के तहत स्थिरता हो. अर्द्ध प्रारंभिक (9.4 मिमी व्यास) और प्रारंभिक पैमाने आकार (21.2 मिमी व्यास) उपलब्ध हैं और हमारे हाथ में बहुत अच्छा प्रदर्शन किया. C4 diphenyl, और cyanopropyl स्थिर चरणों भी उपयोगी एक समान hydrophobicity रेंज में वैकल्पिक पेप्टाइड C3 की तुलना चयनात्मकता प्रदान कर सकता है.

के लिए स्वच्छ में पचाने में उत्पादों की HPLC के लिए तैयार करना. Lyophilized CNBr पचाने में उत्पादों का विघटनmic एसिड HPLC जुदाई के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करता है. TFA या acetonitrile Trifluoroethanol, और dimethylformamide कम विलेयता में अक्सर परिणाम के रूप में इस तरह के कार्बनिक सॉल्वैंट्स में तैयार करना, स्तंभ बाध्यकारी और / या व्यापक कई प्रजातियों युक्त चोटियों में उत्पादों की प्रोद्धावन कम. देखभाल करने के लिए स्तंभ लोड करने से पहले चींटी एसिड में उत्पादों तुरंत तैयार करने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि लंबे समय तक निवेश पेप्टाइड 16-18 sidechains formyl संशोधन में परिणाम के रूप में ऊपर चर्चा कर सकते हैं.

HPLC ढाल क्षालन के अनुकूलन हम आमतौर पर 10-20% acetonitrile या 5-10% विलायक ए TrpLE टीएम fusions और उनके उत्पादों को पचाने चींटी एसिड में भंग के रूप में 0.1% TFA के साथ पानी में isopropanol के साथ शुरू के रूप में C3 स्तंभ बाध्य होगा ज्यादा के रूप में 40% acetonitrile के रूप में यहाँ दिखाया गया (चित्रा 4). ज्यादातर मुक्त trpLE टुकड़ा के माध्यम से इन परिस्थितियों में प्रवाह (नोट कि trpLE टुकड़ा एफटी में केवल प्रोटीन उत्पाद हैअंश: चित्रा 5, 1 लेन), और हम इस अवलोकन का लाभ ले लिया है वांछित उत्पादों के लिए समग्र स्तंभ के बंधन क्षमता में वृद्धि. Acetonitrile और isopropanol ढाल सॉल्वैंट्स के रूप में बहुत प्रभावी रहे हैं, और हम अक्सर पूर्व मौजूदा विलायक समाधान मिश्रण क्षालन प्रोफाइल को संशोधित हमारे अंतिम ढाल शर्तों पर पहुंचें, कभी कभी अजीब ऐसे 75% isopropanol के रूप में लेकिन प्रभावी व्यंजनों, 25% acetonitrile, 0.1 में जिसके परिणामस्वरूप % TFA समाधान DAP12TM यहाँ दिखाया शुद्धि के लिए समाधान बी के रूप में इस्तेमाल किया. अत्यंत hydrophobic उत्पादों है कि समस्याग्रस्त थे अप करने के लिए 10% (TFE) Trifluoroethanol और TFA के ए और बी दोनों में वृद्धि हुई है (0.3%) सांद्रता (अप्रकाशित परिणाम) के अलावा के साथ acetonitrile या isopropanol का उपयोग eluted है. दूसरों को अच्छा एक C4 स्थिर 9 चरण के साथ butanol / एसिटिक एसिड चरणों मोबाइल का उपयोग कर परिणाम की सूचना दी है.

पचाने में उत्पादों के प्रमुख विश्लेषण तकनीक के दोनों विश्लेषण.यहाँ इस्तेमाल किया, एसडीएस पृष्ठ और MALDI-TOF एमएस, trpLE टीएम उत्पादों की अत्यंत hydrophobic प्रकृति द्वारा जटिल हो सकता है. / CNBr TFA पचाने में प्रतिक्रियाओं और HPLC fractions से नमूने Lyophilized विश्लेषणात्मक कभी कभी एसडीएस पृष्ठ जैल पर उच्च आणविक वजन समुच्चय के रूप में चला रहे हैं. हम HFIP और फिर से lyophilization की एक छोटी मात्रा के साथ एसडीएस पृष्ठ अक्सर इस समस्या के उपचार के लिए तैयार करने से पहले lyophilized नमूनों की कि उपचार लगता है. टीएम पेप्टाइड दृश्यों MALDI-TOF एमएस विश्लेषण के दौरान भी आसानी से नहीं योण बनाना, हो सकता है और इसलिए बहुत कमजोर संकेत दे सकते हैं. हम टीएम पेप्टाइड नमूने जिसमें इथेनॉल में sinapinic एसिड (एसए) के एक संतृप्त समाधान 1 प्लेट और मैट्रिक्स के एक समान पतली परत बनाने के लिए सूखे पर देखा है तैयार करने के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है. पेप्टाइड युक्त HPLC acetonitrile में एसए के संतृप्त समाधान के साथ 1:1 मिश्रित अंश का एक नमूना तो सूखे मैट्रिक्स परत के शीर्ष पर देखा जाता है. हमारे हाथ में, दो और छह गुना अधिक से अधिक संकेत करने के लिए शोर के बीच इस विधि पैदावार की तुलनाघ पेप्टाइड खोलना: एक साफ MALDI प्लेट पर सीधे SA मिश्रण.

डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों. समाधान एनएमआर और अन्य अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए सिस्टम में लिपिड या डिटर्जेंट टीएम पेप्टाइड परिसरों के पुनर्गठन के लिए तरीके को व्यापक रूप से भिन्न है और आमतौर पर ध्यान से प्रत्येक नई प्रणाली और आवेदन के लिए अनुरूप किया जा चाहिए. शामिल मापदंडों की एक पूरी चर्चा इसलिए अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल लेख के दायरे से परे है. सफल समाधान एनएमआर अनुप्रयोगों का उपयोग से नमूना तैयार करने के विवरण के लिए, हम में 1,19 विषय और उसमें संदर्भ पर हाल ही में इन समीक्षा के लिए पाठक संदर्भित करते हैं.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

और विक्टोरियन सरकार (MEC VESKI अभिनव फैलोशिप, ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (स्वतंत्र अनुसंधान संस्थान बुनियादी सुविधाओं का समर्थन योजना [IRIISS] WEHI अनुदान NHMRC परियोजना MEC और MJC के लिए अनुदान 1011352) के द्वारा इस कार्य के लिए अनुदान प्रदान किया जाता है; विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं WEHI के लिए सहायता). MEC ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद की महारानी एलिजाबेथ द्वितीय फैलो है. EFXB नोर्मा Hilda शूस्टर छात्रवृत्ति कार्यक्रम मेलबोर्न विश्वविद्यालय में से समर्थन मानता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanogen bromide ALDRICH P.No- C91492,CAS-506-68-3 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol SIGMA-ALDRICH P.No M7154, CAS Number 60-24-2 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SIGMA-ALDRICH Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid Merck KGaA K41186564 Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea UNIVAR, AJAX FINECHEM Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE Amresco P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100 SIGMA Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel SIGMA-ALDRICH Catalog Num- P6611 IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized SIGMA-ALDRICH Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator QSONICA S-3000 (discontinued) Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 Bio-Rad Laboratories Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size Agilent Product No: 895150-909 Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels Life Technologies NP0341BOX Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO Thermo Scientific Product No: 87724 Sample dialysis

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